一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株基因工程菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter?cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC?NO：M2014186。本发明还公开了所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。实验证明本发明菌株具有明显利用秸秆水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，为工业上规模化开发利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。
【专利说明】-株基因工程菌及其在生产（2R, 3R)-2, 3- 丁二醇中的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株基因工程菌及其在生产（2R，3R)-2, 3-丁二醇中的应用，尤其涉 及一株基因工程阴沟肠杆菌及其在利用木质纤维素水解液生产（2R，3R)-2, 3- 丁二醇中的 应用。
【背景技术】
[0002] 2, 3- 丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域（Syu M J.，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2001，55, 10-18)。2, 3- 丁二醇在常温下是一种无色无味的液体， 有三种同分异构体：meso-2, 3- 丁二醇、（2R，3R)-2, 3- 丁二醇和（2S，3S)-2, 3- 丁二醇；其 中旋光性的（2R，3R)-2, 3- 丁二醇在手性化合物的不对称合成中有着重要作用，而且能够 作为防冻剂使用（Celinska and Grajek, Biotechnol. Adv. 2009, 27, 715 - 725)。
[0003] 木质纤维素由于其可替代性和可循环性，被认为是利用微生物生产化学品的理想 原料（Ji et al.，Biotechnol. Adv. 2011，29, 351 - 364)。因此，近年来关于利用源自木质 纤维素的糖类生产2, 3- 丁二醇的生物技术得到广泛关注（Wang et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87, 965 - 970)。木质纤维素水解液中主要含有葡萄糖和木糖，由于葡萄 糖的存在会抑制2, 3- 丁二醇生产微生物对木糖的利用，往往会降低木质纤维素水解液原 料的利用效率，从而造成2, 3- 丁二醇生产成本的提高。已有报道通过表达环磷酸腺苷受体 蛋白（CRP)突变蛋白实现木糖和葡萄糖的同时利用来生产2, 3-丁二醇（Ji et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011,89, 1119 - 1125)，但由于产量和生产强度较低，无法满足工 业生产需求。
[0004] 目前报道的众多生产2, 3-丁二醇的野生菌株中，仅多粘类芽孢杆菌产生光学纯 的（2R，3R)-2, 3- 丁二醇，该菌株以葡萄糖为碳源，补料分批发酵能够产生111. 0克/升 的（21?，31〇-2,3-丁二醇，纯度达到98%，为目前报道（21?，31〇-2,3-丁二醇的最高产量，但 其需要高浓度的有机氮源（1~1邱1(^6七31.，8丨〇代8〇111'.了6(*11〇1.2012，124,237 - 244)，增 加了生产成本。在生产（2R，3R)-2, 3-丁二醇基因工程菌方面，大肠杆菌工程菌能够利用 葡萄糖产 9. 5 克 / 升的（2R，3R)-2, 3-丁二醇，产量较低（81^116七&1.，1111(1^(^〇1^〇1· Biotechnol. 2012, 39, 1725 - 1729);而酿酒酵母能够补料分批发酵利用葡萄糖和半乳糖产 生100. 0克/升的（2R，3R) -2, 3-丁二醇，纯度达到98%，其生产强度仅为0. 33g/ [L h] (Lian et al.，Metab. Eng. 2014, 23, 92 - 99)。并且上述菌株由于木糖利用能力较弱，不能有效的利 用木质纤维素水解液生产（2R，3R)-2,3-丁二醇。
[0005] 基于此，迫切需要寻找更好的方法，以实现利用木质纤维素水解液来进行 (2R，3R)-2, 3- 丁二醇的高效生产。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术中，菌株利用木质纤维素水解液困难，（2R，3R)_2, 3-丁二醇的 产量低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一株可利用木质纤维素水解 液生产（2R，3R)-2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其在生产（2R，3R)-2, 3- 丁二醇中的应用。
[0007] 本发明所述的基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)SDM09,其已于2014年5月7日保藏于"中国典型培养物保藏中 心"（中国·武汉·武汉大学），保藏号为：CCTCC NO :M2014186。
[0008] 上述基因工程菌阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09为革兰氏阴性菌，需 氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为30 ± 1 °C，可以在含有50毫克/升硫酸卡那霉素 的LB培养基上生长。
[0009] 上述基因工程菌阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09由以如下方法构建。
