与绵羊双肌臀性状相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，其位于绵羊CLPG基因如SEQ?ID?NO.1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。
【专利说明】与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与绵羊双肌臀性状 相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 自20世纪80年代末以来，中国已成为世界上绵羊、山羊饲养量、出栏量、羊肉产量 最多的国家。随着国民消费理念的变化和对羊肉营养价值的认识，羊肉的市场需求量日益 增加。然而，我国肉羊生产落后于世界先进水平，肉羊育种技术集成创新力度不足，育种的 技术水平和效率低下，致使拥有自主知识产权的优质肉羊品种匮乏，现有良种贡献率低，市 场竞争力差。
[0003] Callipyge基因是近年来备受关注的动物"双肌臀"性状的候选基因，简写为 CLPG(Cockett N E,Jackson S P,Shay T L,etal. Chromosomal localizationof the callipyge gene in sheep (Ovisaries)using bovine DNA markers[A]. Proc Natl Acad. Sci USA[C], 1994,91:3019?3023·)。具有CLPG表型的绵羊最初于1983年发现于美国，此 种绵羊肌肉特别发达，背最长肌大且通常突出于棘突之上，以致在背中线形成一凹槽结构， 后腿肌肉厚实。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其位 于绵羊CLPG基因如SEQ ID NO. 1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性 状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。
[0006] 本发明还提供用于检测所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，包括正向
[0007] 本发明还提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的 优势绵羊品种中的应用，其包括步骤：
[0008] 1)提取待测绵羊的基因组DNA ;
[0009] 2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出绵 羊CLPG基因493bp片段；
[0010] 3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232bp处的碱基为T，则待测绵羊属于 具有双肌臀性状的优势绵羊品种。
[0011] 步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μ1计为：40ng/yl模板DNA2yl， ΙΟμπιοΙ 引物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl TaqDNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反应缓冲液2. 5 μ 1，余量为ddH20。
[0012] 步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为：94°C 5分钟；94°C 40秒，55°C 30秒，72°C 50 秒，33个循环；72 °C 10分钟。
[0013] 步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶Hha I对PCR扩增 产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带（232bp和 261bp)，则待测绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带（493bp)， 则待测绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为 三条带（493bp、232bp和261bp)，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为 杂合CT型。
[0014] 本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。
[0015] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的一 种或多种。
[0016] 更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0017] 本发明进一步提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助 育种中的应用。
[0018] 本发明提供了一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链 式反应（PCR)和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多 态性（RFLP)方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的 选育，从而加快绵羊的育种进程。
[0019] 本发明具有以下优点：
[0020] (一）本发明提供的分子遗传标记不受绵羊的年龄、性别等限制，可用于绵羊的早 期选育，甚至在绵羊刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快绵羊的育种进程；
[0021] (二）可快速准确地对绵羊CLPG基因进行SNP位点检测，可以快速检测每个绵羊 个体在SNP位点的遗传变异情况，可快捷获得该引物对绵羊多态性图谱，所得结果可直观 地检测出绵羊每个个体的基因型，以期找到与该SNP位点连锁的性状，为后续与传统方法 结合进行育种工作奠定基础；
[0022] (三）进行SNP基因检测实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实 验过程中由污染可能导致的误差。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例2中对F1代绵羊样本进行PCR检测结果。
