一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片及其制备方法，该检测检疫性实蝇的基因芯片采用Corning氨基化修饰基片，此基片为玻璃基片，表面已修饰有氨基活性基团；其上固定有用于检测危险性实蝇的寡核苷酸探针，40bp，所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行杂交反应；基片尺寸为25mm×75mm。本发明基因芯片可以准确的鉴定多达31种危险性实蝇的，本发明基因芯片能简单快速地得到结果。
【专利说明】一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 实媚科Tephritidae，广泛分布于热带和温带地区，仅仅在高寒和高炜度地区没被 发现。实蝇科的大部分种类为植食性，这其中又大多以水果和蔬菜作物作为寄主植物，许多 实蝇种类都是果蔬生产的重要害虫。这些危险性实蝇类害虫主要集中在果实蝇属，寡鬃实 蝇属，按实蝇属，小条实蝇属和绕实蝇属中，这五个属被认为是实蝇科中最具有经济意义的 类群。实蝇类害虫不仅直接造成作物产量和质量的损失，增加防治成本，而且由于检疫法规 的存在，还会导致出口市场的丢失，进而产生连锁反应形成更大的经济损失。鉴于此，实蝇 类害虫在许多国家都被列为重要检疫对象。
[0003] 由于实蝇类害虫的幼虫均在果实内取食为害，幼虫老熟后出果化蛹，隐蔽性很强。 如果检疫措施不力，实蝇类害虫极易随果蔬调运和携带传播危害，所以检验检疫在实蝇类 害虫的防治中有着举足轻重的地位。由于检疫过程中通常检到的是实蝇的幼虫，幼虫特 征不明显且分类系统并不完善，按照传统的检疫方法，只能饲养至成虫鉴定，远远不能满 足日益增长的口岸贸易对快速检疫的要求。近年来，包括同工酶电泳，核酸序列分析以及 PCR-RFLP等在内的许多分子生物学技术被用到口岸检疫和鉴定上，大大提高了口岸检疫的 速度和效率。但是这些分子检测方法只是针对一种或几种实蝇种类的鉴定检测方法，而日 益繁忙的口岸检疫往往要求检疫方法尽可能集成化，自动化和低成本化。而基因芯片的高 通量，高自动化和低成本的特点正好符合这些要求。所以将基因芯片技术运用于口岸检疫 过程当中无疑会大大提高口岸检疫和鉴定的效率，有利于控制包括实蝇类害虫在内的其它 有害生物的入侵和扩散。本发明在充分利用丰富的实蝇类害虫基因序列资源的基础上，通 过探针源序列的确定-探针序列的寻找-探针质量检测-探针特异性检验-确定探针的技 术路线来设计31种危险性实蝇类害虫的基因检测芯片上的探针。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种危险性实蝇类害虫基因 检测芯片及其制备方法。其具体技术方案为：一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片，该 检测检疫性实蝇的基因芯片采用Corning氨基化修饰基片，此基片为玻璃基片，表面已 修饰有氨基活性基团。其上固定有用于检测危险性实蝇的寡核苷酸探针（约40bp)，所 述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行杂交反应；基片尺寸为25ηιπιΧ75πιιη。所述寡核 苷酸探针组含选自表1中的至少一种寡核苷酸探针序列，所述危险性实蝇为：印加按实 绳Anastrepha distincta、墨西哥按实绳A. ludens、暗色实绳A. serpentina、中美按实 蝇 A. striata、南亚果实蝇 Bactrocera tau、瓜实蝇 B. cucurbitae、桃实蝇 B. zonata、 蒲桃实蝇B. albistrigata、艳实蝇B. calophylli、桔小实幡B. dorsalis、普通果实绳 Β· caudata、番石權实蝇B. correcta、油橄榄实蝇B. oleae、黄瓜果实蝇B. cucumis、大洋 洲实蝇B. curvipennis、日本南瓜实绳B. depressa、平展实蝇B. expandens、单带果实蝇 Β· frauenfeldi、扎维斯实蝇Β· jarvisi、辣椒实绳B. latifrons、黑肩角梧实蝇Β· psidii、 昆士兰实媚Β· tryoni、三带实蝶B_ umbrosa、蜜相大实蝇B. tsuneonis、桔大实蝇B. minax、 地中海实M Ceratitis capitata、非洲芒果实M C. cosyra、黑羽小条实蝇C. anonae、纳塔 尔实妮C. Rosa、非洲芒果实媚C. cosyra苹果绕实蝶Rhagoletis pomonella、樓桃绕实虫尾 R. cerasi〇