[0010] 在阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230中，利用基于同源重组 的pK-bdh质粒，敲除E. cloacae SDM CGMCC No. 4230中的bdh基因，得到的重组菌命名为菌 株阴沟肠杆菌SDM01 ;利用PCR扩增得到短小芽孢杆菌的（2R，3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因 bpbdh和E. cloacae SDM CGMCC No. 4230中的Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建 pET-Pb-bpbdh，其中Pb-bpbdh的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；为了消除碳代谢阻遏，利 用pK-ptsG质粒，敲除阴沟肠杆菌SDM01中的ptsG基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌 SDM03 ;利用PCR扩增得到E. cloacae SDM CGMCC No. 4230中的半乳糖透性酶基因 galP和 Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建pET-Pb-galP，其中Pb-galP的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2所示，进一步通过重组pCR和酶切连接，得到同时表达bpbdh基因和galP基因 的pETPb-bpbdh-PbgalP质粒，其中Pb-bpbdh-PbgalP的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所不；利 用pK-frdA和pK-ldhA敲除阴沟肠杆菌SDM03中的frdA和ldhA基因，得到的重组菌命名 为阴沟肠杆菌SDM06 ;将pETPb-bpbdh-PbgalP质粒电转化入阴沟肠杆菌SDM06中，得到的 重组菌命名为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09。
[0011] 本发明所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产（2R，3R)-2, 3-丁二醇中的 应用。
[0012] 选阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09CCTCC NO :M2014186,对其进行活化。
[0013] 在无菌条件下，取活化好的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09CCTCC NO : M2014186菌液，以体积比为5?10%的接种量接种到发酵培养基中，在温度30±1°C， pH6. 0?8. 0、搅拌转速100?500rpm、通气量0. 5?2. 5vvm条件下培养36?72小时，其 间，待检测培养基中葡萄糖的浓度降至20克/升以下时，补加木质纤维素水解液至培养基 中葡萄糖的浓度为20?50克/升，当检测发酵液中（2R，3R) -2, 3- 丁二醇的浓度不再增加 时，发酵结束，分离出培养液，按常规方式提取（2R，3R)-2, 3-丁二醇；
[0014] 其中，上述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克，无水乙酸钠5 克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2. 4克，氯化钾1克，七水硫酸镁0. 5克，金属离子母液溶液10 毫升，0. 9% CaCl2溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含：七水硫酸亚铁 2. 25克，七水硫酸锌0. 75克，一水硫酸锰0. 38克。
[0015] 上述应用中：所述pH范围优选6.0?7.0。
[0016] 上述应用中：所述搅拌转速优选300?450rpm。
[0017] 上述应用中：所述通气量优选1. 0?2. Ovvm。
[0018] 上述应用中：所述阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09CCTCC NO :M2014186 菌液的活化方法是：
[0019] (1)平板培养：将基因工程菌阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO :M2014186菌株划线到含有质量体积比为1. 5?1. 8%琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡 纳霉素的LB培养基平板上，30±1°C培养12±2小时；
[0020] (2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然 后接种到含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，30土 1°C摇床 震荡培养 12±2 小时，得到阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09CCTCC NO :M2014186 的活化菌液；
[0021] 其中，上述步骤（1)中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：酵母粉5克，蛋 白胨10克，氯化钠10克，121°c灭菌15分钟。
[0022] 上述应用中，底物葡萄糖的检测方法是：样品进行设定的稀释后，采用生物传感分 析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所）测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜 专一性测定葡萄糖含量。
[0023] 上述应用中，发酵产物（2R，3R) -2, 3- 丁二醇的检测方法是：
[0024] 每500毫升乙酸乙酯中加入0. 7毫升异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对发 酵液中发酵产物样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡30秒钟，然后静 置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：
[0025] 所用气相色谱仪的型号为Agilent6820,氮气作为载气，进样器和检测器的温度均 设为280°C，检测过程的柱温设定为：40°C保持3分钟；然后以每分钟1. 5°C的速率升温到 80°C ;以每分钟0. 5°C的速率升温到86°C ;以每分钟30°C的速率升温到200°C。进样量1. 5 微升，进行气相检测。
[0026] 本发明对一株高产2, 3- 丁二醇混合物的阴沟肠杆菌进行工程改造，成功实现了 将其具有利用木质纤维素水解液高产（2R，3R)_2, 3-丁二醇的能力，并以此重组菌株即阴 沟肠杆菌SDM09发酵秸杆水解液获得高产（2R，3R) -2, 3- 丁二醇，为工业上规模化开发利用 木质纤维素水解液生产（2R，3R)-2, 3- 丁二醇提供基础。
[0027] 本发明具有的突出特点是：
