一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)将功能磁珠与待测样本共孵育；功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；(a)表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；(b)连接有链霉亲和素和标记物的探针；(2)完成步骤(1)后，进行磁分离，收集上清液；(3)在与标记物相应的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤(2)得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。本发明的方法具有成本低廉、简单、快速的优点，并保持了适配体靶标分子广泛、特异性好且灵敏度高的优点，可稳定使用300次以上。
【专利说明】—种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。
【背景技术】
[0002]以核酸适配体为生物识别材料的传感分析方法在最近二十多年得到了飞速发展。核酸适配体是一段能够特异性识别目标污染物的RNA或单链DNA片段。早在上个世纪九十年代，Nature和Science期刊几乎同时首次报道了核酸适配体材料及其筛选技术。经过二十几年的发展，目前已经报道的核酸适配体材料已经可以检测环境中的上百种物质。
[0003]以核酸适配体为生物识别元件的传感分析方法包括可分为均相和非均相(或异相)适配体传感分析两种方法。目前，均相法的核酸适配体传感技术仍然是主流。比如，University of Illinois at Urbana-Champaign大学Lu Yi课题组利用在核酸适配体探针上固定荧光基团和猝灭基团，基于靶标物质识别后产生的DNA构象变化实现荧光信号的增强或减弱，从而建立起靶标物浓度与荧光信号的定量关系。均相反应速度快，检测过程简单，然而试剂消耗量大、检测成本高。固相法通常以固定单链DNA探针为主，基于DNA探针对杂交链和靶标物亲和能力的差异实现检测。为实现多次使用，需要将杂交后的DNA链或靶标物洗脱。已经报道的洗脱方法包括:酸洗/碱洗、加热、高盐洗脱、EDTA螯合、表面活性剂洗脱等。缺点是稳定可重复使用的次数非常有限，通常在5-15次之间。究其原因是DNA的三级构象非常脆弱，在各种洗脱条件下，很难恢复到初始状态。这样低的稳定重复使用次数也极大限制了固相DNA技术的发展和适用范围。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。
[0005]本发明提供了一种检测待测样本中是否含有靶标物质的方法，包括如下步骤:
[0006](I)将功能磁珠与所述待测样本共孵育；所述功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；所述(a)为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述(b)为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子；
[0007](2)完成步骤(1)后，进行磁分离，收集上清液；
[0008](3)在与标记物相应的的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤(2)得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。
[0009]所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤:
[0010]( I )取固相芯片，使其表面羟基化；
[0011]( II )完成步骤(I )后，取固相芯片，使其表面修饰APTS ；
[0012](IV )完成步骤(II )后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。
[0013]“取固相芯片，使其表面羟基化”的方法具体如下:①将固相芯片浸入Piraha溶液(98%^cH2SO4IH2O2 = 3:1，体积比)并120°C反应Ih 完成步骤①后，取出固相芯片，用超纯水清洗直到PH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存lh。
[0014]“取固相芯片，使其表面修饰APTS”的方法具体如下:①取固相芯片，置于APTS溶液中反应Ih 完成步骤①后，取出固相芯片，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2% (体积比)。
[0015]“取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素”的方法具体如下:①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室温反应lh，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应1.5h，然后置于NaBH4溶液中室温反应15min ;②取25mg脱硫生物素、50mg EDC和50mg NHS,用1000 μ IDMF溶解，室温反应3h，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3缓冲液并混匀，得到混合液完成步骤①后，取出固相芯片，加入步骤②得到的混合液中，室温反应12小时完成步骤③后，取出固相芯片，用乙醇冲洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS缓冲液中，室温反应lh。戊二醛溶液:溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为2.5%。乙二胺溶液:溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10%。NaBH4溶液:溶质为NaBH4,溶剂为乙醇，溶质的浓度为10mg/ml。