[0005] 表1. 31种危险性实蝇类害虫基因检测芯片目的探针代号及序列信息
[0006] Tablei· Summary of codes and sequence information of target probes on microarray for detecting31dangerous tephritid species (italic characters represent being tested)
[0007]
【权利要求】
1. 一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片，其特征在于，该检测检疫性实蝇的基因芯片 采用Corning氨基化修饰基片，此基片为玻璃基片，表面已修饰有氨基活性基团；其上固定 有用于检测危险性实蝇的寡核苷酸探针，40bp，所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行 杂交反应；基片尺寸为25mmX 75mm ;所述寡核苷酸探针组含选自下述中的至少一种寡核苷 酸探针序列：
所述危险性实蝇为：印加按实蝇Anastrepha distincta、墨西哥按实蝇A. ludens、 暗色实蝇A. serpentina、中美按实蝇A. striata、南亚果实蝇Bactrocera tau、瓜实 妮 B. cucurbitae、桃实妮 B. zonata、蒲桃实妮 B. albistrigata、艳实妮 B. calophylli、 桔小实蝇B. dorsalis、普通果实蝇B. caudata、番石槽实蝇B. correcta、油橄榄实蝇 B. oleae、黄瓜果实蝇B. cucumis、大洋洲实蝇B. curvipennis、日本南瓜实蝇B. depressa、 平展实蝇B. expandens、单带果实蝇B. frauenfeldi、扎维斯实蝇B. jarvisi、辣椒实蝇 B. latifrons、黑肩角桔实蝇B. psidii、昆士兰实蝇B. tryoni、三带实蝇B. umbrosa、蜜柑 大实蝇B. tsuneonis、桔大实蝇B. minax、地中海实蝇Ceratitis capitata、非洲芒果实蝇 C. cosyra、黑羽小条实蝇C. anonae、纳塔尔实蝇C. Rosa、非洲芒果实蝇C. cosyra苹果绕实 妮 Rhagoletispomonella、搜桃绕实妮 R. Cerasi。
2. -种危险性实蝇类害虫基因检测芯片制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 芯片基片的准备 本芯片基片采用Corning氨基化修饰基片，此基片为玻璃基片，表面已修饰有氨基活 性基团；基片尺寸为25mmX75mm; (2) 探针的设计及制备
1.探针的设计 探针的设计是基因芯片开发的关键，科学、合理和可靠的探针设计不仅可以提高芯片 的可靠性，还可以降低芯片制作成本；本芯片31种纳入检测分析的实蝇序列片段，除了桔 小实蝇B. dorsalis,桔大实蝇B. minax，瓜实蝇B. cucurbitae，南亚果实蝇B. tau，普通果实 蝇B. caudata，地中海实蝇C. capitata，油榄实蝇B. oleae和昆士兰实蝇B. tryoni的片段 序列是由本实验室扩增测序所得，其余实蝇序列片段均取自NCBI网站的GenBank数据库； 本芯片的探针设计步骤主要分为以下6个步骤：1)探针源序列的确定；2)源序列的收 集与下载；3)对收集到的源序列进行序列比对后，初步确定一批31种实蝇之间的特异性序 列（40bp) ;4)通过Array designer4. 