[0028] (1)该工程菌株阴沟肠杆菌SDM09,可同时利用木质纤维素中的木糖和葡萄糖，原 料的利用率大大提1?。
[0029] (2)本发明方法构建的工程菌株生产（2R，3R)-2, 3-丁二醇，培养基的营养组成简 单、生产成本低。
[0030] (3)本发明的工程菌能发酵秸杆水解液生产（2R，3R)_2, 3- 丁二醇，最高产量可达 至IJ 152克/升以上，纯度大于97%。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图 1 载体 pETPb-bpbdh-PbgalP 构建过程。
[0032] 图2阴沟肠杆菌SDM09发酵秸杆水解液生产（2R，3R)-2,3_ 丁二醇过程曲线。·， 葡萄糖；，生物量；▲，木糖；?，（2R，3R)-2,3-丁二醇；▼，乙偶姻。
[0033] 图3阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。
[0034] 其中：A :标准品气相色谱图，B :阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。
[0036] 实施例1 :生产（2R，3R) -2, 3- 丁二醇阴沟肠杆菌工程菌的构建
[0037] 1.敲除 2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 bdh(GenBank: 13167657)
[0038] 米用常规的方法制备阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230的 基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小 量制备的方法；使用合成的引物Kbdhl-f和Kbdhl-r从上述基因组DNA中PCR扩增得到 2, 3- 丁二醇合成基因的前段；使用合成的引物Kbdh2-f和Kbdh2-r从上述基因组中PCR扩 增得到2, 3- 丁二醇合成基因的后段；利用酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的pKR6K 质粒进行连接重组转化至大肠杆菌S17-1中，得到的菌株命名为大肠杆菌pK-bdh。
[0039] 扩增重组引物设计如下：
[0040] Kbdhl-f: 5，-AAAGAATTCCCAGGTGATGATCTCCAAC 携带一个 EcoRI 位点
[0041] Kbdhl-r: 5' -TATAAGCTTCAAAACCATCTTTCACCAGG 携带一个 HindllI 位点
[0042] Kbdh2-f: 5' -TTAAAGCTTGGAGATTGACCGTCAGGTGT 携带一个 HindllI 位点
[0043] Kbdh2-r: 5' -ATTTGGATCCATAGAGGTGTTTACTTTCCG 携带一个 BamHI 位点。
[0044] 1)培养需要敲除的目的菌阴沟肠杆菌SDM CGMCC No. 4230与携带敲除质粒的大肠 杆菌pK-bdh，同时生长到0D62tol0. 5。将1毫升目的菌培养物离心，生理盐水洗两遍；将5毫 升大肠杆菌培养物离心，生理盐水洗两遍。
[0045] 2)将上述目的菌与大肠杆菌pK-bdh的菌体一共用100微升生理盐水重悬，将重悬 液全部滴在LB平板（无任何抗性）中间，平板正面放置，过夜培养。
[0046] 3)将上述平板中的菌落用生理盐水和刮刀刮下，生理盐水洗两遍，进行适当稀释 (一般是1(Γ 2或1(Γ3)，涂布M9+柠檬酸盐+Kana平板（阴沟肠杆菌SDM GMCC No. 4230可利 用柠檬酸盐为唯一碳源，质粒和基因组进行了单交换的目的菌，可在M9+柠檬酸盐+Kana平 板生长；未发生单交换的目的菌，无法在Kana平板生长；带有质粒的大肠杆菌，无法在柠檬 酸盐平板生长），过夜培养。
[0047] 4)挑取生长的单菌落，利用上下游引物进行PCR验证，单交换的目的菌，可同时 PCR出长片段（原始基因）和短片段（构建的上下游同源臂）。
[0048] 5)将正确的单交换目的菌，接种至LB摇管（无任何抗性），过夜培养。
[0049] 6)将上述培养液转接至含10%蔗糖的LB摇管中培养两代，适当稀释（一般是ΚΓ6 或ΚΓ7)，涂布LB+12%蔗糖平板，过夜培养。
[0050] 7)挑取生长的单菌，利用上下游引物进行PCR验证，双交换的目的菌，能PCR出 短片段（构建的上下游同源臂），挑选正确的双交换菌，进行表型验证，得到正确的敲除菌 E. cloacae SDM Λ bdh，命名为阴沟肠杆菌SDM01。
[0051] M9培养基配方为：1升蒸馏水中含：氯化钠0. 5克，氯化铵1克，磷酸氢二钾3克， 磷酸氢二钠3克，七水硫酸镁0. 246克，柠檬酸三钠10克。
[0052] 2.过表达（2R，3R) -2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 bpbdh
[0053] 1)采用常规的方法制备菌株B. pumilus LN146的基因组DNA，该过程可参考科学 出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取B. pumilus LN146的基因组DNA ;使用合成的引物Bp-f和Bp-r从B. pumilus LN146基因组DNA中PCR 扩增得到（2R，3R) -2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 bpbdh。使用合成的引物Pb-f和Pb-r从实施例 1中E. cloacae SDMCGMCCNo. 4230基因组中PCR扩增得到Pb启动子，利用重组PCR进行重 组得到Pb-bpbdh片段。
[0054] 扩增重组引物设计如下：
[0055] Pb-f: 5 ' -AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA 携带一个 BamHI 位点
[0056] Pb-r: 5 ' -TGCCAGCGTAGTGCTTTCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA
[0057] Bp-f: 5，-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGAAAGCACTACGCTGGCA
[0058] Bp-r: 5 ' -AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA 携带一个 XhoI 位点。
[0059] 上述Pb-bpbdh片段的DNA序列长度为1143个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0060] 2)将重组后的Pb-bpbdh片段与pET28a进行BamHI和Xhol的双酶切和连接，得到 pETPb-bpbdh 质粒。
