一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于兽用微生物添加剂制备技术应用领域，具体涉及一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用。本发明从禽源分离筛选的对养殖动物常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)HDRaBS1，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏编号为CCTCC?NO：M2011034。生物功能验证表明该菌株具有抗逆性强和抗应激等特点，可用于制备抗畜禽应激的微生物制剂，其中的制剂包括畜禽饲用微生物添加剂。本发明还公开了该枯草芽孢杆菌HDRaBS1的分离鉴定方法及其在畜禽用单菌剂制备中的应用。
【专利说明】一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用微生物添加剂制备【技术领域】，具体涉及一株缓解畜禽应激的枯草 芽孢杆菌选育及应用，本发明涉及一株益生枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)菌株的分 离鉴定及其作为制备缓解畜禽应激的饲料添加剂的应用。
【背景技术】
[0002] 随着科学技术的发展，抗生素以抗病、促生长的功能在畜牧生产业得以广泛应用， 给养殖业带来的利益毋庸置疑。不过近些来，抗生素的滥用给养殖业及人类带来了危害也 开始凸显：诸如导致动物免疫机能低下、动物内源性感染和大量耐药菌株的产生，并且耐药 菌的耐药基因可向人类致病菌和食源性病原菌转移，从而对畜产品及至人类健康产生严重 的影响（石现瑞等2000)。因此，饲用抗生素添加剂的禁用已是国际趋势。
[0003] 由于现代集约化养殖方式的推广，使得因生产环境、饲养管理、运输及病原菌的感 染等因素引起的应激时常发生。因此，饲养畜禽因应激而导致的疾病就十分常见。然而，在 众多应激因素中，环境温度是最重要的因素之一。我国是受全球气候变暖影响最显著的国 家之一，故因高温引起畜禽的应激问题就显得尤为重要。而本发明考虑到禽类由于体温高、 代谢旺盛、皮肤无汗腺、羽毛丰厚等生理特征，遭受高温影响较突出，故选蛋鸡为应用载体。 目前许多研究表明：高温显著降低家禽的产蛋数，同时显著影响家禽肉、蛋品质（Nardone et al2010)。刘陆军等（2010)表明蛋鸡适宜的外界温度是18?24°C，当温度在25?30°C 时，环境温度每升高1°C，产蛋率下降1.5% ;温度高于30°C时，下降更为明显。St-Pierre 等（2003)估计美国每年由于热应激造成的家禽生产损失超过1亿美元。由于我国华东、华 南、华中以及西南的四川等地区夏季平均气温普遍较高，而这些地区禽蛋产量占全国总产 蛋量的61. 2%，产量高达1678. 2万吨（中国农业年鉴2010)，而气温升高时鸡易产生热应 激反应，导致生产性能下降，甚至热休克死亡，已对我国禽蛋业造成巨大的经济损失。
[0004] 基于以上事实，本专利申请拟以蛋鸡热应激为一个出发点，寻找一种无毒、无残 留、应用效果好的饲料添加剂来缓解畜禽的应激。2010年，农业部发布了新公告，明确规定 用于养殖动物的饲用微生物添加剂的种类有34种，而枯草芽孢杆菌位列其中。
[0005] 芽胞杆菌现已被广泛应用医药及饲料行业，但作为其使用及推广仍存在一定的问 题。问题的关键是：益生菌的选育大多是通过体外试验完成的，这与在动物体内复杂的真实 情况来评估益生菌的效果有所差异。因此，本发明根据菌株的特性选择合适的添加剂量，在 动物试验基础上结合现代分子生物学技术，建立一套完善的评估方法，为该菌株的推广应 用提供科学支撑。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于选育一株具有较好抑菌效果的动物源性枯草芽孢杆菌菌株，将 其用于缓解畜禽应激，减少由于畜禽应激造成的经济损失。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 本发明根据枯草芽孢杆菌的生理生化及遗传学特性，结合现代分子生物学技术， 从家禽直肠内容物中，选育出一株禽源枯草芽孢杆菌， 申请人:将其命名为枯草芽孢杆菌 HDRaBSIBacillus subtilis HDRaBSl，于2011年1月24日送交中国.武汉.武汉大学中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC N0:M2011034。
[0009] 枯草芽孢杆菌HDRaBSl的菌学特征：
[0010] 该菌株为革兰氏阳性菌，在LB培养基上菌落呈现典型芽胞的菌落特性：白色，边 缘不整齐，菌落中间形成明显皱褶。经革兰氏染色镜检观察，细菌在12h时呈长杆状，单个、 成对或链状排列，24h时已明显形成芽胞。菌株能耐受2-8% NaCl、pH2. 0的生长环境；可 在37°C生长、90°C耐受15min、厌氧环境下不生长、硝酸盐试验为阳性，能水解葡萄糖、阿拉 伯糖等，说明该菌株在表型上初步鉴定为枯草芽孢杆菌；并进一步对其16SrRNA基因进行 克隆测序，结果在NCBI进行BLAST比较，发现其16SrRNA与枯草芽孢杆菌（⑶258545. 1)的 序列同源性最高，相似性为99% (见序列表SEQ ID N0 :1)。另外，从该菌基因组中扩增出 枯草芽孢杆菌特异性片段rp〇A(256bp)。该菌株对常见肠道致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆 菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果，能产生芽胞，抗逆性强。