25对特异性序列进行芯片探针质量评估；5)将通过 评估的探针序列进行在NCBI网站进行Blast比对，进一步确定探针的特异性；6)确定最终 探针序列；另外还有质控探针的设计，分为阳性质控探针和阴性质控探针；探针序列信息 见表1 ; 1. 1探针源序列的确定 为了获得最丰富的探针特异性的比对资源，提高基因芯片的可靠性，我们在GenBank 数据库中实蝇序列信息登录相对集中的序列作为探针设计的母版序列；经比对后发现线粒 体细胞色素氧化酶I和细胞色素氧化酶II基因片段是登录最为集中的序列片段；3段序列 作为探针设计的源序列：F，S和DQ，它们的扩增引物序列序列分别为： F 上游引物：5' -TACAGTTGGAATAGACGTTGATAC-3'， F 下游引物：5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3' ； S 上游引物：5' -ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3'， S 下游引物：5' -GTTTAAGAGACCAATACTTG-3' ； DQ 上游引物：5' -ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3'， DQ 下游引物：5' -ACTGTAAATATATGATGAGCTCA-3' ； 1.2探针源序列的收集与下载 以桔小实蝇的上述3个同源序列作为模板序列，从GenBank数据库中收集下载31种实 蝇的上述3个同源序列；由于F和S序列有重叠，所以将F和S合并为一个连续序列；在收 集和下载源序列时，为了减少不同地理种群之间的序列差异的影响，在对每种实蝇源序列 来源地进行比较的基础上，尽量选取重复性比较高的登录序列作为源序列；31种实蝇中有 些实蝇的3个源序列并不完整，但大部分序列都在源序列内； 桔小实蝇B. dorsalis,桔大实蝇B. minax，瓜实蝇B. cucurbitae，南亚果实蝇B. tau，普 通果实蝇B. caudata，地中海实蝇C. capitata，油榄实蝇B. oleae和昆士兰实蝇B. tryoni 的片段序列由本实验室按下面实验步骤扩增测序所得； 首先提取8种待检测实蝇的总DNA作为扩增模板；如前所述扩增样品所用引物有3对， 第一对为UEA7和UEA10,第二对为SF和SR，第三对为DQF和DGR ; 三对引物的扩增体系是一致的，均为：
扩增条件分别为： 扩增片段F，引物对为UEA7和UEAlO的扩增条件为： 1>94°C 5min 2,95°C 40s 3、 48°C 30s 4、 72°C Imin 5,72°C 7min 条件2、3、4 30个循环 扩增片段S，引物对为SF和SR的扩增条件为： U 94°C 3min 2、 94°C 30s 3、 49。。 Imin 4、72°C Imin 5,72°C 7min 条件2、3、4 36个循环 扩增片段DQ，引物对为DQF和DGR的扩增条件为： U 94°C 3min 2、 94°C Imin 3、 45°C 2min 4、 72°C 2min 条件2、3、4 5个循环 5、 94°C 30s 6,50°C 2min 7,72°C 2min 8,72°C 7min 条件5、6、7 36个循环 本实验被检测的有8种实蝇除番石榴实蝇外的探针源序列为S外，其余7种实蝇桔小 实蝇，桔大实蝇，瓜实蝇，南亚果实蝇，普通果实蝇，地中海实蝇和油榄实蝇，所以在扩增标 记时只需米用如两对引物； 1.3源序列比对及探针初选 通过DNA Star软件包MegAlign程序中的Clustal W的方法对31种实蝇的源序列进 行序列比对，初步筛选出31种实蝇内部的探针；初次特异性筛选的标准为尽量避免有超过 8个以上的连续匹配碱基出现，最终总共筛选出了长度为40bp左右的探针80条，其中除了 单带果实蝇，油榄实蝇，地中海实蝇纳塔尔实蝇的部分探针来自于源序列DQ，其它实蝇的所 有探针均来自源序列F和S ; 1. 4初选探针质量评估 将所有80条初选探针输入软件Array designer4. 25,进行探针质量评估；Array designed. 