一种构建桡足类全长cDNA文库的方法
【专利摘要】本发明公开了一种构建桡足类全长cDNA文库的方法。本发明以少量桡足类个体为材料提取高质量的RNA后，以Modified oligo dT为引物，反转录获得第一链cDNA；然后以桡足类的信使RNA反式剪接前导Spliced leader简称为SL的序列为基础，设计正向简并引物Copepod SL，以Modified oligo dT上接头Adaptor序列为反向引物，以第一链cDNA为模板，进行25-35个循环的PCR扩增，经过常规的连接转化克隆过程，获得该桡足类的全长cDNA文库。本发明桡足类全长cDNA文库构建方法所需样品量少，效率高，方法简便，易于操作，适用于桡足类分子生态学研究，方便和促进功能基因的快速、准确筛选。
【专利说明】一种构建桡足类全长cDNA文库的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种构建桡足类全长CDNA文库的方法。
【背景技术】
[0003]桡足类是广泛存在于海洋和淡水环境中的小型甲壳动物。作为次级生产力的重要组成部分，桡足类是水生生态系统食物网中的重要环节，在初级生产者和更高营养级之间起着承上启下的作用；另外，桡足类通过摄食、呼吸和排泄等过程成为微食物环的重要环节。对海洋学者来说，研究及预测海洋生物个体及更大尺度上对环境变化的响应是一项极大的挑战，而在分子水平上深入认识个体及群体的响应是探究生物对环境变化适应机制的关键。桡足类具有个体小，生命周期短、对环境变化敏感，生活史策略多样，分布广泛等特点，是研究各种重要生物过程分子机制的理想实验生物。遗憾的是，由于桡足类基因组的复杂性，其基因信息非常匮乏，针对桡足类基因组结构及基因表达调控机制的研究很少。
[0004]转录组测序研究是全基因组测序的替代手段。桡足类不同发育阶段及应对环境变化的转录组特征研究是认识其生活史和生理功能调控机制的关键。全长cDNA序列是鉴定基因功能所必须的。通过在线或本地的序列比对、编码区预测、识别功能蛋白结构域等方法可大大提高鉴定已知或未知蛋白编码基因的几率。当非模式生物或野外样品转录组中大量序列与已报道的DNA数据库中序列无明确匹配时，全长cDNA序列尤其重要。在前人的研究中已发现眼虫、线虫、扁形动物、刺胞动物、轮虫、海鞘、甲藻等生物中存在信使RNA的剪接前导(Spliced leader, SL)反式剪接现象。由于SL序列在成熟的mRNA上普遍存在，为得到cDNA的全长序列提供了方便；同时SL序列具有谱系特异性，因此在涉及谱系特异性的转录组研究，尤其当目标种与其它生物共存时，SL序列是非常有用的工具。
[0005]构建全长cDNA文库是筛选功能基因全长cDNA序列的重要方法，是进行功能基因组学研究的基本手段。常规的构建全长cDNA文库的方法普遍存在材料用量多、耗时长、步骤繁琐的特点。由于桡足类等小型甲壳动物个体小，单个体RNA含量少，常规的全长cDNA文库构建法通常需要几千个个体，通过野外采样的方法难以获得足够数量。另外，桡足类体表经常有寄生性纤毛虫，真菌类，藻类等生物附着，桡足类本身也摄食各种各样的饵料生物,常规的cDNA文库构建方法无法排除这些生物的存在对桡足类cDNA文库序列造成的污染。因此建立一种适用于桡足类的、可高效构建全长cDNA文库的方法将极大提高其功能基因组学研究的效率。
【发明内容】
[0006]针对上述【技术领域】的现状，本发明提供了一种构建桡足类全长cDNA文库的方法，以实现构建桡足类全长cDNA文库所需样品量少，效率高，方法简便，易于操作，适用于桡足类分子生态学研究，方便和促进功能基因的快速、准确筛选。
[0007]为实现上述发明目的，本发明通过如下技术方案予以实现:
一种构建桡足类全长cDNA文库的方法，具体步骤包括如下:
(1)桡足类RNA的提取:以桡足类个体为材料提取高质量的RNA，所需桡足类个体少量即可；
(2)反转录:以Modifiedoligo dT为引物反转录合成cDNA第一链；
其中所述 cDNA 第一链的合成引物 Modified oligo dT: 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)16VN-3’ ；
(3)PCR扩增:利用桡足类反式剪切前导序列SL设计正向引物Cop印odSL，与Modifiedoligo dT上接头序列构成的反向引物Adaptor组成引物对，以cDNA第一链为模板，PCR扩增25-35个循环；
其中所述桡足类反式剪切前导序列SL: 5’ -GTCTAAWACGACCAAGCTWAffffTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3，;
其中PCR扩增体系引物组合包括如下:
所述正向引物 Cop印od SL: 5’ -GTCTAAWACGACCAAGCTWAffffTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGA
G-3’
所述反向引物 Adaptor: 5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，
(4)cDNA文库的构建:将PCR反应产物回收进行常规的连接转化克隆过程。
[0008]进一步的，上述构建桡足类全长cDNA文库的方法中，步骤(3)所述PCR扩增体系总体积为25 μ L，包括如下组分:
1XBuffer2.5 μ L
25mM dNTPs2 μ L
5 μ M Copepod SLI μ L
5 μ M AdaptorI μ L
2.5U/μ I Hot start Taq 0.2 μ L cDNA 模板IyL
超纯水17.5 μ L