[0016]所述“连接有链霉亲和素和标记物的探针”的制备方法具体如下:①合成探针，在5’末端进行巯基修饰，在3’末端进行标记物修饰，命名为SH-DNA-标记物；②在10 μ I ImMSH-DNA-标记物中加入0.67 μ L TCEP溶液，避光室温反应lh，以活化巯基；③取Amicon_3K，加入完成步骤②后得到的整个反应体系，再加入200yL Buffer A_l，然后12000rpm离心1min,用buffer A_2洗漆Amicon_3K,收集分子量大于3K的组分(溶液形式)；④取133 μ L 20mg/mL链霉亲和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩涡震荡5min，然后室温反应lh, 12000rpm离心5min,取上清液；⑤取Amicon-1OK,加入步骤④得到的上清液,再加入200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 离心 1min,用 buffer A_2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于1K的组分(溶液形式)；⑥将步骤⑤得到的溶液加入步骤③得到的溶液中，避光室温反应48h ;@取4111化011-101(，加入完成步骤?后得到的整个反应体系，再加入20(^1^ BufferA-1,12000rpm离心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的组分(溶液形式)，即为含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液。TCEP溶液:溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30mM。Buffer A-1:含0.1M NaCl和0.1M磷酸钠的水溶液，pH7.3。Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M 磷酸钠和 0.05% (体积比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0017]所述“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”的制备方法包括如下步骤:①将38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0,0.1M的甲基咪唑缓冲液，然后加入0.65nmol所述核酸适配体，充分混合，得到混合液；②将步骤①得到的混合液加入约20mg磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭，得到表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠。预杂交缓冲液:溶剂为pH7.4、0.1M的Tris缓冲液，含0.005M EDTA.0.5% (体积比)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mLBSA。
[0018]所述功能磁珠的制备方法具体包括如下步骤:①取约20mg表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠，用2mL杂交缓冲液悬浮，在60°C水浴中温浴Ih ;②取10 μ L含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液，溶于2mL杂交缓冲液中，在60°C水浴中温浴Ih 将步骤①得到的磁珠悬浮液和步骤②得到的溶液混合，室温摇匀反应2.5h，得到功能磁珠悬浮液。杂交缓冲液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2的水溶液，pH
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[0019]所述标记物具体可为荧光标记物，更具体可为Cy5.5。所述与标记物相应的的激发波长具体可为650nm。
[0020]所述步骤(3)具体是在全光纤倏逝波生物传感器中进行的。全光纤倏逝波生物传感器的操作规程如下:打开激光器，激发波长为650nm ;以PBS缓冲液冲洗表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片直至基线平稳；基线平稳后，取待测溶液，开启蠕动泵进样25s，之后停止蠕动泵，使待测溶液在反应池内反应120s ;再次开启蠕动泵，通入洗脱液(0.5g/100mL SDS水溶液，调pH至1.9) 90秒；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳。
[0021]所述磁珠具体可为羧基磁珠。
[0022]所述固相芯片具体可为光纤。
[0023]所述靶标物质为赭曲霉素A。
[0024]所述核酸适配体具体如序列表的序列I所示。所述探针具体如序列表的序列2所
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[0025]本发明还保护一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括功能磁珠和表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；所述(a)为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述(b)为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。