0是一款专门用于基因芯片探针设计的软件，它可以对探针质量进行理论评估； 评估的内容包括：探针的长度，退火温度，GC含量，发卡结构，自身二聚体结构，连续序列长 度和重复序列，然后对每条探针进行评分分级；探针等级由优、好、差、未搜索到几个等级表 示，大于或等于75则为优，75?50之间为好，低于50的为差，若没有找到符合条件的探针 或引物，则显示未搜索到；选取等级显示为好以上的探针，但是对于极个别的只有差探针存 在的，则选取其为筛选后的探针； 1. 5探针序列Blast比对 对经过探针质量评估的探针，逐条在NCBI网站上进行比对；比对时设定为检索除被检 测种外其他实蝇物种的序列，目的除了再一次确认这些探针在31种实蝇内的特异性，更为 重要的是确认这些探针对其他实蝇物种的特异性； 1. 6最终探针序列的确定 经过以上步骤最终确定基因芯片探针40条；探针序列信息请见表1 ; 1. 7质控探针序列 阳性质控探针和阴性质控探针各5条，分别用CP1-5和CN1-5表示；探针序列信息见表 3 ； 2探针的制备 本实验所有探针均为人工合成的oligo DNA探针，探针合成由上海伯豪生物技术有限 公司合成； (3)基因芯片探针点样 本实验所用芯片采用合成后点样法，点制探针分子到芯片芯片上，具体步骤如下： 1探针与基片的结合 合成的oligo DNA探针分子上的负电基团可以与氨基基片上的活性氨基的正电基团产 生静电结合反应，从而将探针分子牢固地固定在基片上；结合后采用紫外照射交联的方式 来增强固定效果； 2点样液的制备 将合成的oligo DNA探针溶解于CldH2O中，配置成50mM的水溶液，之后与DMSOl : 1混 合，制备成25mM的50% DMSO溶液； 3点样过程 将预先设计并合成好的探针，在合适的点样条件下，通过接触式点样点载到玻片；按 照芯片探针排布方式，将25mM的探针溶液转至384孔板中，在湿度60%，温度为25°C的条 件下点样；点样结束后，将芯片置于紫外交联仪中，交联5分钟，取出，放入干燥箱中保存备 用； 4探针布局 每张芯片点制5个block，每个block由12X6X3阵列组成；阵列内根据实验设计，含 有阳性对照探针、阴性对照探针、目的探针、空白对照；芯片上探针排布方式图2和表3 ; 5芯片点制后的质量检测 芯片点制结束后，随机抽取部分芯片，用芯片扫描仪扫描芯片，检查是否有漏点的现 象；芯片扫描图见图3,由图可以看出，本次点制的芯片无漏点现象，芯片上点的大小和分 布比较均匀。
3. 根据权利要求1所述的危险性实蝇类害虫基因检测芯片制备方法，其特征在于所述 基片表面的表面还固定有阳性质控探针和阴性质控探针。
4. 根据权利要求2所述的危险性实蝇类害虫基因检测芯片，其特征在于： 阳性质控探针共5个，分别为： CP-I ：GCCTCCACTTGTGATATGTAGCAGATCAATTAATACGATACCT CP-2 ：GGTTCTGTTCTTCGTTACATAGTTAGTCTCCGACAGCTTCAAT CP-3 ： CTGTGACAGACAACACGCAGTCTCTGTATTACTGATCACATAA CP-4 ：CATGTATAGAACATAAGTGTCTCTAGATGAAGAGCAAGCGCAT CP-5 ： TACAGACAGATGTATGTAACTTCATCTGGTCTGACTCCTTGTG 阴性质控探针共5个，分别为： CN-1 ：ACACATGTGATATATCTGTGGCTTGAAGTCAGATCGTATGTGT CN-2 ：AACGTCTGTGACACATCCTGTACAACTCATAATTATTGTGAGC CN-3 ：CAGAGTATATATGACAGTGCAGAGCAGTCTGTCAGTCAGTGTG CN-4 ：ATAATTCTGTGATGATGTTGAATACACGAGAGTTAGCTGATGC CN-5 ：GCTGTAATCATTACGTGATAACGAACGTCAGAGAGATTGATGT 〇
5. 根据权利要求I所述的危险性实蝇类害虫基因检测芯片，其特征在于：玻璃基片的 表面固定有1-5个探针阵列。
6. 根据权利要求4所述的危险性实蝇类害虫基因检测芯片，其特征在于：所述阵列中 按照下表探针排列方式的每条核苷酸探针重复3次。
【文档编号】C12Q1/68GK104232756SQ201410359993
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】张彬, 臧萌 申请人:青岛农业大学