提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法
【专利摘要】根据现有技术在解决胚胎耐热性方面的难题，本发明提供了一种提高胚胎耐热性的培养液。培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液为用于胚胎培养的培养液。所述培养液中还包括黄芩苷和谷氨酰胺；所述黄芩苷的浓度为2.0-10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1.17-1.75mg/ml。通过在胚胎培养液中添加适当浓度的黄芩苷和谷氨酰胺制备得到耐热培养液，不仅降低了经济成本、配制方法简单，而且大幅度提高了胚胎在热应激时的发育率和囊胚孵出率。此外，黄芩苷和谷氨酰胺之间存在协同作用，都可以调节HSP70的表达。因此，与单独的黄芩苷或者谷氨酰胺相比，本发明制备的耐热培养液的效果突出，产生了意想不到的技术效果。
【专利说明】提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于胚胎工程与发育生物学领域，具体涉及一种胚胎的培养液，尤其涉及 一种提高早期胚胎耐热性的培养液及使用方法。
【背景技术】
[0002] 随着全球变暖，温度升高，高温对人类和动物的影响越发明显，夏季高温以及某些 热性（使体温升高的）疾病，都会使动物产生热应激，导致孕畜胚胎死亡，导致其繁殖力降 低甚至不孕，给畜牧业生产造成极大的经济损失。
[0003] 传统的培养液是模拟胚胎在输卵管中发育时的环境配制的，其主要成分包括：水、 离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统及气体，适用 于正常温度下的胚胎培养。胚胎正常的培养温度为：牛胚胎38-39°C、小鼠胚胎37°C。在正 常培养温度下牛胚胎发育至囊胚的百分率是30. 4±1. 11，孵出率是4. 32±3. 48 ;小鼠胚胎 发育至囊胚的百分率是81. 35±1. 07,孵出率是61. 88±0. 72。但热应激条件下，用传统的 培养液培养胚胎，其发育率会随着培养温度升高而显著降低。这是因为，当温度升高时，培 养液中的某些成分会发生变化，从而影响胚胎的生长；另外，当培养的温度升高时，胚胎本 身代谢与正常温度不同，对营养成分的需求也会增加。
[0004] 目前，提高小鼠胚胎耐热性的培养液有TCZB，其优点是可以提高小鼠早期胚胎 在41°C热应激条件下的发育率。用TCZB培养液培养的小鼠胚胎，其囊胚发育率及孵出率 (81. 3±4. 5 和 76. 5±7. 6)显著高于 CZB 对照组（80. 2±5. 4 和 73. 4±6. 2)，说明 TCZB 提 高了小鼠胚胎的热耐受性。但是，TCZB培养液并不能提高39°C培养小鼠胚胎发育至囊胚率 及囊胚孵出率。此外，TCZB培养液需要利用原核表达法得到TAT蛋白和小鼠 Hsp70的串联 表达体--Tat-Hsp70。然而，这种方法操作复杂，对技术的要求很高，成功率低，不具有普 遍适用性。
[0005] 黄苳苷（Baicalin)是从黄苳根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著 的生物活性（抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用）和较强的抗癌反应等生理效能，其安 胎、解热作用显著。黄芩苷的提取方法和药物用途已经公知。发明专利申请200810167545. 6 公开了"黄芩苷的一种抗中暑用途"，该申请给出了黄芩苷在制备增强人或动物对抗经典型 热损伤能力的药物和制剂方面的应用。黄芩苷在经口给药的条件下，可降低高温环境下导 致血液的炎症反应，能够明显延长大鼠进入热仓后中暑发生时间，并推迟大鼠在热环境中 的死亡时间。
[0006] 早期胚胎培养应用的是细胞增殖和分化的原理，其发育对环境条件极为严格。选 择添加到胚胎培养液中的中药成分首选不能对胚胎有毒性作用；其次还要能穿过胚胎屏 障--胚胎的透明带包被。因此，用于动物体上的中药有很大一部分不能用于胚胎培养或 者即使可以用于胚胎培养液也难以产生相同的功效。例如：川芎嗪分子质量小，水溶性和 脂溶性强，文献报道川芎嗪具有调节HSP70表达的作用，但是川芎嗪用在胚胎培养液中可 阻滞胚胎发育，不利于胚胎进一步发育，并且可导致小鼠胚胎心肌畸形。黄芪多糖由己糖 醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，具有调节HSP70 表达的作用；但黄芪多糖试验组的胚胎发育率比对照组还低，其对胚胎的作用还有待于进 一步的深入探讨。小檗碱具备清热解毒的功效，其作用实质是对细菌和病毒等致病原的抑 制或杀灭作用；小檗碱能明显的促进胚胎2-细胞发育及细胞增值，但没有研究表明其能 HSP70的表达具有调节作用。
[0007] 此外，妊娠禁忌药物也有很多，主要包括两大类：第一，具有毒性的药物，服用后可 直接对胎儿造成毒害，甚至死胎，如斑蝥、蜈蚣、全蝎、半夏、南星、附子等；第二，不具有毒 性、但药性猛烈或药性下行滑利而易损胎元的药物，这类药主要是指大辛大热、行气化瘀及 攻逐利水类中药，如青皮、槟榔、细辛、桃仁、沉香等70余种。基于上述种种因素，目前有关 中药及其有效成分运用于胚胎体外培养的研究很少。关于黄芩苷，其药理作用更是集中在 细胞、组织和活体上，在胚胎体外培养上只有其抗氧化作用的相关文献（孙玉成，2006,中 国兽医学报）。该研究发现，黄芩苷的抗氧化作用可以减少自由基对小鼠胚胎体外发育的损 伤。