[0061] 3)利用含有0. 7毫摩尔每升EDTA的LB培养基培养阴沟肠杆菌SDM01到0D62Qnm0. 5。 将30毫升目的菌培养物离心，超纯水洗两遍，并用300微升的超纯水重悬，得到阴沟肠杆菌 SDM01的感受态细胞。然后再2000伏，200欧姆，20微法拉条件下，将质粒pETPb-bpbdh电 转化至阴沟肠杆菌SDM01，涂Kana抗性LB平板，挑取的转化子，然后提质粒酶切验证，得到 正确的转化子E. cloacae SDMAbdh/pETPb-bpbdh，命名为阴沟肠杆菌SDM02
[0062] 实施例2 :解除葡萄糖效应E. cloacae工程菌的构建
[0063] 按照实施例1中的基因敲除方法，在阴沟肠杆菌SDM01的基础上进行ptsG基因的 敲除，得到 E. cloacae SDM Δ bdh Δ ptsG。
[0064] 1.敲除葡萄糖磷酸转移酶基因 ptsG(GenBank: 13169500)
[0065] 以实施例 1 中提取的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230 的 基因组DNA为模板；使用合成的引物KptsGl-f和KptsGl-r从E. cloacae SDM基因组DNA 中PCR扩增得到ptsG的前段。使用合成的引物KptsG2-f和KptsG2-r从E. cloacae SDM基 因组中PCR扩增得到ptsG合成基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基因缺失 中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重 组转化大肠杆菌S17-1，得到大肠杆菌S17-lpK-ptsG。该菌株用于阴沟肠杆菌SDM01中的 PtsG基因敲除，具体操作条件同实施例1，其中扩增重组引物设计如下：
[0066] KptsGl-f: 5' -AAAGGATCCATGTTTAAGAATGCATTTGCT 携带一个 BamHI 位点
[0067] KptsGl-r: 5，-CAGAATCGCGTGGATAACGTATCACACCCGTGAAAATCGC
[0068] KptsG2-f: 5，-GCGATTTTCACGGGTGTGAT ACGTTATCCACGCGATTCTG
[0069] KptsG2-r: 5' -GTTGAATTCTTAGCTGTTGCGGATGTATTCATCCAT 携带一个 EcoRI 位点。
[0070] 得到的阴沟肠杆菌E. cloacae SDMAbdhAptsG命名为阴沟肠杆菌SDM03。
[0071] 2.重组表达半乳糖透性酶基因 galP
[0072] 1)以实施例 1 中提取的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230 的基因组DNA为模板，使用合成的引物从E. cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到galP 合成基因。与Pb (2, 3- 丁二醇合成启动子，来源于E. cloacae SDM)进行重组得到Pb-galP 片段，并利用BamHI和Hindlll酶切连接至pET28a，得到pETPb-galP。
[0073] 扩增重组引物设计如下：
[0074] Pb-f: 5? -AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA.携带一个 BamHI 位点
[0075] Pg-r: 5 ' -TGTTTATTATTGTCAGGCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA
[0076] G-f: 5，-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGCCTGACAATAATAAACA
[0077] G-r: 5' -TTTAAGCTTTTAGTCGTGTGCGCCGATTT 携带一个 Hindlll 位点
[0078] 上述Pb-galP片段的DNA序列长度为1500个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2 所示。
[0079] 2)利用引物G-B-f和G-B-r，以pETPb-galP为模板PCR扩增得到Pb-galP的DNA 片段，利用引物B-G-f和Bp-r，以pETPb-bpbdh为模板PCR扩增得到Pb-bpbdh。使用重组 PCR将Pb-galP和Pb-bpbdh重组到一起，然后Ncol/Xhol双酶切，和表达载体pET28a连接， 得到重组质粒 pETPb-bpbdh-PbgalP。
[0080] G-B-f: 5，-TAAGAAGGAGATATACCATGGATCTAAA 携带一个 NcoI 位点
[0081] G-B-r: 5，-TGAGACGTTTTAGATTTAGTCGTGTGCGCC
[0082] B-G-f: 5，-GGCGCACACGACTAAATCTAAAACGTCTCA
[0083] Bp-r: 5 ' -AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA 携带一个 XhoI 位点。
[0084] 上述Pb-bpbdh-PbgalP片段的DNA序列长度为2643个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3 所示。
[0085] 将所得的重组质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转进入阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌SDM03 中，得到 E. cloacae SDM Λ bdh Λ ptsG/pETPb-bpbdh-PbgalP，将其命名为阴沟肠杆菌 SDM04。
[0086] 实施例3 :敲除副产物代谢途径E. cloacae工程菌的构建
[0087] 1.敲除乳酸脱氧酶基因 ldhA(GenBank: 13166930)
[0088] 以实施例 1 中提取的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230 的 基因组DNA为模板，使用合成的引物K1 dhA 1 -f和K1 dhA 1 -r从E. c 1 oacae SDM基因组DNA中 PCR扩增得到ldhA基因的前段。使用合成的引物KldhA2-f和KldhA2-r从E. cloacae SDM 基因组中PCR扩增得到ldhA基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基因缺失中 间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和Smal进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重组 转化。
