辐抗肽突变蛋白及其在降低炎症反应中的应用的制作方法

辐抗肽突变蛋白及其在降低炎症反应中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了辐抗肽突变蛋白及其在降低炎症反应中的应用。本发明提供了一种蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现突变辐抗肽蛋白可以降低辐抗肽蛋白引起的验证反应，将辐抗肽第292位亮氨酸突变，其主要参与结合NLRs，降低辐抗肽与NLR的结合能力，进而降低了动物注射辐抗肽后NLR通路介导的炎症性反应，但是并未明显降低TLR5介导的抗辐射生物学活性。
【专利说明】辐抗肽突变蛋白及其在降低炎症反应中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种辐抗肽突变蛋白及其在降低炎症反应中 的应用。

【背景技术】
[0002] Toll样受体（Toll-like receptor, TLR)家族在机体内参与天然免疫过程，是 一种微生物介导的先天免疫受体家族。它能够通过特异性识别细菌、病毒等病原体相 关分子模式活化 NF-kB 信号通路（Takeda K，et al.Toll-like receptors.Annu Rev Immunol, 2003, 21:335-376. Medzhitov R. Approaching the asymptote:20year later. Immunity, 2009, 3:766-775.)。TLR是Lemaitre等人在1996年研究果蝇过程中发现其在参 与由真菌感染引起的免疫应答过程并且发挥重要作用。目前研究表明，在人体内发现了 11 个TLRs家族成员，并且主要表达于免疫细胞等，揭示了大部分成员的特异性配体多为微生 物组分（Miggin SM, O'Neill LA. New insights into the regulation of TLR signaling. J Leukoc Biol, 2006, 80 (2) :220-226. )。TLR5 作为 TLRs 家族中一员，其唯一配体为细菌 的鞭毛蛋白，TLR5高表达于单核巨噬细胞、胃肠道上皮细胞、血管内皮细胞及肺上皮细胞 的细胞表面。近期研究表明，细菌鞭毛蛋白能够显著提高致死计量照射下小鼠的存活率， 并且初步证明这一防福射功能是通过激活TLR5-NF-K B信号通路而实现的（Burdelya, L. G. , et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primate models. Science, 2008, 320 (5783) : 226-30.)。其中一些细胞因子如 IL-6、G-CSF等参与了鞭毛蛋白引起的抗福射作用（Krivokrysenko VI, Identification of granulocyte colony-stimulating factor and interleukin_6as candidate biomarkers of CBLB502efficacy as a medical radiation countermeasure. J Pharmacol Exp Ther. 2012Nov ;343(2) :497-508)。然而还有其他一些细胞因子如IL-I和IL-18等也可以 被鞭毛蛋白所诱导而在血液中升高，这些因子多参与炎症反应，导致各种免疫性副反应。
[0003] 辐抗肽（CBLB502)是细菌鞭毛蛋白经过人工修饰改构后的一种重组蛋白， 分子量约为31KD。此蛋白仍具有较高的防辐射功能并且于细菌鞭毛蛋白相比具有 较低的免疫原性，其在室温情况下保存较长时间也不会丧失其生物学活性，对于开发 福射防护药物提供了新的方向（Burdelya，L.G.，et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primate models. Science, 2008, 320 (5783) :226-30.)。但由于辐抗肽蛋白通过TLR以及NLR刺激多种细胞 因子，除了发挥抗辐射作用，其中部分细胞因子还参与炎症反应，可导致产生感冒综合征样 副反应。
[0004] 研究表明鞭毛蛋白在体内不仅能与细胞表明的TLR5受体结合发挥抗辐射作用 以及参与免疫反应，还与体内核苷酸结合寡聚化结构域受体（Nod-like receptors或 NLRs)家族中NLRC4和NAIP5(神经元凋亡抑制蛋白5)两个成员结合（Mariathasan S，et al.Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature，2004, 430:213-218 ;Lightfield KL，et al. Critical function for Naip5in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nat Immunol，2008, 9:1171-1178.)，参与机体内免疫应答过程。NLRs家族是一组进化上保守的 胞内模式识别受体在机体先天免疫和生理反应发挥着至关重要的作用，其普遍存在于动物 和植物体内。