[0024] 图2为本发明实施例2中PCR-RLFP酶切检测结果。
[0025] 图3为本发明实施例2中对20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序的结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0027] 实施例1与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的获得
[0028] 1. 1澳洲白绵羊血液DNA提取
[0029] 本实施例中使用的澳洲白绵羊血样为加入抗凝剂于_20°C保存的绵羊全血，解冻 后用购自天根生化科技（北京）有限公司的血液DNA提取试剂盒从血液中提取基因组DNA， 具体步骤如下：
[0030] (1)血样置冰上融化，取300 μ 1至一高压灭菌后的离心管中，按照血液基因组DNA 提取试剂盒说明书操作。
[0031] ⑵加裂解液CL900 μ 1，颠倒或振荡混勻，室温静置5min，期间再多次颠倒混匀。 lOOOOrpm离心lmin，吸去上清液体，保留白色沉淀。若裂解不彻底，即重复操作一次。
[0032] (3)加缓冲液GS200 μ 1，彻底振荡至混匀。
[0033] (4)加 Proteinase Κ20 μ 1 溶液并混勻。
[0034] (5)加缓冲液GB200 μ 1，颠倒数次充分混勻，在56°C水浴锅中放置10min，期间应 多次颠倒混匀，直至溶液颜色彻底清亮。
[0035] (6)加无水乙醇200 μ 1，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
[0036] (7)将上一步所得溶液与絮状沉淀全部加入到一个吸附柱中，离心机12000rpm离 心30sec，吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0037] (8)向吸附柱中加入缓冲液⑶500 μ 1 (已用无水乙醇配比），12000rpm离心 30sec，吸去弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0038] (9)向吸附柱中加缓冲液PW600y 1 (已用无水乙醇配比），12000rpm离心30sec， 吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0039] (10)重复步骤9。
[0040] (11)将吸附柱12000rpm空离2min，倒掉废液。打开吸附柱上盖，室温静置5分钟， 彻底晾干，以防漂洗液残留物影响后续PCR或酶切反应。
[0041] (12)将吸附柱转入另一高压洁净的离心管中，向吸附膜中间部分悬空滴加80μ 1 洗脱液ΤΒ，室温放置5min，12000rpm离心2min。重复此操作一次，DNA即收集于离心管中。 经1 %琼脂糖凝胶电泳检测、核酸蛋白浓度测定仪检测DNA纯度后，置于-20°C冰箱保存。
[0042] 1. 2目的片段和SNP位点的获得以及PCR-RFLP分型
[0043] (1)扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0044] 根据GenBank数据库提供的绵羊CLPG基因序列（登录号：AF533009. 1)设计引物， 正向引物 F5 ' -TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3 ' 和反向引物 R5' -GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3 '，扩 增出待测SNP所在的核苷酸片段，该SNP位点位于该PCR扩增片段的232bp处，该处碱基可 以为C或T，当该处碱基为C时，可被Hha I内切酶（识别序列为CATG)识别。
[0045] 其中，PCR反应使用的扩增体系以25 μ 1计为：40ng/y 1模板DNA2 μ 1，10 μ mol引 物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl Taq DNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反应缓冲 液2. 5 μ 1，余量为ddH20。
[0046] PCR反应使用的扩增程序为：94°C 5分钟；94°C 40秒，55°C 30秒，72°C 50秒，33个 循环；72 °C 10分钟。
[0047] (2)针对第232位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP
[0048] 该PCR产物用Hha I内切酶酶切，反应体系以25 μ 1计为：20000U/ml酶 Hha I 0. 8μ1，酶切缓冲液3yl，PCR扩增产物4μ1，(ΜΗ2017. 2μ1。37°C水浴锅中过夜酶 切。用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型。
[0049] 3、基因型判定及关联分析
[0050] 根据PCR-RFLP的结果判定该位点在检测群体中的基因型。若为检测结果为两 条带（232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果 仅为一条带（493bp)，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因 型为纯和TT型；检测结果为三条带（493bp、232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于具有 双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。即，该位点可分为3种基因型：TT:493， CT:493/232/261，CC:232/261。
[0051] 实施例1绵羊不同基因型与双肌臀性状的关联分析及检测应用
[0052] 包括：1、准备阶段；2、DNA检测；3、检测结果分析。具体步骤如下：
[0053] 1、准备阶段
[0054] 1. 1采集78只澳洲白绵羊和173只杜泊羊的F1代杂种绵羊血液样本，用购自天根 生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂盒提取绵羊血液中的DNA。