[0089] 扩增重组引物设计如下：
[0090] KldhAl-f: 5, -GCTGAATTCATCGATGAGCCCCGCGTTAA 携带一个 EcoRI 位点
[0091] KldhAl-r: 5，-GCTGAAGGTGGTTGGGGGTTGATTGACTCTCAG
[0092] KldhA2-f: 5，-AGAGTCAATCAACCCCGAACCACCTTCAGCCCCA
[0093] KldhA2-r: 5' -GCTACCCGGGTATCCTGATTTAGCGAGAGA 携带一个 Smal 位点。
[0094] 按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E. cloacae SDM03的基础上进行双 亲杂交双交换得到E. cloacae SDM Λ bdh Λ ptsG Λ ldhA，将其命名为阴沟肠杆菌SDM05。
[0095] 2.敲除琥拍酸脱氢酶基因 frdA(GenBank: 13168818)
[0096] 以实施例 1 中提取的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM CGMCC No. 4230 的 基因组DNA为模板，使用合成的引物KfrdAl-f和KfrdAl-r从阴沟肠杆菌E. cloacae SDM 基因组DNA中PCR扩增得到frdA基因的前段。使用合成的引物KfrdA2-f和KfrdA2-r从 阴沟肠杆菌E. cloacae SDM基因组中PCR扩增得到frdA基因的后段，利用重组PCR进行重 组，使重组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和Smal进行双酶切的 PKR6K质粒进行连接重组转化。
[0097] 扩增重组引物设计如下：
[0098] KfrdAl-f: 5，-CCGAATTCGTGCAAACTTTTCAAGCCGA 携带一个 EcoRI 位点
[0099] KfrdAl-r: 5 ' -GACGTCAGTGACCGTCATCGACCAGAAT
[0100] KfrdA2-f: 5，-CGGTCACTGACGTCGAGAAACGACTGAA
[0101] KfrdA2-r:5, -TTTCCCGGGTCAGCCATTCGCCTTCTCCT 携带一个 Smal 位点。
[0102] 按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E. cloacae SDM05的基础上进行双 亲杂交双交换得到阴沟肠杆菌E. cloacae SDM Λ bdh Λ ptsG Λ ldhA Λ frdA，将其命名为阴沟 肠杆菌SDM06。
[0103] 将实施例2构建好的质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转到E. cloacae SDM06中，即得 到最终目的工程菌株 E. cloacae SDM Δ bdh Δ ptsG Δ ldhA Δ frdA/pETPb-bpbdh-PbgalP，命 名为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09。
[0104] 上述得到的工程菌阴沟肠杆菌（E. cloacae) SDM09已于2014年5月7日保藏于中 国典型培养物保藏中心（武汉大学，中国武汉），保藏中心编号为：CCTCCN0:M2014186。
[0105] 上述重组阴沟肠杆菌（E. cloacae)SDM09CCTCC NO :M2014186为革兰氏阴性菌，需 氧或兼性厌氧生长，可以用于发酵生产（2R，3R)-2, 3- 丁二醇。
[0106] 上述重组阴沟肠杆菌（E. cloacae) SDM09CCTCC NO :M2014186的较佳培养温度为 30 ±1°C，可以在含有50毫克/升硫酸卡纳霉素的LB培养基上生长。
[0107] 实施例4 :制备阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09菌株的细胞液体培养物
[0108] 1、平板培养：将实施例3中所得阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09划线 到含有质量体积比为1. 5%琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB平板上，30°C培养 12小时；
[0109] 2、种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然后 接种到5毫升的含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培养基中，30°C摇床震荡培养12小 时；
[0110] 3、摇瓶：在无菌条件下，取步骤⑵所培养的菌液以体积比1?3%的接种量，接 种到30?150毫升含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中， 30±1°C摇床震荡培养12±1小时，即获得阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09菌株 的细胞液体培养物；
[0111] 其中，上述步骤1中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：蛋白胨10克，酵母 粉5克，氯化钠10克，121°C灭菌15分钟。
[0112] 实施例5 :阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09工程菌以葡萄糖和木糖为碳 源发酵生产（2R，3R) -2, 3- 丁二醇
[0113] 将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09菌株的 细胞液体培养物，以体积比为5%的接种量接种到含有60克/升葡萄糖、20克/升木糖和 50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30°C、pH6. 5、300rpm、l. 5vvm通气量条件下发 酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000Xg离心10分钟，检测上清中（2R，3R)-2, 3-丁 二醇和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加比例为3:1的葡萄糖和木糖干粉混合物，使葡 萄糖浓度维持在20?50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中（2R，3R) -2, 3- 丁 二醇的浓度，当（2R，3R) -2, 3- 丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。