[0026]本发明还保护一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括“表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”和“连接有链霉亲和素和标记物的探针”;所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。
[0027]所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤:
[0028]( I )取固相芯片，使其表面羟基化；
[0029]( II )完成步骤(I )后，取固相芯片，使其表面修饰APTS ；
[0030]( IV )完成步骤(II )后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。
[0031]“取固相芯片，使其表面羟基化”的方法具体如下:①将固相芯片浸入Piraha溶液(98%^cH2SO4IH2O2 = 3:1，体积比)并120°C反应Ih 完成步骤①后，取出固相芯片，用超纯水清洗直到PH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存lh。
[0032]“取固相芯片，使其表面修饰APTS”的方法具体如下:①取固相芯片，置于APTS溶液中反应Ih 完成步骤①后，取出固相芯片，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2% (体积比)。
[0033]“取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素”的方法具体如下:①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室温反应lh，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应1.5h，然后置于NaBH4溶液中室温反应15min ;②取25mg脱硫生物素、50mg EDC和50mg NHS,用1000 μ IDMF溶解，室温反应3h，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3缓冲液并混匀，得到混合液完成步骤①后，取出固相芯片，加入步骤②得到的混合液中，室温反应12小时完成步骤③后，取出固相芯片，用乙醇冲洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS缓冲液中，室温反应lh。戊二醛溶液:溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为2.5%。乙二胺溶液:溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10%。NaBH4溶液:溶质为NaBH4,溶剂为乙醇，溶质的浓度为10mg/ml。
[0034]所述“连接有链霉亲和素和标记物的探针”的制备方法具体如下:①合成探针，在5’末端进行巯基修饰，在3’末端进行标记物修饰，命名为SH-DNA-标记物；②在10 μ I ImMSH-DNA-标记物中加入0.67 μ L TCEP溶液，避光室温反应lh，以活化巯基；③取Amicon_3K，加入完成步骤②后得到的整个反应体系，再加入200μ L Buffer A_l，然后12000rpm离心1min,用buffer A-2洗漆Amicon_3K,收集分子量大于3K的组分(溶液形式)；④取133 μ L 20mg/mL链霉亲和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩涡震荡5min，然后室温反应lh, 12000rpm离心5min,取上清液；⑤取Amicon-1OK,加入步骤④得到的上清液,再加入200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 离心 1min,用 buffer A-2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于1K的组分(溶液形式)；⑥将步骤⑤得到的溶液加入步骤③得到的溶液中，避光室温反应48h ;⑦取Amicon-lOK，加入完成步骤⑥后得到的整个反应体系，再加入200 μ L BufferA-1,12000rpm离心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的组分(溶液形式)，即为含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液。TCEP溶液:溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30mM。Buffer A-1:含0.1M NaCl和0.1M磷酸钠的水溶液，pH7.3。Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M 磷酸钠和 0.05% (体积比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0035]所述“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”的制备方法包括如下步骤:①将38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0,0.1M的甲基咪唑缓冲液，然后加入0.65nmol所述核酸适配体，充分混合，得到混合液；②将步骤①得到的混合液加入约20mg磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭，得到表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠。预杂交缓冲液:溶剂为pH7.4、0.1M的Tris缓冲液，含0.005M EDTA.0.5% (体积比)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mLBSA。