[0055] 1. 2根据SNP标记位于绵羊CLPG基因上的位置，设计并合成引物，引物序列如下： 正向引物 F5 ' -TGAAAACGTGAACCCAGAAGC-3 ' 和反向引物 R5' -GGCAGGAGAGACGGTTAAT-3'，扩 增产物片段大小为498bp。
[0056] 2、DNA 检测
[0057] 2. 1PCR 扩增
[0058] 采用普通PCR扩增方法，反应体系以25μ 1计为：40ng/y 1模板DNA2y 1，10μπιο1 引物 F 和 R各 lyl，2.5mmol dNTPs2yl，5U/yl Taq DNA聚合酶 0.5yl，10XPCR 反应缓 冲液2. 5μ 1，余量为ddH20。
[0059] 反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性40s，55°C复性30s，72°C延伸50s，33个循 环；72°C延伸lOmin。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统拍照，与DNA Marker 比较。
[0060] 2. 2PCR-RLFP 检测
[0061] 用购自BioLabs公司的限制性内切酶Hha I对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应 体系为25μ1，包括：20000U/ml酶Hha I 0·8μ1，酶切缓冲液3yl，PCR扩增产物4μ1， ddH2017. 2μ 1。37°C水浴锅中过夜酶切。用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像 系统拍照，根据带型判断基因型。
[0062] 3、PCR产物及PCR-RFLP酶切检测结果
[0063] 3. 1PCR产物检测
[0064] 对173个F1代绵羊样本进行PCR检测，成功获得493bp (SEQ ID NO. 1)的扩增产 物，如图1所示。
[0065] 3. 2PCR-RLFP 酶切检测
[0066] 用限制性内切酶Hha I对PCR产物进行酶切。若为检测结果为两条带（232bp 和261bp)，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带 (493bp)，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT 型；检测结果为三条带（493bp、232bp和261bp)，则待测F1代绵羊属于具有双肌臀性状的 优势品种，且基因型为杂合CT型。酶切结果如图2所示。
[0067] 选取20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序，结果如图3所示。
[0068] 对本实验中发现的突变位点为GCTGAGAG[C - T]GCAGGAA的SNP位点进行验证。从 纯种杜泊羊和澳洲白羊群中挑选10只含有[C - T]突变Callipyge基因⑴的父本，和 不含突变的200只野生型等位基因（C)母本杜泊羊和澳洲白，杂交后获得F1代，杂合绵羊 (CT)在6月龄时体重明显高于TT型和CC型。且6月龄背膘厚低于TT型和CC型（表1)。 [0069] 表1杂交试验结果验证
[0070]
【权利要求】
1. 一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于绵羊CLPG基因如SEQ ID NO. 1所示序列的232bp处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊 无双肌臀性状。
2. 用于检测权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，其特征在于，包
3. 权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的优势绵 羊品种中的应用，其包括步骤： 1) 提取待测绵羊的基因组DNA ; 2) 以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩 增出大小为493bp的绵羊CLPG基因片段； 3) 检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232bp处的碱基为T，则待测绵羊属于具有 双肌臀性状的优势绵羊品种。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以 25μ 1 计为：40ng/y 1 模板 DNA2y 1，ΙΟμ--οΙ 引物 F 和 R各 1 μ 1，2· 5mmol dNTPs2y 1，5U/ μ 1 Taq DNA聚合酶0· 5 μ 1，10 X PCR反应缓冲液2· 5 μ 1，余量为ddH20。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为： 94°C 5 分钟；94°C 40 秒，55°C 30 秒，72°C 50 秒，33 个循环；72°C 10 分钟。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP 法，具体为：用内切酶Hha I对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测，如果检测结果为两条带，则待测绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果 仅为一条带，则待测绵羊属于携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检 测结果为三条带，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。
7. 含有权利要求2所述引物的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10. 权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助育种中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104120123SQ201410314791
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】杜立新, 魏彩虹, 张莉, 赵福平, 陈华 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所