[0114] 其中，上述步骤中所述的发酵培养基1配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克， 乙酸钠5克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2. 4克，氯化钾1克，硫酸镁0. 5克，金属离子母液溶 液10毫升，〇. 9% CaCl2溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含：七水硫酸 亚铁2. 25克，七水硫酸锌0. 75克，一水硫酸锰0. 38克。
[0115] 44小时后检测结果显示：（2R，3R)-2, 3-丁二醇的浓度为152克/升。
[0116] 实施例6 :阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09工程菌以結杆水解液为碳源 发酵生产（2R，3R)-2,3-丁二醇
[0117] 将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09菌株 的细胞液体培养物，以体积比为5 %的接种量接种到含有550克/升总糖（葡萄糖和木糖 比例为3 :1)的秸杆水解液和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30°C、pH7. 0、 450rpm、2. Ovvm通气量条件下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8, OOOXg离心10 分钟，检测上清中（2R，3R)-2, 3- 丁二醇和葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度补加浓缩的秸杆 水解液，使葡萄糖浓度维持在20?50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中 (2R，3R)-2, 3- 丁二醇的浓度，当（2R，3R)-2, 3- 丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。
[0118] 51小时后检测结果显示：（2R，3R)-2, 3-丁二醇的浓度为119. 4克/升。
[0119] 实施例7 :阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09工程菌以葡萄糖为碳源发酵 生产（2R，3R) -2, 3- 丁二醇
[0120] 将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae) SDM09菌株的 细胞液体培养物，以体积比为5%的接种量接种到含有80克/升葡萄糖和50毫克/升硫 酸卡那霉素的发酵培养基中，在30°C、pH6. 0、400rpm、l. Ovvm通气量条件下发酵。发酵中每 隔3小时取样，样品以8, 000 X g离心10分钟，检测上清中（2R，3R) -2, 3- 丁二醇和葡萄糖 的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20?50克/升；对上清进 行气相色谱分析测定发酵液中（21?，31〇-2,3-丁二醇的浓度，当（21?，31〇-2,3-丁二醇的浓 度不再增加时，停止发酵。
[0121] 52小时后检测结果显示：（2R，3R)-2, 3- 丁二醇的浓度达到155. 0克/升。
[0001] 序列表 <110〉山东大学 <120〉一株基因丄程菌及其在生产(2K，3K)-2, 3-丁二醇中的应用 〈141> 2014-06-9 <160> 3 <170> Patelitln Version 3. 5 <210〉 1 <211〉 1143 <212> DNA <213〉短小芽孢杆菌LN146 <221〉短小芽孢杆菌（2R，3R) -2, 3-丁二醇脱氢酶基因及Pb启动子（Pb-bpi>办片段） <222〉 （1)…（1143) <400>1 atctaaaacg tctcaaacca gcatggattc tatattggaa, ctctctgctg aatcgggtca, 60 acatttattt aacctttcta aataaagttg aagaggacga gcatgaaagc actacgctgg 120 cacgatcaaa aggacattcg actagaggaa attgacgaac caacagttgc tccaggaaaa 180 gtgaaactga aagtaaaatg gtgcggcatt tgtggtagtg atttacatga atatttaggc 240 gggccgatct tcattcctgt gaacgaacct catccactta caaaagaaaa agcacccatt 300 acactgggac acgagttctc tggtgaaatt gtagaagttg gagaaggcgt gagtaattac 360 aaagtaggcg atcgagtggt tgttgaacct atttttgcaa ctcacgggca ccaaggtgct 420 tacaacttag atgaaaacat gggcttctta ggacttgctg gtgggggcgg aggattctct 480 gaatatgtat ctgtcgatga agaattactt catttgttac cagacgaaat ttcatatgag 540 caaggtgcac ttgttgaacc ttctgcagtt gctttatatg cggttcgttc tagtaaagtg 600 caagctgggg atacagcagc tgtgtttggc tgtggaccaa tcggtttact tgtcattgaa 660 gcattaaaag cagctggtgc tactgacatt tatgcagtgg aattatcaaa agagcgccaa 720 gaaaaagcaa aagaacttgg agcgatcatt gtagatcctt ctcagtatga agatgttgtt 780 caagaaattg cacgccgcac aaatggtgga gtcgatgttt cttttgaagt, gacaggtgta 840 cctgttgtat tgaagcaagc aatccaatca actagaattt caggtgaaac agtcattgta 900 agcatttggg aaaaaggcgc agaaattatg ccgaatgaca ttgtcattaa agaacgtaca 960 gtcaaaggaa tcatcggcta cagagatgtt ttcccatctg tattaaactt aatgagaaaa 1020 ggctatttct ctgcagacac actcgtcacg aagaaaatca agttggacga tgtgatcgaa 1080 gatggtttcc atgcattaat caatgaaaaa gatcaagtga aaattttagt tagtgctgaa 1140 taa 1143
