柑桔黄脉病毒的巢式rt-pcr引物组、检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组、检测方法及试剂盒,属于分子生物学【技术领域】。本发明提供了柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR外巢引物对CYVCV-1f、CYVCV-1r和内巢引物对CYVCV-2f、CYVCV-2r，利用外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产物为模板用内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得469bp的PCR产物的待测样品即为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。本发明操作简便、重复性好、准确性高，其灵敏度是常规RT-PCR的100倍，对处于潜伏期的病毒也能及时检测到。
【专利说明】柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组、检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物流行病害监测领域，尤其涉及一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR 引物组、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 柑桔黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑桔黄脉病 是一种严重威胁柑桔生产的重要病害，主要分布于印度、巴基斯坦、土耳其等国，对柠檬等 柑桔品种造成了极其严重的损失。我国近年来在云南、四川等柠檬主产区也相继发现了该 病，其发生呈不断扩大、加重的趋势。由于目前尚无药剂可有效防治柑桔黄脉病，因此使用 无病毒苗木、以及铲除田间病树是重要的防治手段。为此需要建立一种CYVCV的快速、准 确、灵敏的检测技术方法以满足我国柑桔产业发展的需要。
[0003] CYVCV为柑桔病毒属（Mandarivirus)成员，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为 670-700nmX 13-14nm。CYVCV基因组含有7529个核苷酸，可能包含有6个开放读码框 (0RF)。目前在检测CYVCV时主要采用以酸橙等作为指示植物进行鉴定，但检测周期长。虽 然目前常规RT-PCR已开始运用于CYVCV检测，但其对田间早期病树的检测效果不够理想， 灵敏度还有待提高。巢式RT-PCR的检测灵敏度远高于常规RT-PCR，但目前尚未将该技术运 用于CYVCV的检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引 物组。
[0005] -种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组，由外巢引物对和内巢引物对组成：
[0006] 外巢引物对：CYVCV-lf :ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG ;
[0007] CYVCV-lr ：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA ；
[0008] 内巢引物对：CYVCV-2f :AAACCTAATCGGTCCTGTG ;
[0009] CYVCV-2r :GAGACACCCTACTTCAGCG。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒 的巢式RT-PCR检测方法。
[0011] 本发明的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，是以待测样品总RNA为模板，应 用权利要求1所述的外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产物 为模板用权利要求1所述的内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得 469bp的PCR产物的待测样品为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。
[0012] 所述第一轮RT-PCR反应体系为：浓度为20?50ng/ μ L的解链后的模板RNA溶 液 1. 0 μ L，10mM 的外巢引物 CYVCV-lf 和 CYVCV-lr 各 0· 1 μ L，5 μ L 2Χ 1st印 buffer， 0· 4 μ L PrimScript IStep Enzyme Mix，3· 4 μ L DEPC 水；所述第一轮 RT-PCR 反应条件为： 50°C 30min，94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec，循环 20 次；所述第二轮 PCR 反应体系为：第一轮RT-PCR扩增产物10 μ L，1 OmM的内巢引物CYVCV-2f和CYVCV-2r各 0.2yL，2.5yL 10XPCR缓冲液，0.2yL 浓度为 5U/yL 的 rTaq，16.9yL DEPC水；所述第 二轮 PCR 反应条件为：94°C 2min ;94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 45sec，循环 30 次。
[0013] 本发明的再一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒 巢式RT-PCR检测试剂盒。
[0014] 本发明的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，含有上述引物组：外巢引物对 CYVCV-lf、CYVCV-lr 和内巢引物对 CYVCV-2f、CYVCV-2r。
[0015] 除了上述特异引物对外，该试剂盒还含有进行PCR扩增所需要的试剂，该试剂包 括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。