[0005] 鞭毛蛋白411位异亮氨酸参与结合TLR5,该氨基酸突变后TLR5结合能力减弱；而 470位亮氨酸突主要参与结合NLRs，该氨基酸突变后NLR结合能力减弱，当将这两位氨基 酸同时突变则丧失生物学活性（Garaude J，et al. Simultaneous targeting of Toll-and Nod-like receptors induces effective tumor-specific immuneresponses. Sci Transl Med，2012, 4 (120) : 120ral6.)。鞭毛蛋白通过与TLR5受体结合，激活体内NF-K B信号通路 来实现其辐射防护功能，而NLR在体内参与免疫应答过程，多介导炎症细胞因子反应。
[0006] 辐抗肽蛋白来源于沙门氏菌鞭毛蛋白，具有显著的抗辐射作用。研究表明辐抗肽 通过细胞表面的TLR5受体激活NF- K B信号通路抑制细胞凋亡参与抗辐射作用。


【发明内容】

[0007] 本发明的一个目的是提供一种辐抗肽突变蛋白。
[0008] 本发明提供的蛋白，为辐抗肽突变体L292A，是如下（a)或（b):
[0009] (a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] (b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
[0011] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过1〇个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围，其是如下⑴-⑶中任一种的 DNA分子：
[0013] (1)编码区为序列表中的序列3所示的DNA分子；
[0014] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的蛋白的DNA分子；
[0015] (3)与⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0016] 上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0017] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0018] 上述蛋白在制备抑制其免疫动物引发的炎症反应产品中的应用也是本发明保护 的范围。
[0019] 或上述蛋白在制备免疫原中的应用，该应用中所述蛋白抑制由其免疫动物引发的 炎症反应，也是本发明保护的范围。
[0020] 上述应用中，所述抑制其免疫动物引发的炎症反应为不激活炎症反应因子IL-18 活性。
[0021] 辐抗肽第292位氨基酸相当于鞭毛蛋白中的470位氨基酸，参与结合NLRs，辐抗肽 第292位氨基酸突变后形成辐抗肽突变体L292A，其激活NF- K B信号通路能力较辐抗肽蛋 白相比略有降低，辐射防护能力略有降低。但是血液中炎症因子IL-18的水平与PBS对照 相当，其它细胞因子如G-CSF、KC与未突变蛋白相比未见明显改变，可以看出其不激活炎症 因子IL-18活性，或者与未突变的辐抗肽相比，降低了激活炎症因子IL-18活性。
[0022] 上述蛋白在制备动物抗辐射产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0023] 上述应用中，所述辐射为由6tlCo Y射线引起的辐射。
[0024] 上述应用中，所述动物为人或鼠；所述动物具体为小鼠。
[0025] 上述应用中，所述产品为药物。
[0026] 本发明的实验证明，本发明将辐抗肽第292位亮氨酸突变得到突变辐抗肽蛋白， 降低辐抗肽与NLR的结合能力，进而降低了动物注射辐抗肽后NLR通路介导的炎症性反应， 但是并未明显降低TLR5介导的抗辐射生物学活性。本发明的关键在于利用辐抗肽蛋白通 过TLR通路而非NLR通路发挥抗辐射作用，通过改变辐抗肽中影响NLR结合能力的氨基酸， 使得突变辐抗肽蛋白不能通过NLR激活相应的炎症因子，从而实现降低辐抗肽蛋白导致的 炎症反应。本发明产生的突变辐抗肽蛋白与未突变蛋白相比，作用机制明显，通过降低辐抗 肽与NLR的结合，降低或者消除NLR介导的已知或者未知的炎症因子所带来的副反应。