[0036]所述功能磁珠的制备方法具体包括如下步骤:①取约20mg表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠，用2mL杂交缓冲液悬浮，在60°C水浴中温浴Ih ;②取10 μ L含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液，溶于2mL杂交缓冲液中，在60°C水浴中温浴Ih ;③将步骤①得到的磁珠悬浮液和步骤②得到的溶液混合，室温摇匀反应2.5h，得到功能磁珠悬浮液。杂交缓冲液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2的水溶液，pH
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[0037]所述标记物具体可为荧光标记物，更具体可为Cy5.5。所述与标记物相应的的激发波长具体可为650nm。
[0038]所述磁珠具体可为羧基磁珠。
[0039]所述固相芯片具体可为光纤。
[0040]所述靶标物质为赭曲霉素A。
[0041]所述核酸适配体具体如序列表的序列I所示。所述探针具体如序列表的序列2所
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[0042]本发明的目的在于提出一种高稳定高重复使用的核酸适配体探针荧光传感分析方法。本发明的主要特征在于:以核酸适配体为生物识别探针，固相传感，激光诱导荧光，高稳定重复使用次数。具体而言(见图1):将核酸适配体固定在磁珠表面，并且杂交上一段互补链，这段互补DNA链缀合了链霉亲和素和荧光标记物。同时，在固相芯片界面修饰脱硫生物素。当系统中存在目标污染物时，互补链被竞争下来，并且与在固相界面修饰的脱硫生物素结合，荧光物质被激发，获得的信号与系统中存在目标污染物成定量关系，从而达到检测的目的。本发明方法测定目标污染物浓度具有成本低廉、简单、快速的优点，并保持了适配体靶标分子广泛、特异性好且灵敏度高的优点，可稳定使用300次以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1为本发明提供的方法的原理示意图。
[0044]图2为实施例1的步骤一的流程示意图。
[0045]图3为实施例1的步骤二的流程示意图。
[0046]图4为实施例1的步骤三的流程示意图。
[0047]图5为实施例2的结果。
[0048]图6为实施例3的结果。
【具体实施方式】
[0049]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.4、1mM的PBS缓冲液。脱硫生物素:sigma，货号为D1411。链霉亲和素::Thermo，货号为prod#21135。赭曲霉素A:pribolab，货号为IAC-040-3。APTS的全称为“(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷”。TCEP的中文全称为“(三(2-羧乙基)膦”,英文全称为“Tris (2-carboxyethyl) phosphine) ”。Sulfo-SMCC的中文全称为“4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐”。
[0050]DNA分子甲为特异性结合赭曲霉素A的核酸适配体，其核苷酸序列(序列表的序列 I)为 5-NHo-AcGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA~3，。DNA 分子乙为与DNA分子甲部分互补的单链DNA分子，其核苷酸序列(序列表的序列2)为5，-AAAAAAAAAAAATGTCCGATGCTC-3?。
[0051]用于本实施例的倏逝波检测仪器(全光纤倏逝波生物传感器)见专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
[0052]实施例1、试剂盒的制备
[0053]一、表面修饰有脱硫生物素的光纤的制备
[0054]流程示意图见图2。
[0055]1、取光纤，使其表面羟基化。
[0056]具体方法:(I)将光纤(570/600/900，购于南京春辉科技实业有限公司)浸入piraha溶液(98赚H2SO4:H2O2 = 3:1，体积比)并120°C反应Ih ； (2)完成步骤(1)后，取出光纤，用超纯水清洗直到pH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存Ih。
[0057]2、完成步骤I后，取光纤，使其表面修饰APTS。
[0058]具体方法:(I)完成步骤I后，取光纤，置于APTS溶液中反应Ih ; (2)完成步骤(1)后，取出光纤，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2% (体积比)。
[0059]3、完成步骤2后，取光纤，使其表面修饰脱硫生物素。
[0060]具体方法:(I)完成步骤2后，取光纤，置于戊二醛溶液中室温反应lh，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应1.5h,然后置于NaBH4溶液中室温反应15min ； (2)取25mg脱硫生物素、50mg EDC和50mg NHS，用1000 μ I DMF溶解，室温反应3h (混合旋转)，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3缓冲液并混匀，得到混合液；⑶完成步骤(1)后，取出光纤，加入步骤(2)得到的混合液中，室温反应12小时；(4)完成步骤(3)后，取出光纤，用乙醇冲洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS缓冲液中，室温反应lh。