[0002] <210〉 2 <211> 1500 <212〉 DNA 〈213>阴沟肠杆囷 <221〉阴沟肠杆菌半乳糖透性酶基因及Pb启动子（Pb-ga/P片段） <222〉 （1)…（1500) <400>2 atctaaaacg tctcaaacca gcatggattc tatattggaa ctctctgctg aatcgggtca 60 acatttattt aacctttcta aataaagttg aagaggacga gcatgcctga caataataaa 120 caggggcgta cgtccaacaa ggcgatgaca ttcttcgtct gcttccttgc cgccctggca 180 ggattactct ttggcctaga tatcggcgtg attgccggcg cccttccctt tatcgcagac 240 gaattccaga ttaacgcaca tacccaggaa tgggtggtca gctccatgat gttcggtgcg 300 gccgtcgggg ccgtcggcag cggctggctc tctttcaaac tgggacgtaa aaagagcctg 360 atgattggcg cgatcctctt cgtcgccggt tccctcttct ctgccgccgc ccctaacgtt 420 gaagtgctta tcctgtcccg tgtgctgttg gggctggccg taggcgtcgc gtcttatacc 480 gcgccgcttt acctgtcaga aatcgcgccg gagaaaatcc gcggcagtat gatttcgatg 540 taccagctga tgatcaccat cgggattttg ggcgcttacc tgtccgatac cgcctttagc 600 tacagcggcg catggcgctg gatgctgggt gtgatcatca ttccggccat tctgctgctg 660 attggcgtct tcttcctgcc ggacagcccg cgctggtttg ccgccaagcg ccgtttcgtc 720 gatgccgaac gcgtgctgct gcgtctgcgt gataccagtg cggaagctaa aaacgagctg 780 gaagagatcc gcgaaagcct gaaggtgaaa cagtctggct gggcgctgtt caaagagaac 840 agcaacttcc gtcgggcggt cttcctcggc gtgctgctgc aggtgatgca acagttcacc 900 gggatgaacg tcatcatgta ttacgcgcca aaaatctttg agctggcggg gtataccaat 960 accaccgagc agatgtgggg caccgtgatc gtggggctga ccaacgtgct ggcgaccttc 1020 atcgccatcg gtctggtcga ccgctgggga cgtaagccaa cgctgaccct gggcttcctg 1080 gtgatggccg ccggtatggg gatcctcggt acgatgatgc acatgggcat tcactcccca 1140 accgcgcagt acctggcggt aggtatgctg ctgatgttta tcgtcgggtt tgcaatgagt 1200 gccggcccgc tgatttgggt gctgtgctct gaaatccagc cgctgaaagg acgtgatttc 1260 ggtatcacct gctctaccgc gaccaactgg attgccaata tgatcgtcgg tgccacgttc 1320 ctgaccatgc tcaacacgct gggcaatgcg aacaccttct gggtctacgc cggtctgaac 1380 ctgttcttta ttgttctcac cgtctggctg gttcctgaaa ccaaacacgt ttcactggaa 1440 cacattgaac gtaacctgat gaaaggtcgt ccgctgcgcg aaatcggcgc acacgactaa 1500
[0003] <210〉 3 <211> 2643 <212〉 DNA <213〉阴沟肠杆菌和短小芽孢杆菌 <221〉阴沟肠杆菌半乳糖透性酶基因，短小芽孢杆菌（2R，3R) -2, 3-丁二醇脱氢酶基因 及卜Μ〕V丨动子（Pb-bpMA-Pbga//5) <222〉 （1)…（2643) <400>3 atctaaaacg tctcaaacca gcatggattc tatattggaa ctctctgctg aatcgggtca 60 acatttattt aacctttcta aataaagttg aagaggacga gcatgcctga caataataaa 120 caggggcgta cgtccaacaa ggcgatgaca ttcttcgtct gcttccttgc cgccctggca 180 ggattactct ttggcctaga tatcggcgtg attgccggcg cccttccctt tatcgcagac 240 gaattccaga ttaacgcaca tacccaggaa tgggtggtca gctccatgat gttcggtgcg 300 gccgtcgggg ccgtcggcag cggctggctc tctttcaaac tgggacgtaa aaagagcctg 360 atgattggcg cgatcctctt cgtcgccggt tccctcttct ctgccgccgc ccctaacgtt 420 gaagtgctta tcctgtcccg tgtgctgttg gggctggccg taggcgtcgc gtcttatacc 480 gcgccgcttt