[0027] 因此，改变辐抗肽蛋白中参与NLR受体结合的292位氨基酸，在不明显降低辐抗肽 抗辐射活性的同时，明显降低辐抗肽激活炎症因子例如IL-18的能力，即降低了辐抗肽蛋 白作为抗辐射药物的副反应能力。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1为辐抗肽及突变蛋白诱导表达后纯化产物的SDS-PAGE电泳鉴定结果
[0029] 图2为福抗肽及突变蛋白诱导表达后纯化产物的westernblot鉴定结果
[0030] 图3为辐抗肽蛋白生物学活性测定
[0031] 图4为辐抗肽小鼠辐射防护效果
[0032] 图5为辐抗肽给药对照射后小鼠外周血血象的影响
[0033] 图6为小鼠注射辐抗肽后血液中细胞因子变化
[0034] 图7为小鼠注射福抗肤后存活率

【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1、辐抗肽突变体L292A的获得
[0038] -、表达辐抗肽突变体L292A载体的获得
[0039] 合成下列点突变引物：
[0040] 辐抗肽-I213A-F :TAACCCACTGGCTTCAe￡TGAITCTGCAITGTCA
[0041] 辐抗肽-1213A-R :TGACAATGCAGAATCAGCTGAAGCCAGTGGGTTA
[0042] 辐抗肽-L292A-F ：TTCCGCAAAACGTCGCGTCTTTACTGCGTTA
[0043] 辐抗肽-L292A-R :TAACGCAGTAAAGACGCGACGITITGCGGAA
[0044] 为了将辐抗肽全长序列克隆到pBV220原核表达载体，采用PCR方法，以 PMD-18T-FKT(王治东等，CBLB502蛋白原核表达及辐射防护作用验证，中华放射医学与防 护杂志，2010 (30) 4:169-172,公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研 究所获得）为模板，以上述含有相应酶切位点的辐抗肽特异性引物扩增了辐抗肽的全长序 列，分别获得了大小均约为891bp的DNA片段1和DNA片段2。
[0045] 经过测序，DNA片段1的核苷酸序列为序列表中序列1，为辐抗肽突变体I213A的 编码基因，编码的蛋白为辐抗肽突变体I213A，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2 ;
[0046] DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列3,为辐抗肽突变体L292A编码基因，编 码的蛋白为辐抗肽突变体L292A，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4 ;
[0047] 辐抗肽的氨基酸序列为序列表中序列6,其编码基因的核苷酸序列为序列表中序 列5。
[0048] 辐抗肽突变体L292A为将辐抗肽的氨基酸序列6第292位的赖氨酸（L)突变为丙 氨酸（A);辐抗肽突变体L292A编码基因为将辐抗肽编码基因的核苷酸序列5第874位的 CTC突变为GCG。
[0049] 辐抗肽突变体I213A为将辐抗肽的氨基酸序列6第213位的异亮氨酸（I)突变为 丙氨酸（A);辐抗肽突变体I213A编码基因为将辐抗肽编码基因的核苷酸序列5第637位 的ATT突变为GCT。
[0050] 将上述DNA片段1用Sal I和Smal I限制性内切酶进行双酶切，得到的酶切产 物与经过同样酶切的PBV220表达载体（优宝生物公司，VT1297)连接，得到的连接产物 转化入JM-109感受态细胞中，在含有氨苄抗生素的LB平板，30°C过夜培养，挑取克隆进 行扩增培养，提取质粒DNA后，经测序，该质粒为将序列表中序列1所示的辐抗肽突变体 I213A的编码基因插入pBV220表达载体的Sal I和Smal I酶切位点得到的载体，命名为 PBV220-I213A ；
[0051] 采用同样的方法将DNA片段2入pBV220表达载体的Sal I和Smal I酶切位点得 到的载体，命名为PBV220-L292A。
[0052] 采用同样的方法将辐抗肽编码基因（序列5)插入pBV220表达载体的Sal I和 Smal I酶切位点得到的载体，命名为pBV220-A。
[0053] 二、辐抗肽突变体I213A和L292A的诱导表达和纯化
[0054] 将上述pBV220-A、pBV220-I213A和pBV220-L292A分别转化到BL21大肠杆菌中建 立表达工程菌，得到重组菌 BL21/pBV220-A、BL21/pBV220-I213A 和 BL21/pBV220-L292A，分 别提取质粒测序验证阳性菌。
[0055] 重组菌 BL21/pBV220-A、BL21/pBV220-I213A 和 BL21/pBV220-L292A 按照常规方法 进行诱导表达，经超声破碎，包涵体清洗，DEAE阴离子交换层析纯化后，得到辐抗肽A、辐抗 肽突变体I213A和辐抗肽突变体L292A。
