一种生物发酵生产2-氧代戊二酸的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明以价廉易得的豆油为原料，用解脂耶罗维亚酵母发酵生产用途广泛的2-氧代戊二酸，发酵时间短，底物比产率高，大幅度降低了生产成本，具有很好的应用前景。
【专利说明】一种生物发酵生产2-氧代戊二酸的工艺
【技术领域】
[0001] 本发明属于化工、食品添加剂产品生产领域，特别涉及是以豆油为碳源，生物发酵 生产2-氧代戊二酸的技术。
【背景技术】
[0002] 2-氧代戊二酸是一种重要用途广泛的二羧酸，例如，是合成杂环的重要中间体、食 品添加剂、运动营养饮料的重要成分、具有广泛用途的新弹性体的主要单体成份、抗骨质疏 松药物米诺膦酸的出发原料、抗肿瘤药物中间体、药物制剂辅料等。目前，2-氧代戊二酸采 用化学合成，使用了毒性很大的氰醇、或氰化物，合成路线长，副产物多。所以，随着生物技 术的迅速发展，采用生物制造技术生产2-氧代戊二酸具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 有许多细菌和酵母可以用来生产2-氧代戊二酸，例如石蜡节细菌、荧光假单胞 菌、沙雷氏菌、巨大芽孢杆菌、近平滑假丝酵母、毕赤酵母、念珠菌、解脂假丝酵母、解脂耶罗 维亚酵母等。所以，生产2-氧代戊二酸的菌株可以从相关菌种保藏机构获得，也可自行筛 选得到。
[0004] 本发明用解脂耶罗维亚酵母发酵生产2-氧代戊二酸，菌株为ATCC 20341。
[0005] 本发明以大豆油为碳源，发酵生产2-氧代戊二酸的过程如下： 发酵培养基成份（g/L) : (NH4) 2S04, 5. 0-7. 0; M gS04 · 7H20，1. 3-1. 6; Ca (N03) 2， 0.6-0. 9; NaCl, 0.4-0. 6; KH2P04, 1.5-2. 5;K2HP04, 0.15-0. 25.其它成份：维生素心， 1.0-1.3 mg/L。在发酵培养液中，要加入微量兀素营养液，pH 7.0.组成为（g/L): ZnS04 7H20,0. 18, MnS04 H20,0. 1, FeCl3,0. 35, CuS04 5H20,0. 16, CoCl2 6H20, 0. 18,加入量为l-2ml/100ml (微量元素液/发酵液）。发酵温度28-35°C，溶氧饱和度 40-60 %，用Κ0Η调节发酵过程的pH。发酵中，pH对2-氧代戊二酸生产很重要，经过大量实 验，本发明对pH采用3段控制。（1)细胞生长阶段，（2)细胞生长末期和产酸期初期，（3) 产酸期。
[0006] 发酵过程如下：菌株为ATCC 20341，种子培养，根据需要，可能有1级或多级种子 培养。在发酵罐加入培养液，装料系数为0. 65-0. 75,灭菌后，冷却至30-35°C，接种，接种量 为8-11 %，通入洁净空气，开始发酵，发酵分为3个阶段： (1) 在发酵开始后的20-25h内，此阶段为细胞生长期，调节溶氧饱和度为20-30 %，控 制豆油浓度为20-25 g /L，ph控制为5. 5-6. 5,发酵温度30-35°C ; (2) 在发酵进行20-25h后，此阶段为细胞生长期末期和产酸初期，继续发酵15-20h，即 发酵时间为35-45h时，调节溶氧饱和度为30-40%，流加加入豆油，调节豆油浓度为40-50 g /L，用 30 % Κ0Η 或 NaOH 调节 pH 为 5-5. 5,发酵温度 35-40°C ; (3) 在发酵进行35-45h后，继续发酵，此阶段主要为产酸期，用30 % Κ0Η或NaOH调节 pH为3-4、溶氧饱和度40-60%，发酵温度35-40°C，流加加入豆油，使豆油浓度为90-100 g /L，全部发酵时间为140-180h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为140-160 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至2. 6-3. 6,此时，液体中含有2-氧代戊二酸、杂质，蒸发浓缩，当2-氧代戊二酸浓度达到 260g/L时，开始结晶；将得到的粗晶体用乙醇水溶液重结晶，得到产物2-氧代戊二酸，纯度 >99%，底物的比产率为0.96-0.98 8/^(产物/底物)。
[0007] 本发明以价廉易得的豆油为原料，生产用途广泛的2-氧代戊二酸，发酵时间短， 底物比产率高，大幅度降低了生产成本，具有很好的应用前景。
