防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）XGY13-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC?NO.8973。将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30℃180rpm摇床振荡培养10h，获得种子液，将种子液以1%（v/v）的接种量接种于发酵培养基，于30℃180rpm摇床振荡培养8-9d，制备得到生防菌剂，稀释20-100倍后在西瓜种植时浸种处理，或者在移栽时进行灌根处理，对西瓜枯萎病的防效在62.36%。同时，该菌剂还有促生功能。
【专利说明】防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种防治西瓜枯萎病的生防菌株及其应用，属于植物保护【技术领域】， 专用于西瓜枯萎病的生物防治。
【背景技术】
[0002] 西瓜枯萎病是由尖抱鎌刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporum schlechlendahl f. sp. melons (Leach at currence) snyder et Hansen 侵染导致的维管束系统病害，是一种 世界性土传病害，为西瓜的主要病害之一，自1894年在美国南卡罗来纳州首次发现以来， 目前在世界各个西瓜产区、在西瓜生长的任何时间都有发生，严重威胁着西瓜的安全生产。
[0003] 西瓜枯萎病自幼苗至成株均可发生，以座瓜期和瓜膨大后期发病最重。幼苗受害， 出苗前可造成烂种；出土后发病，子叶、真叶呈失水状萎蔫，茎基部变褐收缩呈猝倒状，拔出 瓜苗可见根部黄褐色腐烂。成株期受害，初期病株下部叶片呈失水状萎蔫，似水烫状，茎蔓 基部向上褪绿。最初萎蔫在中午尤为明显，但早晚可恢复，3-6d后整株叶片枯萎下垂，不能 复原，后期病部呈棕褐色，发软，常纵裂，有胶状物溢出，俗称吐"红水"。在潮湿条件下病株 基部布满白色至粉红色霉状物，即病原的分生孢子，剖视茎基部至根部，可见维管束变黄褐 色。病根根系变暗褐色并腐烂，极易拔起，严重时瓜秧枯死，但叶片不脱落。
[0004] 温度高、湿度大是发生病害的原因之一。病菌在24-32°C和高湿条件下侵染力强， [0005] 发病快，连阴2d以上、降雨量大及土壤粘重、地势低洼、排水不良、管理粗放的连 作地块均有此病发生。肥料配比不合理是引起发病的另一个主要原因。底肥不足，氮肥过 量，磷、钾肥不足，使用未腐熟好的带病菌的有机肥，地下害虫危害严重等都可以导致西瓜 枯萎病的发生。西瓜枯萎病发生轻重与轮作年限直接相关，轮作年限越短，发病越重；轮作 年限越长，发病越轻。连作地死株率高，往往造成改种或毁种。
[0006] 镰刀菌以菌丝和厚垣孢子在土壤或未腐熟的带菌肥料中越冬，一般分布在0-25 cm 土层内，成为翌年发病的初侵染源，种子也可带菌。该菌侵染寄主植物根系的温度为 5-35°C，最适温度为23-28°C。病菌侵染通过胚根侵染发芽的种子，通过植株根部自然伤口 或从根毛顶端细胞间侵入，或通过线虫等侵染伤口及其它机械损伤传入，最终进入维管束。 菌丝体和分生孢子在植株体内分布广泛，且以下胚轴和子叶节中的数量最多，导管周围的 薄壁细胞中有时也有菌丝存在，但无分生孢子。该菌可使皮层腐烂，子叶和嫩叶褪绿，在胚 轴上出现水浸状软腐环带，使成株叶片萎蔫，任何生育阶段都可发生枯萎病，西瓜开花期和 结果期最为明显。
[0007] 在无寄主情况下，病菌仍可在土中存活6年以上，有时甚至超过10年，更有甚者菌 核和厚垣孢子通过家畜消化系统后仍具有生活能力。而在水田中1-2年后基本上失去活 性。土壤含水量为70%的壤土最适于病原菌生存；含水量为40%时，土壤质地对病菌存活 率无明显影响。在病害严重的地块，许多作物如香附子、畔茅、再生稻、花生及番茄等都成为 病原菌的寄生场所；自然重病田连续3年种植非寄主植物如大葱、大蒜、辣椒、茄子、玉米及 大豆等均能减少病原菌数量。
[0008] 目前对西瓜枯萎病的防治主要采用南瓜砧木嫁接的方法，这种方法严重影响到西 瓜的口感，降低西瓜品质。针对西瓜枯萎病分布广、危害严重、难以防治以及化学农药的种 种弊病和研制化学农药历时长、花费大的现实，迫切需要开发并商业化生产用于防治西瓜 枯萎病的生物农药。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术中没有对西瓜枯萎病有较高防效的生防制剂的现状，提供开发一种 防治西瓜枯萎病的单一生防菌菌株及其应用，该菌剂对这种重要土传病害的防效可以达到 60%以上。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0011] 一种防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)XGY13-l，已于2014年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号 为 CGMCC N0. 8973。
[0012] 所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用。
[0013] 将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30°C 180rpm摇 床振荡培养l〇h，获得种子液，将种子液以1% (v/v)的接种量接种于发酵培养基，于 30°C 180rpm摇床振荡培养8-9d，制备得到生防菌剂，稀释20?100倍后浸种或者灌根使 用。在西瓜种植前浸种使用至少半小时，或者在移栽时以每亩9升进行灌根处理。
[0014] 所述的生防菌剂中活菌总浓度为1 X 109?1 X 101(lCFU/mL。
[0015] 所述LB液体培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，调 pH7. 0-7. 2。
[0016] 所述的发酵液为：黄豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氢二钾0. 5g/L、7水硫酸镁 0. 2g/L、酵母膏：0. 4g/L、氯化钠 5g/L。
[0017] 有益效果：
[0018] 本发明是专门针对西瓜枯萎病开发的生防制剂。本发明有利于西瓜的无公害生 产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，节省农民开支。本发明可省掉砧木的使用， 改善西瓜风味，提高西瓜品质，促进农民增收。同时，该菌剂还有促生功能（表2)。
[0019] 温室实验表明：该菌制剂能显著降低西瓜枯萎病的发生。该菌剂可以稀释100倍 后在西瓜种植时浸种处理幼苗，或者在移栽时灌根处理。在温室条件下对于西瓜枯萎病的 防效可以达到62. 36% (表1)。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1防治西瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法