1XBuffer中含Mg2+, 2.5U/ μ I Hot start Taq酶的体积不列入扩增体系内。
[0009]进一步的，上述构建桡足类全长cDNA文库的方法中，步骤(3)所述PCR扩增包括如下反应程序:
第一阶段，变性95°C，2min ；
第二阶段，95°C/15s，68°C/30s，72°C/2.5min，5 个循环；
第三阶段，95°C/15s，60°C/30s，72°C/2.5min，20-30 个循环；
第四阶段，72° C，1min ；
第五阶段，15° C保温。
[0010]本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果:
1.所需样品量少，可构建单只桡足类的全长CDNA文库，为研究桡足类个体对环境变化的响应机制提供了重要工具；方法简单，耗时短，合成cDNA第一链后，利用本发明中的特定引物对进行扩增，再将PCR产物进行常规的连接转化克隆，即可完成文库构建。
[0011]2.本发明中所用的SL序列具有谱系特异性，当目标桡足类与环境中其它物种共同存在时，构建SL-cDNA文库可方便的获取目标种的转录组信息。
[0012]3.SL- cDNA文库中基因种类丰富，皆为全长序列，通过在线或本地的序列比对，编码区预测，识别功能蛋白结构域等方法可大大提高识别已知或未知蛋白编码基因的几率。
[0013]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
λ.Μ
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[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为使用本发明扩增太平洋纺锤水蚤dariia)的全长cDNA的PCR产物电泳结果。
[0016]图2为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤无机焦磷酸酶(Inorganicpyrophosphatase)全长 cDNA 序列及 Blastx 结果。
[0017]图3为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)全长cDNA序列及Blastx结果。
[0018]图4为使用本发明得到的太平洋纺锤水蚤cDNA文库基因功能注释分类(分子功能)图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
[0020]实施例1
利用上述方法快速高效的构建了太平洋纺锤水蚤全长cDNA文库，并基于NCBI数据库和Blast2Go软件对文库进行了分析。具体步骤如下:
(一)桡足类RNA提取:
提取高质量的桡足类总RNA，步骤简述如下:
(I)样品固定。桡足类样品使用Trizol试剂在1.5ml离心管(a)中进行固定。
[0021](2)样品匀浆。将管(a)中大部分Trizol转移至离心管(b)中，用研磨棒匀浆样品。将Trizol转移回管(a)中，转移过程中润洗研磨棒，混匀后离心，上清液转移至管(b)。再次研磨1-2次。
[0022](3)上清液转移回管(a)中，加入200 μ I氯仿，涡旋混匀lmin, 4° C 1000g离心15min。
[0023](4)在管(C)加入等体积的苯酚/氯仿(体积比为5:2)的抽提液，将管(a)中上清液小心转移到抽提液中，涡旋混匀，4° C 1000g离心5min。重复这一步骤2次，最后一次离心时温度调整到室温，得到粗RNA溶液。
[0024](5)在粗RNA溶液中加入等体积的100%乙醇，混匀，过柱子(Zymo)。
[0025](6) 350 μ I 的 prewash buffer 清洗柱子(Zymo)两次。
[0026](7) 500 μ I 的 washing buffer 清洗柱子(Zymo)—次。
[0027](8) 40 μ IDEPC 水溶解 RNA。
[0028](9)使用 NanoDrop ? 2000C (Thermo Scientific)分光光度计测定 RNA 溶液浓度。
[0029](二)cDNA 第一链合成:
(1)在管中依次加入下述组分建立反应体系:
RNA8μ L(l.5μ g)
dNTP Mix (1mM)I μ L
Modified oligo dT (100 μ M) I μ L
(2)65° C温育5 min，冰上放置2min ；
(3)依次加入下述组分于上述10μ L混合体系中，并混匀，42°C温育Ih ；
5XBuffer4 μ L
MgC12(25mM)4μ L
DEPC 水IyL
ImProm-1I ? Reverse Transcriptase IuL
(4)70°C，1min终止反应，进行纯化或保存在-20°C。
[0030](三)纯化cDNA第一链
使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit (Zymo)进行 cDNA 的纯化。
[0031](四)桡足类全长cDNA的PCR扩增 PCR体系扩增组分比例如下:
10X Buffer(MgC12 plus)2.5 μ L
dNTPs(25mM)2 μ L
正向引物 Copepod SL (5 μ M) IyL 反向引物 Adaptor (5 μ M) IuL Hotstart Taq (2.5U/μ L)0.2 μ L
cDNA 模板IyL
超纯水17.5yL
PCR扩增条件如下:95° C变性2分钟；95° C变性15秒，68° C退火30秒，72° C延伸2.5分钟，共计5个循环；95° C变性15秒，60° C退火30秒，72° C延伸2.5分钟，共计20个循环；72°C延伸10分钟；15°C保温。