[0008] 实施例1 发酵培养基成份（g/L) : (NH4) 2S04, 5. 0-7. 0; M gS04 · 7H20，1. 3-1. 6; Ca (N03) 2， 0.6-0. 9; NaCl, 0.4-0. 6; KH2P04, 1.5-2. 5;K2HP04, 0.15-0. 25.其它成份：维生素心， 1.0-1.3 mg/L。在发酵培养液中，要加入微量兀素营养液，pH 7.0.组成为（g/L): ZnS04 7H20,0. 18, MnS04 H20,0. 1, FeCl3,0. 35, CuS04 5H20,0. 16, CoCl2 6H20,0. 18, 加入量为l-2ml/100ml (微量兀素液/发酵液）。
[0009] 发酵过程如下：菌株为ATCC 20341，1级种子培养。在100L发酵罐加入培养液，装 料系数为70，灭菌后，冷却至30°C，接种，接种量为8%，通入洁净空气，开始发酵，发酵分为 3个阶段 ： (1) 在发酵开始后的20-21h内，此阶段为细胞生长期，调节溶氧饱和度为20%，控制豆 油浓度为20 g /L，ph控制为5. 5,发酵温度30°C ; (2) 在发酵进行20h后，此阶段为细胞生长期末期和产酸初期，继续发酵15h，调节溶 氧饱和度为30 %，流加加入豆油，调节豆油浓度为40 g /L，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH为 5,发酵温度35°C ; (3) 在发酵进行35h后，继续发酵，此阶段主要为产酸期，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为3、溶氧饱和度40%，发酵温度35°C，流加加入豆油，使豆油浓度为90g /L，全部发酵时间 为140h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为140 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至2. 6,液体中含有2-氧代戊二酸、杂质，蒸发浓缩，当2-氧代戊二酸钾或钠盐浓度达到 260g/L时，开始结晶；将得到的粗晶体用乙醇水溶液重结晶，得到产物2-氧代戊二酸，纯度 >99% ;底物的比产率为0· 96g/g (产物/底物)。
[0010] 实施例2 发酵液成份同实施例1。
[0011] 发酵过程如下：菌株为ATCC 20341，2级种子培养。在1000L发酵罐加入培养液， 装料系数为0. 75,灭菌后，冷却至35 °C，接种，接种量为11 %，通入洁净空气，开始发酵，发 酵分为3个阶段： (1) 在发酵开始后的25h内，此阶段为细胞生长期，调节溶氧饱和度为30 %，控制底物 豆油浓度为25 g /L，ph控制为6. 5,发酵温度35°C ; (2) 在发酵进行23-25h后，此阶段为细胞生长期末期和产酸初期，继续发酵20h，调节 溶氧饱和度为40 %，流加加入豆油，调节豆油浓度为50 g /L，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为5. 5,发酵温度40°C ; (3) 在发酵进行45h后，继续发酵，此阶段主要为产酸期，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为34、溶氧饱和度60%，发酵温度0°C，流加加入豆油，使豆油浓度为100 g /L，全部发酵时 间为180h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为160 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至3. 6,用多效蒸发器浓缩，当2-氧代戊二酸钾或钠盐浓度达到260g/L时，开始结晶；将得 到的粗晶体用乙醇水溶液重结晶，得到产物2-氧代戊二酸，纯度>99% ;底物的比产率为 0·98 g/g)。
[0012] 实施例3 发酵液成份同实施例1。