[0021] 防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)XGY13-l，为 2013年在江苏南京病田土壤中分离得到，筛选过程如下：
[0022] 于2013年5月，在江苏省南京市溧水区西瓜枯萎病发病严重的地块采集样品。采 用五点采样法，每点间隔至少l〇m。每点收集三株健康植株的根围土，带回实验室进行分离。
[0023] 称取根围土 3g，分别加入到27mL灭菌水中（含灭菌玻璃珠），180rmp摇床振荡 0· 5h，静置5min，得到ΚΓ1稀释液，吸取上清液0· lmL依次稀释，分别取10_4 -10_6三个梯 度0. lmL涂LB平板，28°C培养48h，选取菌落数在50300之间的平板，计数并且挑取所 有菌落，纯化，_70°C，40%甘油保存备用。
[0024] 用LB平板活化分离纯化的菌株，牙签挑取处于生长盛期的菌落点于含西瓜枯萎 病原菌的YGPA平板上，每板5点，间距相等，30°C培养48h，观察并且记录结果，分别量取颉 颃菌内径以及额颃圈外径。根据内外径之差划分为三个等级1 一3mm, 3一6mm, 6mm以上。培 养基LB :酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，调pH7. 0-7. 2。
[0025] 按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以 及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分最高较高菌株，通过温室试验最终筛选出防 治效果最好的XGY13-1。
[0026] 实施例2菌株鉴定
[0027] 防治西瓜枯萎病的生防菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)XGY13_l为革兰 氏阳性杆菌，单个细胞0.7?0.8X2?3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽 孢0. 6?0. 9X 1. 0?1. 5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨 大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在LB液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧 菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
[0028] 实施例3 XGY13-1生防菌剂的制备
[0029] LB液体培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，调pH7. 0-7. 2。
[0030] 发酵液为：黄豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氢二钾0. 5g/L、7水硫酸镁0. 2g/L、 酵母膏：0.4g/L、氯化钠5g/L。
[0031] 将分离出的XGY13-1单菌落挑至于LB液体培养基，30°C 180rpm摇床振荡培养 l〇h，获得种子液。将种子液以1%的接种量接种于上述发酵培养基，于30°C 180rpm摇床振 荡培养8-9d，菌剂成品中活菌总浓度为1 X 109-1 X 101(lCFU/mL。
[0032] 实施例4温室盆钵试验检测XGY13-1生防菌剂对西瓜枯萎病的防效
[0033] 移栽之前，用实施例3制备的生防菌剂XGY13-1 (稀释至107CFU/mL)浸种处理幼 苗30min ;移栽时采用20mL107CFU/mL菌剂灌根处理，移栽一周后接种107CFU/mL西瓜枯萎 病菌[Fusarium oxysporum schlechlendahl f. sp. melons (Leach at currence) snyder et Hansen],孢子悬液20mL。另外不用生防菌XGY13-1处理，直接接种西瓜枯萎病菌孢子 悬液作为对照处理。每个处理组24株，三次重复。在温度25?28°C，相对湿度40%，光照 12h/12h条件下，培养4周后调查病级数，计算病害严重度和防效，结果见表1。
[0034] 按照Kempe和Sequerial983年提出的病害分级标准，病害严重度和防效的计算公 式如下：
[0035] DI0,无发病；
[0036] DI1，< 25%的叶片萎蔫；
[0037] DI2,25 - 50% 的叶片萎蔫；
[0038] DI3,50 - 75% 的叶片萎蔫；
[0039] DI4, 75 - 100% 的叶片萎蔫（Kempe and Sequeria, 1983)。
[0040]
【权利要求】
1. 一种防治西瓜枯萎病的生防菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌 sMii/is) XGY13-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏 号为 CGMCC NO. 8973。
2. 权利要求1所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用。
3. 根据权利要求2所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其 特征在于：将防治西瓜枯萎病的生防菌株单菌落挑至于LB液体培养基，30°C 180 rpm摇床 振荡培养l〇h，获得种子液，将种子液以1% (v/v)的接种量接种于发酵培养基，于30°C 180 rpm摇床振荡培养8-9d，制备得到生防菌剂，稀释后浸种或者灌根使用。
4. 根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其 特征在于：所述的生防菌剂中活菌总浓度为1X 10, X 101° CFU/mL。
5. 根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其 特征在于：所述的发酵液为：黄豆粉l〇g/L、玉米粉75g/L、磷酸氢二钾0. 5g/L、7水硫酸镁 0. 2g/L、酵母膏：0. 4g/L、氯化钠 5g/L。
6. 根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用， 其特征在于：所述LB液体培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，调pH 7. 0-7. 2。
7. 根据权利要求3所述的防治西瓜枯萎病的生防菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其 特征在于：所述稀释倍数为20-100倍。
【文档编号】C12N1/20GK104087542SQ201410340374
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】张磊, 晏枫霞, 韩先旭, 卢魏魏 申请人:南京新果园生态农业科技有限公司