[0032]该过程循环数与起始RNA含量有关:若RNA〈30ng，需反应30个循环，若RNA30-300ng，需反应25个循环，若RNA>300ng，则20个循环即可。
[0033](五)琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物
(I)凝胶电泳:制备浓度为1%的凝胶进行电泳。
[0034](2)切胶:在弱紫外光下将含有PCR产物的凝胶切下，置于离心管中。
[0035](3)在离心管中加入3倍体积的6M NaI溶液，放入恒温金属浴中55°C融化。
[0036](4)使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit (Zymo)试剂盒进行纯化。
[0037]图1为使用本发明扩增太平洋纺锤水蚤的全长cDNA的PCR产物电泳结果。
[0038](六)连接、转化与克隆培养
使用Invitrogen Τ0Ρ0 cloning试剂盒进行胶回收产物连接、转化与克隆培养。
[0039](七)质粒提取与测序
克隆培养后抽提质粒DNA，并送至基因测序公司进行测序。
[0040](A)序列分析
结果显示，使用本发明获得了太平洋纺锤水蚤全长CDNA文库中部分基因的全长CDNA序列。所得到的编号I无机焦磷酸酶的全长cDNA序列具体如序列表中序列I所示；所得到的编号2超氧化物歧化酶的全长cDNA序列具体如序列表中序列2所示。
[0041]图2为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤无机焦磷酸酶全长cDNA序列及Blastx结果。
[0042]图3为使用本发明获得的太平洋纺锤水蚤超氧化物歧化酶全长cDNA序列及Blastx 结果。
[0043]综上所述，本发明建立了一种构建桡足类全长cDNA文库的方法，具体包括合成cDNA第一链的反转录引物和cDNA第一链进行PCR扩增的引物组合(Cop印od SL:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCffffYAAGAG-3’、Adaptor:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’)、PCR扩增组分和比例、PCR扩增程序三个方面。利用本技术已成功进行了包括太平洋纺锤水蚤、中华哲水蚤、背针胸刺水蚤等在内的多种桡足类的全长cDNA文库构建，使用的桡足类数目1-100只不等，结果表明:本方法所需材料少，少量的桡足类即可完成文库构建；通过PCR反应，可扩增cDNA中0.3-3kb的序列；通过质粒克隆测序，可得到上述桡足类位于细胞中不同部位，参与不同的分子功能和生物学过程的全长基因cDNA序列。这将为研究不同桡足类在环境压力下的基因表达，进而研究其在分子水平上的适应机制提供了重要基础，必将大大推动桡足类基因组学和转录组学的研究。
[0044]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种构建桡足类全长CDNA文库的方法，其特征在于:具体步骤包括如下: (1)桡足类RNA的提取:以桡足类个体为材料提取高质量的RNA，所需桡足类个体少量即可； (2)反转录:以Modifiedoligo dT为引物反转录合成cDNA第一链； 其中所述 cDNA 第一链的合成引物 Modified oligo dT: 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)16VN-3’ ； (3)PCR扩增:利用桡足类反式剪切前导序列SL设计正向简并引物Cop印od SL，与Modified oligo dT上的Adaptor组成引物对，以cDNA第一链为模板，PCR扩增25-35个循环； 其中所述桡足类反式剪切前导序列SL序列为:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3，; 其中PCR扩增体系引物组合包括如下: 所述正向简并引物 Cop印od SL 序列为:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3， 所述反向引物 Adaptor 序列为:5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ (4)cDNA文库的构建:将PCR反应产物回收进行常规的连接转化克隆等过程。
2.根据权利要求1所述的一种构建桡足类全长cDNA文库的方法，其特征在于:所述步骤(3)中PCR扩增体系的总体积为25 μ L，包括如下组分: 1XBuffer2.5 μ L 25mM dNTPs2 μ L 5 μ M Copepod SLI μ L 5 μ M AdaptorI μ L
2.5U/μ L Hot start Taq 0.2 μ L
cDNA 模板IyL
超纯水 17.5 μ L
1XBuffer 中含 Mg2+。
3.根据权利要求1或2所述的一种构建桡足类全长cDNA文库的方法，其特征在于:所述步骤(3) PCR扩增包括如下反应程序: 第一阶段，变性95°C，2min ； 第二阶段，95°C/15s，68°C/30s，72°C/2.5min，5 个循环； 第三阶段，95°C/15s，60°C/30s，72°C/2.5min，20-30 个循环； 第四阶段，72° C，1min ； 第五阶段，15° C保温。
【文档编号】C12N15/10GK104278023SQ201410496556
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】刘光兴, 张寰, 杨菲菲, 徐东晖, 黄有松, 衣晓燕 申请人:中国海洋大学