[0013] 发酵过程如下：菌株为ATCC 20341，3级种子培养。在30m3发酵罐加入培养液，装 料系数为0. 7，灭菌后，冷却至33 °C，接种，接种量为10 %，通入洁净空气，开始发酵，发酵分 为3个阶段： (1) 在发酵开始后的23-25h内，此阶段为细胞生长期，调节溶氧饱和度为28%，控制豆 油浓度为23 g /L，ph控制为6. 2,发酵温度32-35°C ; (2) 在发酵进行23h后，此阶段为细胞生长期末期和产酸初期，继续发酵17-20h，调节 溶氧饱和度为38 %，流加加入豆油，调节豆油浓度为47 g /L，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为5. 2,发酵温度37-40°C ; (3) 在发酵进行43h后，继续发酵，此阶段主要为产酸期，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为3. 7、溶氧饱和度55%，发酵温度38°C，流加加入豆油，使豆油浓度为98g /L，全部发酵时 间为175h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为158 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至3. 4,用多效蒸发器浓缩，当2-氧代戊二酸钾或钠盐浓度达到260g/L时，开始结晶；将得 到的粗晶体用乙醇水溶液重结晶，得到产物2-氧代戊二酸，纯度>99% ;底物的比产率为 0.98 g/g〇
[0014] 实施例4 发酵液成份同实施例1。
[0015] 发酵过程如下：菌株为ATCC 20341，3级种子培养。在10m3发酵罐加入培养液，装 料系数为0. 68,灭菌后，冷却至32 °C，接种，接种量为9 %，通入洁净空气，开始发酵，发酵分 为3个阶段： (1) 在发酵开始后的20-21h内，此阶段为细胞生长期，调节溶氧饱和度为23%，控制豆 油浓度为22 g /L，ph控制为5. 8,发酵温度2°C ; (2) 在发酵进行23h后，此阶段为细胞生长期末期和产酸初期，继续发酵17h，调节溶 氧饱和度为32 %，流加加入豆油，调节豆油浓度为45 g /L，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH为 5. 2,发酵温度35-38 °C ; (3) 在发酵进行40h后，继续发酵，此阶段主要为产酸期，用30 % Κ0Η或NaOH调节pH 为3. 4、溶氧饱和度53%，发酵温度37°C，流加加入豆油，使豆油浓度为97 g /L，全部发酵 时间为158h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为159 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至2. 9,此时，液体中含有2-氧代戊二酸、杂质，用多效蒸发器浓缩，当2-氧代戊二酸钾或 钠盐浓度达到260g/L时，开始结晶；将得到的粗晶体用乙醇水溶液重结晶，得到2-氧代戊 二酸，纯度>99% ;底物的比产率为0.975 g/g。
【权利要求】
1. 一种生物发酵生产2-氧代戊二酸的工艺，其特征在于以豆油为碳源，用解脂耶罗维 亚酵母发酵生产2-氧代戊二酸，其工艺过程为：种子培养；在发酵罐加入培养液，装料系数 为0. 65-0. 75,灭菌后，冷却至35-40°C，接入解脂耶罗维亚酵母，接种量为8-11 %，通入洁 净空气，开始发酵，发酵分为3个阶段： (1) 在发酵开始后的20-25h内，调节溶氧饱和度为20-30 %，控制豆油浓度为20-25 g /L，ph控制为5. 5-6. 5,发酵温度30-35°C ; (2) 在发酵进行20-25h后，继续发酵15-20h，即发酵时间为35-45h时，调节溶氧饱和 度为30-40 %，流加加入豆油，调节豆油浓度为40-50 g /L，用30 % KOH或NaOH调节pH为 5-5.5，发酵温度 35-401：; (3) 在发酵进行35-45h后，继续发酵，用30 % K0H或NaOH调节pH为3-4、溶氧饱和 度40-60%，发酵温度35-40°C，流加加入豆油，使豆油浓度为90-100 g /L，全部发酵时间为 140-180h，得到发酵液中2-氧代戊二酸浓度为140-160 g/L ; 发酵结束，用离心分离发酵液中的细胞、豆油后，用活性炭脱色，用硫酸或盐酸调节pH 至2. 6-3. 6,蒸发浓缩，当2-氧代戊二酸浓度达到260g/L时，开始结晶；将得到的粗晶体用 乙醇水溶液重结晶，得到产物2-氧代戊二酸，纯度>99% ;底物的比产率，即产物/底物为 0. 96-0. 98 g/g〇
【文档编号】C12P7/50GK104195184SQ201410451139
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月6日 优先权日:2014年9月6日
【发明者】刘均洪, 宿烽, 刘涛, 张媛媛 申请人:青岛科技大学