[0008] 谷氨酰胺（Gin)是动物血液中最丰富的特殊游离氨基酸之一。近年来，越来越多 的研究发现，谷氨酰胺除了能维持机体酸碱平衡并为组织和细胞的物质和能量代谢提供原 料外，还可以诱导动物的热休克反应，提高小鼠胚胎HSP70的表达，并且可促进胚胎发育， 提高囊胚孵出率。目前，用于胚胎培养液的谷氨酰胺浓度一般为lmm〇l/L，这是由于谷氨酰 胺作为胚胎可吸收的氨基酸是早期胚胎细胞功能的重要调节者，通过调节胚胎能量产生方 式来促进培养过程中胚胎的发育，克服胚胎发育阻滞。对于胚胎的耐热，则没有明显的效 果。
【发明内容】
[0009] 根据现有技术在解决胚胎耐热性方面的难题，本发明提供了一种提高胚胎耐热性 的培养液。该培养液不仅可以提高高温条件下培养胚胎的发育率，而且为生产中预防因热 应激造成的妊娠动物早期胚胎死亡提供解决思路。
[0010] 本发明采用的技术方案：
[0011] 提高胚胎耐热性的培养液，所述培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液为 用于胚胎培养的培养液。所述培养液中还包括黄苳苷和谷氨酰胺；所述黄苳苷的浓度为 2. 0-10. 0μ g/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1. 17-1. 75mg/ml。黄芩苷和谷氨酰胺均可以在胚 胎上调节HSP70的表达，发挥其胚胎的抗热作用。此外，黄芩苷和谷氨酰胺在调节HSP70 的表达方面具有协同作用，大大提高了单独用其中一种组分所产生的耐热效果。所述黄 芩苷由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心提供，纯度为99%，所述谷氨酰胺购自 sigma公司。所述常规培养液为常用于胚胎培养的培养液，本发明中选用人工合成输卵管液 (synthetic oviduct fluid，S0F)作为牛胚胎培养液、CZB作为小鼠胚胎培养液。所述牛胚 胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得，所述的小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管 冲取的胚胎。
[0012] 所述提高胚胎耐热性的培养液的配制方法，包括以下几个步骤：①准确称取 2. 0-10. Omg黄芩苷，将其溶于10mL常规培养液；②取lml步骤①得到的溶液，采用常规培 养液定容至l〇〇ml ;③向步骤②得到的培养液中加入1. 17-1. 75mg的谷氨酰胺，搅拌均匀， 经0. 22 μ m滤器过滤除菌，即得到提高胚胎耐热性的培养液；4°C温度条件下储存，备用。
[0013] 所述提高牛胚胎耐热性的培养液的使用方法，包括以下几个步骤：（1)预平衡：根 据牛发育早期胚胎数量的多少，在60mm培养皿中，将耐热培养液做成60 μ L的培养微滴（8 个/培养皿），覆盖矿物油以防止液滴的挥发，然后置于含5 % C02饱和湿度、温度条件为 41°C的C02培养箱中平衡不少于2小时，使培养液的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎 在体内的液体坏境；否则胚胎在离体环境不容易养活。（2)胚胎移入：取耐热培养液200 μ L 于1. 5ml离心管中，将牛胚胎移入其中，震荡45s去除颗粒细胞；（3)胚胎培养：将步骤（2) 得到的胚胎采用耐热培养液充分洗涤2次，然后移入步骤（1)得到的培养微滴中，每个培养 微滴移入25个早期胚胎；并将培养微滴置于含5% C02饱和湿度、温度条件为41°C的C02培 养箱中培养，每隔48小时半量更换培养液。
[0014] 所述的提高小鼠胚胎耐热性的培养液的使用方法，包括以下几个步骤：（1)预平 衡：将耐热培养液制作成多个体积为60 μ L的培养微滴，覆盖矿物油以防止液滴的挥发，然 后置于含5% C02饱和湿度、温度条件为39°C的C02培养箱中平衡不少于4小时，使培养液 的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境；(2)胚胎移入：取耐热培养液 200 μ L于离心管中，将小鼠胚胎移入其中，震荡去除颗粒细胞；（3)胚胎培养：将步骤②得 到的胚胎采用耐热培养液充分洗涤，然后移入步骤①得到的培养微滴中；并将培养微滴置 于含5% C02饱和湿度、温度条件为39°C的C02培养箱中培养，待胚胎发育至4细胞时移入 含有1 %葡萄糖的耐热培养液中，每24h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。
[0015] 现已证明，多种体外培养的细胞和胚胎受热后均能产生热休克蛋白70(HSP70)， HSP70是一种非常重要的非特异性细胞保护蛋白，尤其对体外培养的细胞均有显著的抗热 保护作用，而黄芩苷通过在胚胎上调节HSP70的表达，发挥其胚胎的抗热作用。此外，黄芩 苷和谷氨酰胺都可以调节HSP70的表达，而且具有协同作用。研究发现，在胚胎培养液中添 加适当比例的黄芩苷和谷氨酰胺能够在一定程度上对抗热环境损伤，提高胚胎耐热性。单 独添加黄芩苷（8 μ g/mL)在39°C时小鼠胚胎囊胚率和孵出率是65. 12%和53. 73%，单独添 加谷氨酰胺（10mm〇l/L)在39°C时小鼠胚胎囊胚率和孵出率是67. 26%和54. 41%。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] (1)本发明通过在胚胎培养液中添加适当浓度的黄芩苷和谷氨酰胺制备得到耐热 培养液，不仅大大降低了经济成本、配制方法简单，而且大幅度提高了胚胎在热应激时的发 育率和囊胚孵出率；