[0016] 本发明的有益效果是：本发明操作简便、重复性好、准确性高，其灵敏度是常规 RT-PCR的100倍，对处于潜伏期的病毒也能及时检测到。本发明可快速、准确、灵敏地对 CYVCV样品进行检测，尤其适用于对田间柑桔黄脉病病树的早期监控，对田间柑桔黄脉病预 防和防治具有重要的有意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测结果示意图；其中1为水对照，2为负对照， 3-5为感病植株样品，6为5kb+l. 5kb标准分子量。
[0018] 图2为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR引物组的特异性检测图；其中1为水对照，2为 负对照，3-10依次为柑桔衰退病、柑桔碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、黄龙病、溃 瘍病、柑桔黄脉病植株样品，11为5kb+l. 5kb标准分子量。
[0019] 图3为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测灵敏度测试图；其中1和10为5kb+l. 5kb 标准分子量，2-9依次为柑桔黄脉病样品4稀释10倍、102倍、103倍、104倍、10 5倍、106倍、 107倍、108倍后巢式RT-PCR检测结果，11-18依次为柑桔黄脉病样品4稀释10倍、10 2倍、 103倍、104倍、105倍、10 6倍、107倍、108后常规RT-PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021] 本发明的实验材料：
[0022] 本实验所用分别感染柑桔衰退病、柑桔碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、 柑桔黄脉病、黄龙病、溃疡病的植株样品来源于中国农业科学院柑桔研究所保存毒源。
[0023] 主要试剂：
[0024] RNAiso Plus (TaKaRa 公司，日本），PrimScript IStep Enzyme Mix (TaKaRa，日 本），rTaq(TaKaRa，日本），胶纯化试剂盒（Omega公司，美国），pMD_19T (TaKaRa，日本）， Solution I (TaKaRa，日本），感受态细胞 JM109 (TaKaRa，日本）。
[0025] 实施例1柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测特异性验证
[0026] 1用于检测柑桔黄脉病毒的引物组
[0027] 根据GenBank中CYVCV(JX040635. 1)的基因组序列，针对其3'端的保守区域设计 了 CYVCV巢式RT-PCR检测方法所需的外巢引物对（CYVCV-lf和CYVCV-lr)，以及内巢引物 对（CYVCV-2f和CYVCV-2r)。并在GenBank中通过Blast比对，保证了引物的特异性。引物 序列见表1。
[0028] 表1巢式RT-PCR检测CYVCV所用引物序列
[0029]
【权利要求】
1. 一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组，其特征在于：由外巢引物对和内巢引物对 组成： 外巢引物对：CYVCV-lf :ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG ; CYVCV-lr ：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA ； 内巢引物对：CYVCV-2f :AAACCTAATCGGTCCTGTG ; CYVCV-2r :GAGACACCCTACTTCAGCG。
2. -种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：是以待测样品总RNA为模 板，应用权利要求1所述的外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产 物为模板用权利要求1所述的内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得 469bp的PCR产物的待测样品为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。
3. 根据权利要求2所述的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：所述第 一轮RT-PCR反应体系为：浓度为20?50ng/ μ L的解链后的模板RNA溶液1. Ο μ L，10mM ISt印 Enzyme Mix，3. 4 μ L DEPC 水；所述第一轮 RT-PCR 反应条件为：50 °C 30min， 94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec，循环 20 次；所述第二轮 PCR 反应体系为： 第一轮 RT-PCR 扩增产物 10 μ L，10mM 的内巢引物 CYVCV-2f 和 CYVCV-2r 各 0. 2 μ L，2. 5 μ L 10 X PCR缓冲液，0· 2 μ L浓度为5U/ μ L的rTaq，16. 9 μ L DEPC水；所述第二轮PCR反应条 件为：94°C 2min ;94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C 45sec，循环 30 次。
4. 含有权利要求1所述引物组的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还含有 进行PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP和/或PCR缓冲液试剂。
【文档编号】C12Q1/70GK104152588SQ201410451332
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】周彦, 陈洪明, 王雪峰, 李中安, 周常勇 申请人:西南大学柑桔研究所