[0061]戊二醛溶液:溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为2.5%。
[0062]乙二胺溶液:溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10%。
[0063]NaBH4溶液:溶质为NaBH4,溶剂为乙醇，溶质的浓度为10mg/ml。
[0064]二、制备连接有链霉亲和素和荧光标记物的探针
[0065]流程示意图见图3。
[0066]1、合成DNA分子乙，在5’末端进行巯基修饰，在3’末端进行Cy5.5修饰，命名为SH-DNA-Cy5.5。
[0067]2、在ΙΟμΙ 1禮3!?)嫩-075.5中加入0.67 4 1^1^?溶液，避光室温反应111，以活化巯基。TCEP溶液:溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30mM。
[0068]3、取Amicon-3K(Amicon，货号为UFC500396-1)，加入完成步骤2后得到的整个反应体系，再加入200 μ L Buffer A_l,然后12000rpm离心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-3K,收集分子量大于3K的组分(溶液形式)。
[0069]Buffer A-1:含 0.1M NaCl 和 0.1M 磷酸钠的水溶液，pH7.3。
[0070]Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M磷酸钠和 0.05% (体积比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0071]4、取133yL 20mg/mL链霉亲和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩涡震荡5min,然后室温反应lh, 12000rpm离心5min,取上清液。
[0072]5、取Amicon-lOK (Amicon，货号为UFC501096-1)，加入步骤4得到的上清液，再加A 200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 离心 1min,用 buffer A-2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于10K的组分(溶液形式)。
[0073]6、将步骤5得到的溶液加入步骤3得到的溶液中，避光室温反应48h。
[0074]7、取Amicon-lOK，加入完成步骤6后得到的整个反应体系，再加入200μ L BufferA-1,12000rpm离心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的组分(溶液形式)，命名为STV-p1be-Cy5.5溶液。以链霉亲和素计，STV-probe-Cy5.5溶液的浓度为 200mg/mL。
[0075]三、制备表面修饰核酸适配体的磁珠
[0076]流程示意图见图4。
[0077]1、取 ImL 羧基磁珠(Bangs Laboratories Inc, B1Mag BP618 ;悬浮液形式，磁珠浓度为20.3mg/ml)，磁分离并弃去上清，用DEPC水洗涤磁珠2_3次(每次清洗后均经磁分离弃去上清液)。
[0078]2、将38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0、0.1M的甲基咪唑缓冲液，然后加入0.65nmolDNA分子甲，充分混合，得到混合液。
[0079]3、将步骤2得到的混合液加入步骤I得到的磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭(室温孵育4h)，得到磁珠-核酸适配体缀合物混合液。
[0080]预杂交缓冲液:溶剂为ρΗ7.4、0.IM的Tris缓冲液，含0.005Μ EDTA、0.5% (体积t匕)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mL BSA。
[0081]四、磁珠-核酸适配体缀合物与STV-probe_Cy5.5的杂交
[0082]流程示意图见图4。
[0083]1、取2mL步骤三制备的磁珠_核酸适配体缀合物混合液(含约20mg磁珠)，磁分离后弃去上清，用杂交缓冲液洗涤三次，然后用2mL杂交缓冲液悬浮，在60°C水浴中温浴lh。
[0084]2、取10μ L步骤二得到的STV-probe-Cy5.5溶液，溶于2mL杂交缓冲液中，在60°C水浴中温浴lh。
[0085]3、将步骤I得到的磁珠悬浮液和步骤2得到的溶液混合，室温摇匀反应2.5h，得到功能磁珠悬浮液。
[0086]杂交缓冲液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2 的水溶液，pH 8.5。
[0087]实施例2、检测赭曲霉素A
[0088]采用DMF为溶剂，制备lmg/mL的赭曲霉素A储备液。
[0089]1、取实施例1的功能磁珠悬浮液(含约20mg磁珠)，用含2mg/mL BSA的PBS缓冲液清洗两遍，弃去上清液。
[0090]2、完成步骤I后，取磁珠，加入赭曲霉素A储备液，加入含2mg/mL BSA的PBS缓冲液，使反应体系的总体积为350yL,混匀15min。赭曲霉素A储备液设置不同的加入量，使得反应体系的初始时刻赭曲霉素A的浓度为6.4nM、38.2nM、95.4nM、158.7nM、222.6nM、445.3nM、635.0nM、1269.6nM、3174.9nM 或 3710.0nM,每个浓度设置三个重复。