acctgtcaga aatcgcgccg gagaaaatcc gcggcagtat gatttcgatg 540 taccagctga tgatcaccat cgggattttg ggcgcttacc tgtccgatac cgcctttagc 600 tacagcggcg catggcgctg gatgctgggt gtgatcatca ttccggccat tctgctgctg 660 attggcgtct tcttcctgcc ggacagcccg cgctggtttg ccgccaagcg ccgtttcgtc 720 gatgccgaac gcgtgct.gct gcgtctgcgt gataccagtg cggaagctaa aaacgagctg 780 gaagagatcc gcgaaagcct gaaggtgaaa cagtctggct gggcgctgtt caaagagaac 840 agcaacttcc gtcgggcggt cttcctcggc gtgctgctgc aggtgatgca acagttcacc 900 gggatgaacg tcatcatgta ttacgcgcca aaaatctttg agctggcggg gtataccaat 960 accaccgagc agatgtgggg caccgtgatc gtggggctga ccaacgtgct ggcgaccttc 1020 atcgccatcg gtctggtcga ccgctgggga cgtaagccaa cgctgaccct gggcttcctg 1080 gtgatggccg ccggtatggg gatcctcggt acgatgatgc acatgggcat tcactcccca 1140 accgcgcagt acctggcggt aggtatgctg ctgatgttta tcgtcgggtt tgcaatgagt 1200 gccggcccgc tgatttgggt gctgtgctct gaaatccagc cgctgaaagg acgtgatttc 1260 ggtatcacct gctctaccgc gaccaactgg attgccaata tgatcgtcgg tgccacgttc 1320 ctgaccatgc tcaacacgct gggcaatgcg aacaccttct gggtctacgc cggtctgaac 1380 ctgttcttta ttgttctcac cgtctggctg gttcctgaaa ccaaacacgt ttcactggaa 1440
[0004] cacattgaac gtaacctgat gaaaggtcgt ccgctgcgcg aaatcggcgc acacgactaa 1500 atctaaaacg tctcaaacca gcatggattc tatattggaa. ctctctgctg aatcgggtca 1560 acatttattt aacctttcta aataaagttg aagaggacga. gcatgaaagc actacgctgg 1620 cacgatcaaa aggacattcg actagaggaa attgacgaac caacagttgc tccaggaaaa 1680 gtgaaactga aagtaaaatg gtgcggcatt tgtggtagtg atttacatga atatttaggc 1740 gggccgatct tcattcctgt gaacgaacct catccactta caaaagaaaa agcacccatt 1800 acactgggac acgagttctc tggtgaaatt gtagaagttg gagaaggcgt gagtaattac 1860 aaagtaggcg atcgagtggt tgttgaacct atttttgcaa ctcacgggca ccaaggtgct 1920 tacaacttag atgaaaacat gggcttctta ggact.tgct.g gt.gggggcgg aggattctct 1980 gaatatgtat, ctgtcgatga agaattactt catttgttac cagacgaaat ttcatatgag 2040 caaggtgcac ttgttgaacc ttctgcagtt gctttatatg cggttcgttc tagtaaagtg 2100 caagctgggg atacagcagc tgtgtttggc tgtggaccaa tcggtttact tgtcattgaa 2160 gcattaaaag cagctggtgc tactgacatt tatgcagtgg aattatcaaa agagcgccaa 2220 gaaaaagcaa aagaacttgg agcgatcatt gtagatcctt ctcagtatga agatgttgtt 2280 caagaaattg cacgccgcac aaatggtgga gtcgatgttt cttttgaagt gacaggtgta 2340 cctgttgtat tgaagcaagc aatccaatca actagaattt caggtgaaac agtcattgta 2400 agcatttggg aaaaaggcgc agaaattatg ccgaatgaca ttgtcattaa agaacgtaca 2460 gtcaaaggaa tcatcggcta cagagatgtt ttcccatct.g tattaaactt. aat.gagaaaa 2520 ggctatttct, ctgcagacac actcgtcacg aagaaaatca agttggacga tgt.gatcgaa 2580 gatggtttcc atgcattaat caatgaaaaa gatcaagtga aaattttagt tagtgctgaa 2640 taa 2643
【权利要求】
1. 一株基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名 为阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae)SDM09,其已于2014年5月7日保藏于"中国典型培 养物保藏中心"，保藏号为：CCTCCNO :M2014186。
2. 权利要求1所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产（2R，3R)-2, 3-丁二醇中 的应用。
【文档编号】C12P7/18GK104046586SQ201410314730
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】马翠卿, 李理想, 高超, 许平 申请人:山东大学, 上海交通大学