[0018] ⑵本发明采用的黄芩苷和谷氨酰胺之间存在协同作用，都可以调节HSP70的表 达。因此，与单独的黄芩苷或者谷氨酰胺相比，本发明制备的耐热培养液的效果突出，产生 了意想不到的技术效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是实施例1中Western Blot方法检测的牛胚胎中HSP70蛋白的表达；
[0020] 图2是实施例1中牛胚胎的HSP70蛋白相对表达量统计结果；
[0021] 图3是实施例4中Western Blot方法检测的小鼠胚胎中HSP70蛋白的表达；
[0022] 图4是实施例4中小鼠胚胎的HSP70蛋白相对表达量统计结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0024] 实施例1 :牛胚胎的耐热培养实验
[0025] (1)制备适用于牛胚胎的耐热培养液
[0026] 表1牛胚胎常规S0F培养液组成成分
[0027]
【权利要求】
1. 提高胚胎耐热性的培养液，所述耐热培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液 为用于胚胎培养的培养液，其特征在于：所述耐热培养液中还包括黄芩苷和谷氨酰胺；所 述黄芩苷的浓度为2. 0-10. 〇μ g/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1. 17-1. 75mg/ml。
2. 根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液，其特征在于：所述胚胎为牛胚胎 或小鼠胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得，所述小鼠胚胎由昆 明系小鼠输卵管冲取获得；所述牛胚胎的常规培养液为人工合成输卵管液（SOF培养液）， 所述小鼠胚胎的常规培养液为CZB培养液。
3. 根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的配制方法，其特征在于：包括以 下几个步骤：①准确称取2. 0-10. Omg黄芩苷，将其溶于10mL常规培养液；②取lml步骤① 得到的溶液，采用常规培养液定容至l〇〇ml ;③向步骤②得到的培养液中加入1. 17-1. 75mg 的谷氨酰胺，搅拌均匀，经〇. 22 μ m滤器过滤除菌，即得到提高胚胎耐热性的培养液；4°C温 度条件下储存，备用。
4. 根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：包括以 下几个步骤： ① 预平衡：将耐热培养液制作成多个体积为60 μ L的培养微滴，覆盖矿物油，然后置于 含5% C02饱和湿度、温度条件为41 °C的C02培养箱中平衡不少于2小时，使耐热培养液的 氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境； ② 胚胎移入：取常规S0F培养液200 μ L于离心管中，将牛胚胎移入其中，震荡去除颗粒 细胞； ③ 胚胎培养：将步骤②得到的胚胎采用常规S0F培养液充分洗涤，然后移入步骤①得 到的耐热培养微滴中；并将耐热培养微滴置于含5% C02饱和湿度、温度条件为41°C的C02 培养箱中培养，每隔48小时半量更换培养液。
5. 根据权利要求4所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：所述牛 胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得。
6. 根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：包括以 下几个步骤： ① 预平衡：将耐热培养液制作成多个体积为60 μ L的培养微滴，覆盖矿物油，然后置于 含5% C02饱和湿度、温度条件为39°C的C02培养箱中平衡不少于4小时，使培养液的氧含 量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境； ② 胚胎移入：将小鼠胚胎移入含透明质酸酶的Η印es-CZB培养液中去除颗粒细胞； ③ 胚胎培养：将步骤②得到的胚胎采用Hepes-CZB培养液充分洗涤，然后移入步骤① 得到的耐热培养微滴中；并将耐热培养微滴置于含5% C02饱和湿度、温度条件为39°C的 C〇2培养箱中培养，待胚胎发育至4细胞时移入含有1 %葡萄糖的耐热培养液中，每24h换 液一次，直至胚胎发育至囊胚期。
7. 根据权利要求6所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：所述小 鼠胚胎由昆明系小鼠输卵管冲取获得。
【文档编号】C12N5/073GK104152404SQ201410446860
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】田文儒, 赵园, 丛霞, 曹荣峰, 李华涛, 姜忠玲, 崔凯, 齐晓楠 申请人:青岛农业大学