[0091]3、完成步骤2后，进行磁分离，收集上清液(待测溶液)。
[0092]4、全光纤倏逝波生物传感器的操作规程:打开激发器，激发波长为650nm ;以PBS缓冲液冲洗实施例1的步骤一制备的光纤直至基线平稳；基线平稳后，取步骤3得到的待测溶液，开启螺动泵进样25s,之后停止螺动泵,使待测溶液在反应池内反应120s ;再次开启蠕动泵，通入洗脱液(0.5g/100mL SDS水溶液，调pH至1.9)90秒；最后通入PBS缓冲液，
至基线平稳。
[0093]在一个待测溶液的检测完成后，利用洗脱液和pH7.4,0.1M的PBS缓冲液交替冲洗实施例1的步骤一制备的光纤，使STV-probe-Cy5.5从实施例1的步骤一制备的光纤上脱落下来，然后进行下一个待测溶液的检测，通过这种检测方法能够将传统的DNA结合洗脱过程转化成蛋白质的洗脱过程，从而达到很高的稳定重复应用次数。
[0094]结果见图5，对赭曲霉素A的检出限为12nM(4.9ng/mL)，线性范围为12ηΜ_32μΜ。
[0095]实施例3、实施例1的步骤一制备的光纤的可重复利用次数
[0096]采用DMF为溶剂，制备lmg/mL的赭曲霉素A储备液。
[0097]1、取实施例1的功能磁珠悬浮液(含约20mg磁珠)，用含2mg/mL BSA的PBS缓冲液清洗两遍，弃去上清液。
[0098]2、完成步骤I后，取磁珠，加入赭曲霉素A储备液，加入含2mg/mL BSA的PBS缓冲液，使反应体系的总体积为350 μ L (反应体系的初始时刻赭曲霉素A的浓度为3 μ Μ),混匀15min。
[0099]3、完成步骤2后，进行磁分离，收集上清液(待测溶液)。
[0100]4、全光纤倏逝波生物传感器的操作规程:打开激光器，激发波长为650nm ;以PBS缓冲液冲洗实施例1的步骤一制备的光纤直至基线平稳；基线平稳后，取步骤3得到的待测溶液，开启螺动泵进样25s,之后停止螺动泵,使待测溶液在反应池内反应120s ;再次开启蠕动泵，通入洗脱液(0.5g/100mL SDS水溶液，调pH至1.9) 90秒；最后通入PBS缓冲液，
至基线平稳。
[0101]重复对步骤3得到的待测溶液进行检测。在一个待测溶液的检测完成后，利用洗脱液和pH7.4、0.1M的PBS缓冲液交替冲洗实施例1的步骤一制备的光纤，使STV-probe-Cy5.5从实施例1的步骤一制备的光纤上脱落下来，然后进行下一个待测溶液的检测，通过这种检测方法能够将传统的DNA结合洗脱过程转化成蛋白质的洗脱过程，从而达到很高的稳定重复应用次数。
[0102]结果见图6。本发明中涉及的光纤可重复使用至少300次。
【权利要求】
1.一种检测待测样本中是否含有靶标物质的方法，包括如下步骤: (1)将功能磁珠与所述待测样本共孵育；所述功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；所述(a)为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述(b)为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子； (2)完成步骤(1)后，进行磁分离，收集上清液； (3)在与标记物相应的的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤(2)得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤: (1)取固相芯片，使其表面羟基化； (2)完成步骤(1)后，取固相芯片，使其表面修饰APTS; (3)完成步骤(2)后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述固相芯片为光纤。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述靶标物质为赭曲霉素A。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述磁珠为羧基磁珠。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述核酸适配体如序列表的序列I所示，所述探针如序列表的序列2所示。
7.—种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括功能磁珠和表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；所述(a)为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述(b)为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。
8.—种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括“表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”和“连接有链霉亲和素和标记物的探针”;所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于:所述固相芯片为光纤；所述磁珠为羧基磁珠。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于:所述靶标物质为赭曲霉素A;所述核酸适配体如序列表的序列I所示，所述探针如序列表的序列2所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104178568SQ201410360025
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】周小红, 向宇, 王若瑜, 施汉昌 申请人:清华大学