[0056] 以SDS-PAGE电泳鉴定纯化后的辐抗肽A、辐抗肽突变体I213A和辐抗肽突变体 L292A，结果如图1所示，M为蛋白分子量标准、1为辐抗肽、2为辐抗肽突变体I213A、3为辐 抗肽突变体L292A，可以看出，得到目标蛋白分子量均约为31KD。
[0057] 三、Western blot鉴定纯化后福抗肽蛋白及突变蛋白
[0058] 取福抗肽、福抗肽突变体I213A、福抗肽突变体L292A经Loading Buffer沸水煮 5min，进行12% SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V ;同时电泳结束后， 转移到PVDF膜上，室温封闭2h，l : 2000 -抗4°C过夜；TBST溶液洗涤4次，1 : 4000二 抗4°C 2h ;TBS清洗后，ECL显色，并于暗室中曝光、显影、定影。
[0059] 结果如图2所示，1 :辐抗肽2 :辐抗肽突变体I213A3 :辐抗肽突变体L292A，可以看 至IJ，得到目标蛋白分子量均约为31KD。
[0060] 实施例2、辐抗肽突变体L292A在降低其引起的炎症反应中的应用
[0061]1、辐抗肽突变体L292A的活性检测
[0062] 采用碱性磷酸酶报告基因检测，具体如下：
[0063]复苏HEK293T细胞，并在孵育箱中以37°C，5% CO2条件下，用H-DMEM培养基常规 培养。当24孔板中的293T细胞培养至细胞密度达到70%，每孔细胞转染50ng pcDNA-3. 1/ hTLR5质粒（王磊等，Tol 1样受体5激动剂CBLB502蛋白的辐射防护作用，国际药学研究杂 志2012年6月第39卷第3期，225-230,公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与 辐射医学研究所获得）、IOOnglOOng pNF-K B/SEAP 质粒（MGENEX，MK-515)、2ng pRL-TK 质粒（Promega公司，E2241)共转293T细胞。转染试剂和质粒分别用25ul无血清H-DMEM 培养基稀释。转染试剂稀释后室温静置5min，将转染试剂与质粒混匀，室温静置15min，每 孔加入该混合液50ul ;
[0064] 转染24h后，向培养板中加入不同浓度梯度的辐抗肽蛋白、辐抗肽突变体I213A蛋 白、辐抗肽突变体L292A蛋白，以无血清H-DMEM培养基为阴性对照；刺激12h后，PBS洗细 胞，加入 lOOullXPassive lysis buffer，室温裂解 15min;
[0065] 结果测定：细胞刺激12h后，吸取上清IOul于96孔板中，加入IOul注射用水，根 据试剂盒说明书测定碱性磷酸酶活性，其活性强弱以405nm下的吸光值来表示。
[0066] 结果见图3,辐抗肽蛋白、辐抗肽突变体I213A蛋白、辐抗肽突变体L292A蛋白的生 物学活性分别为 7. 63 X l(T6Units、6. 06 X KT5Units 和 6. 71 X KT6Units15
[0067] 2、辐抗肽突变体L292A在降低其引起的炎症反应
[0068] 采用细胞因子酶联免疫分析（ELISA)检测炎症反应因子表达量，具体如下：
[0069] 选取C56BL/6雄性小鼠，18?22g，随机分组如下，每组20只小鼠：
[0070]PBS组：每只小鼠腹腔注射（10mM，pH7. 4) PBS ;
[0071] 辐抗肽蛋白组：每只小鼠腹腔注射4ug辐抗肽蛋白（溶解到PBS中）；
[0072] 辐抗肽突变体I213A蛋白组：每只小鼠腹腔注射4ug辐抗肽突变体I213A蛋白（溶 解到PBS中）；
[0073] 辐抗肽突变体L292A蛋白组：每只小鼠腹腔注射4ug辐抗肽突变体L292A蛋白（溶 解到PBS中）；
[0074] 2h后摘眼球取血，用ELISA法检测TNFa、KC、G-CSF、IL-18等细胞因子的水平。 检测过程和方法按照ELISA试剂盒说明书进行。
[0075] 结果见图4,其中，1为PBS ;2为辐抗肽；3为辐抗肽突变体I213A4 :辐抗肽突变体 L292A ;辐抗肽突变体I213A组各细胞因子与PBS组相比均明显升高，与辐抗肽组接近；辐 抗肽突变体L292A组除了 IL-18外各细胞因子与PBS组相比均明显升高，与辐抗肽组接近， 辐抗肽突变体L292A组的IL-18与PBS对照组相当，未被激活。表明辐抗肽突变体L292A 不激活炎症反应因子IL-18活性，进而降低其引起的炎症反应。
[0076] 3、辐抗肽突变体L292A在抗辐射中的应用
[0077] 对6tlCo Y射线照射后小鼠存活率以及血象的分析
[0078] C57BL/6雄性小鼠随机分为5组，每组12只小鼠：
[0079] PBS组：每只小鼠腹腔注射10mM，pH7. 4PBS ;