[0011] 申请人:将该枯草芽孢杆菌HDRaBSl进行缓解畜禽应激试验，以蛋鸡热应激为切入 点，通过蛋鸡的生产性能、血液指标、热休克蛋白的测定、优势菌群分析和肠道屏障功能等 综合评价，证实该菌株具有较强的抗应激作用。
[0012] 根据上述枯草芽孢杆菌HDRaBSl进行缓解畜禽应激实验的作用，该菌株可以作为 制备缓解畜禽应激的单菌剂应用，其中的应用包括在饲料添加剂中的应用。
[0013] 本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有如下优点：
[0014] (1)本发明分离的枯草芽孢杆菌HDRaBSl菌株来源于家禽肠道，从大量候选菌株 中分离和筛选得到，对常见肠道致病菌（例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌）具有 明显的抑菌效果，该菌株能产生芽胞，抗逆性强。
[0015] (2)该菌株能显著提高蛋鸡的生产性能、显著增强抗体效价，且降低IL-1和内毒 素含量，能有效缓解畜禽的应激。
[0016] 更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 序列表SEQ ID N0 :1是本发明分离株枯草芽孢杆菌HDRaBSl的16SrDNA基因部分 序列。图1是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌HDRaBSl在LB琼脂平板上的生长状态：图中 显示为白色且圆形菌落，边缘不整齐，菌落中间形成明显皱褶。
[0018] 图2 :是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌菌株HDRaBSl在12、24h革兰氏染色结果 (X 1000)，其中图2A是12h革兰氏染色结果，图2B是24h革兰氏染色结果。
[0019] 图3 :是分离的枯草芽孢杆菌菌株HDRaBS116SrRNA基因PCR扩增检测结果。图中 标记说明：M:DL2000DNA分子量标准；泳道1-3为本发明的菌株HDRaBSl :泳道4为阴性对 照。
[0020] 图4 :是rpoA基因PCR扩增检测结果。图中标记说明：M:DL2000DNA分子量标准泳 道1为本发明的菌株HDRaBSl :泳道2为地衣芽胞杆菌：泳道3为凝结芽胞杆菌：泳道4为 蜡样芽胞杆菌：泳道5为大肠杆菌：泳道6为屎肠球菌：泳道7为阴性对照。
[0021] 图5 :是本发明菌株HDRaBSl发酵上清液对常见肠道致病菌的体外抑菌性试验。图 中标记说明：A-对金黄色葡萄球菌的体外抑菌性试验；B-对大肠杆菌的体外抑菌性试验； C-对沙门氏菌的体外抑菌性试验。
[0022] 图6 :是本发明菌株HDRaBSl在0、10、20d时对热应激蛋鸡回肠绒毛结构的影响。 图6A为0d时；图6B为10d时；图6C为20d时，本发明菌株对热应激蛋鸡回肠绒毛结构的 影响。
[0023] 图7 :是本发明菌株在0、10、20d时对热应激蛋鸡盲肠绒毛结构的影响。其中：图 7A为0d、图7B为10d时；图7C为20d时本发明菌株对热应激蛋鸡盲肠绒毛结构的影响。 具体实施方案
[0024] 实施例1 :菌株的分离和鉴定
[0025] 一、菌株的分离
[0026] 采集湖北省某鸡场鸡的直肠内容物0. 5g于50ml无菌水中，80°C水浴处理15min， 选取合适稀释倍数的菌液涂布LB培养基，37 °C培养24h后挑取典型芽胞菌落在LB平板上 划线纯培养，从大量候选菌株中分离出一株菌落呈圆形、白色或微带黄色、边缘不整齐、叶 状不透明、菌落中间形成明显皱褶的菌株。经革兰氏染色镜检观察，革兰氏阳性菌，12h呈 长杆状，单个、成对或链状排列；24h时已形成芽胞，芽胞中生或近中生，将该菌株命名为 HDRaBSl,纯培养菌株，均传代保存。该菌株在LB琼脂培养基上的生长特性见图1，革兰氏染 色特性见图2-A、2-B。
[0027] 二、生理生化试验初步鉴定
[0028] 通过生理生化试验对该菌株进行鉴定。将鉴定结果（见表1)与常用的《伯杰细菌 鉴定手册》（第8版）和《常见细菌系统鉴定手册》对芽胞杆菌属间鉴别描述的比对，初步 判定该菌株HDRaBSl为枯草芽孢杆菌。
[0029] 相关鉴定结果如表1。
[0030] 表1枯草芽孢杆菌株HDRaBSl生化鉴定结果
[0031]
【权利要求】
1. 一株来自禽源的对畜禽应激具有缓解作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) HDRaBSl，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCC N0:M2011034。
2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HDRaBSl，其特征在于所述 的菌株包括对致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌具有抑菌作用。
3. 保藏号为 CCTCC N0:M2011034 的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HDRaBSl 在制 备对畜禽应激缓解作用的微生物制剂单菌剂中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其中包括在制备蛋鸡饲料添加剂中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104099280SQ201410340289
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】王喜亮, 张盼望, 肖运才, 周祖涛, 石德时, 晏涛, 毕丁仁, 况世昌, 吴贝, 金秀娥 申请人:湖北华大瑞尔科技有限公司, 华中农业大学, 武汉华大瑞尔科技有限公司