[0080] 辐抗肽蛋白组：每只小鼠皮下给药注射4ug辐抗肽蛋白（溶解到PBS中）；
[0081] 辐抗肽突变体I213A蛋白组：每只小鼠皮下给药注射4ug辐抗肽突变体I213A蛋 白（溶解到PBS中）；
[0082] 辐抗肽突变体L292A蛋白组：每只小鼠皮下给药注射4ug辐抗肽突变体L292A蛋 白（溶解到PBS中）；
[0083] Ih后，利用军事医学科学院放射与辐射医学研究所6tlCoY射线照射源对所有小鼠 进行8.OGy-次性全身照射，照射后30天检测血象变化并内观察其存活情况并记录。
[0084] 辐抗肽与突变蛋白对照射后小鼠外周血象的影响结果见图5所示，A :血红蛋白； B :血小板；C :红细胞；D :白细胞，可以看出，经6. 5Gy60C〇 Y射线照射后小鼠外周血白细胞 (WBC)于照射后第3天急剧下降，PBS阴性对照组白细胞水平在照后第5天达到最低值，持 续到到第19天开始逐渐恢复。辐抗肽组、辐抗肽突变体I213A组、辐抗肽突变体L292A组白 细胞水平分别于照后第3、3、3天达到最低值，持续到第10、12、10天开始逐渐恢复。照射后 小鼠PBS阴性对照组外周血红细胞（RBC)于照后第5天显著下降，到第12天达到最小值，到 第26天恢复正常。辐抗肽组、辐抗肽突变体I213A组、辐抗肽突变体L292A组红细胞水平 分别于照后第5、5、5天达到最小值后开始恢复，到第15、23、15恢复正常。照射后小鼠外周 血中血小板（PLT)水平，PBS阴性对照组在照后第5天达到最低值，辐抗肽组、辐抗肽突变体 I213A组、辐抗肽突变体L292A组血小板水平分别于照后第10、12、10天达到最低值并开始 恢复。照射后各组血红蛋白水平开始下降，PBS阴性对照组、辐抗肽组、辐抗肽突变体I213A 组、辐抗肽突变体L292A组分别于照后第15、5、10、5达到最低值后开始恢复。总体而言，辐 抗肽突变体I213A组小鼠外周血各项指标在照射后开始恢复的时间均晚于辐抗肽组，而且 外周血各项指标最低值低于辐抗肽组；辐抗肽突变体L292A组小鼠外周血各项指标的最低 值以及恢复时间与辐抗肽组基本一致。
[0085] 图6为辐抗肽与突变蛋白对细胞因子的影响，其中，1为PBS ;2为辐抗肽；3为辐 抗肽突变体I213A4 :辐抗肽突变体L292A，可以看出，辐抗肽突变体I213A组各细胞因子与 PBS组相比均明显升高，与辐抗肽组接近。辐抗肽突变体L292A组除了 IL-18外各细胞因子 与PBS组相比均明显升高，与辐抗肽组接近，而IL-18与PBS对照组相当，未被激活。
[0086] 统计各组存活率如图7所示，PBS组、辐抗肽组、辐抗肽突变体I213A组和辐抗肽 突变体L292A组存活率分别为0、100%、58. 3%、91. 7%。辐抗肽组、辐抗肽突变体组存活率 明显高于PBS。
【权利要求】
1. 一种蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下（1)-⑶中任一 种的DNA分子： (1) 编码区为序列表中的序列3所示的DNA分子； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的蛋白的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99 %同源性且具有相同功能的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. 权利要求1所述蛋白在制备抑制由其免疫动物引发的炎症反应产品中的应用； 或权利要求1所述蛋白在制备免疫原中的应用，该应用中所述蛋白抑制由其免疫动物 引发的炎症反应。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抑制其免疫动物引发的炎症反应为 不激活炎症反应因子IL-18活性。
7. 权利要求1所述蛋白在制备动物抗辐射产品中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述辐射为由6°C〇y射线引起的辐射。
9. 根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于：所述动物为人或鼠；所述动物具 体为小鼠。
10. 根据权利要求5-9中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
【文档编号】C12N1/19GK104262482SQ201410458194
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】杨晓明, 葛常辉, 詹逸群, 来丽丽, 王磊 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所