一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株副猪嗜血杆菌GX0905(血清13型)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2014125。该菌株生物学性能稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
CCTCC NO: M 2014125
20140410
【专利说明】一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物免疫领域，具体地说，涉及一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病（Glasser ' sdisease)，由副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis，Hps)引起。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已 在全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因 之一。在美国，该病已成为危害保育猪群健康的重要传染病，与蓝耳病（PRRS)、圆环病毒 (PCV)并列为第一位，排在流感、链球菌和大肠杆菌病之前。该病目前也给中国猪群带来很 大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，蓝耳病）的流行，副猪嗜血杆菌病给猪群造成的 损失比以往更为严重，而爆发性的副猪嗜血杆菌病也比以往更为普遍。
[0003] Hps只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄?4月龄的猪，主要在断奶前 后和保育舍阶段发病，常见于5?8周龄，感染高峰通常见于保育期的4?6周，有些可早 在保育舍内最初2周时就开始出现，并一直持续到肥育期早期，发病率可达40%，严重时死 亡率可达50%。与以往相比，本病的流行特点已经发生改变。以前本病是零星散发发生的， 且与断奶猪的应激有关，但目前此病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势，呈现地方流行 性，而且常与猪的几种重要病原体并发感染，如与猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及 猪圆环病毒引起混合感染。
[0004] Hps是一种细小杆菌，在显微镜下呈多形态，非溶血性，不运动，无芽孢，无鞭毛，革 兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链状，在陈旧培养物中多呈多 形态，有长杆状和丝状。Hps属于需氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为35?37°C，pH7. 6? 7. 8, C023%?5%。在适宜培养基上生长的菌落呈圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，灰白色 半透明，针尖大小。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）， 不需要X因子。在巧克力培养基上生长较差，在加 NAD、马血清的M96支原体培养基或加酵 母浸出物的PPLO培养基上生长良好。目前副猪嗜血杆菌至少有15种血清型，其中血清1、 5、10、12、13、14型毒力最强，2、4、8、15型具有中等毒力，3、6、7、9、11型不能引起临床感染。 从世界范围内看，血清4、5、13型最为流行，日本、德国、美国、西班牙、加拿大和中国以血清 4型和5型最常见，澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为血清5型和13型，但临床分离菌中约 20%无法定型。但最新的研宄结果表明，危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改变，在 美国的猪场中血清5型不再广泛流行，而以血清4型（39%)和不能分型的分离株（27%) 最为流行。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。邱 8毒力和致病性可能 与细菌毒素有关，但至今这方面的报道很少。副猪嗜血杆菌是否只产生巴氏杆菌科的一些 非常重要的毒力因子如荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及它们与本菌的毒力是否有关，目 前还知之甚少。
[0005] 我国是猪肉消费大国，猪肉的消费占总体肉食消费的80%以上，生猪价格的波动 会严重影响居民消费指数。目前曾严重影响我国养猪业的猪瘟、高致病性蓝耳病、猪圆环病 毒病等已经得到有效控制，但以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加 重。从而导致大量使用抗生素进行治疗，结果是：一方面导致猪产品抗生素超标，危害人的 身体健康，另一方面导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜血杆菌， 非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。国外研宄 表明，用同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副猪 嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研宄，显示了很好的防治效 果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效 预防本病的发生。血清13型副猪嗜血杆菌致病力较强，在世界范围内流行最广，在我国也 流行最广泛，引起的危害也最大。同为13型的不同副猪嗜血杆菌菌株毒力不同，免疫原性 也不同，所以，通过动物试验筛选出一株毒力强、免疫原性好的菌株是制备副猪嗜血杆菌灭 活疫苗的关键技术。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株毒力强、免疫原性好 的血清13型副猪嗜血杆菌及其应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明首先提供一株血清13型副猪嗜血杆菌GX0905,分类命名为副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis)GX0905(血清13型），已于2014年4月10日保藏于中国典型培养 物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO: M2014125。
[0009] 该菌株是发明人于2010年9月在河南省郑州市一猪场发病猪分离获得的一株副 猪嗜血杆菌，经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清13型。培养该菌株，经甲醛灭活，与 适宜的佐剂混合，制成单价灭活疫苗，经动物试验表明，该菌株具有较强毒力和很好免疫原 性。
[0010] 所述血清13型副猪嗜血杆菌株GX0905与其他13型副猪嗜血杆菌比较具有如下 生物学特性：
[0011] 1.致病力强用该菌腹腔注射攻击16g?20g健康Balb/c小鼠，剂量为 5.0X109CFU/只，可导致70%以上小鼠死亡。用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易 感仔猪，剂量为5. OXlO9CFU/只，可导致100 %以上仔猪发病或死亡。
[0012] 2.免疫原性好灭活该菌，与白油佐剂1 :2乳化制成灭活疫苗，使每毫升疫苗中 含灭活前活菌数为2. OX IO9CFU,接种2?3周龄健康易感仔猪，首免2周后，以相同剂 量再接种一次，二免3周后，用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易感仔猪，剂量为 5. OX IO9CFU/只，免疫组猪100%保护，而对照组100%仔猪发病或死亡。
[0013] 3.繁殖滴度高该菌的培养液OD值与活菌数大致呈现一种线性关系，经过拟合，得 到菌液OD值与活菌数关系曲线Y = (15. 244X-0. 1959) X 108CFU/mL (R = 0. 9862)。通过菌 液OD值与活菌数的关系曲线，在确定菌液中活菌数时，可以很方便的通过测定菌液的OD值 而得到。
[0014] 本发明还提供了所述血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905在制备防治由血清13 型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
[0015] 本发明进一步提供一种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，包含前述菌株或由前述菌株 制备。所述疫苗可为单价或多价疫苗。
[0016] 当其为单价疫苗时，可针对性较强的防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪 嗜血杆菌病；当其为多价疫苗时，也可有效的防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜 血杆菌病。
[0017] 作为优选，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活前述菌株。
[0018] 作为优选，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为I. 0-5. OX 109CFU/mL。
[0019] 更为优选，所述单价疫苗的含菌量为2. 5X 109CFU/mL。
[0020] 所述单价疫苗的制备方法为：培养前述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价 灭活疫苗。
[0021] 所述佐剂可为本领域制备疫苗时常规选用的任何佐剂，为了更好的提高疫苗的免 疫效果，所述佐剂选自白油、铝胶、206和GEL中的一种。
[0022] 本发明还进一步提供用于扩增所述菌株OmpA5基因的引物对，所述引物对的核 苷酸序列为：
[0023] 上游引物：OmpA5F :CCACAAGCTAACAC ;
[0024] 下游引物：OmpA5R :AACTTCTTTTGAACCT。
[0025] OmpA5蛋白是副猪嗜血杆菌一个外膜蛋白，具有种属特异性，而不具有型特异性， 是副猪嗜血杆菌一个主要免疫蛋白。通过该引物可以检测所有型的副猪嗜血杆菌，不具有 血清型特异性。
[0026] 以及用于扩增所述菌株16S rRNA基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
[0027] 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'
[0028] 下游引物 R : 5，-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 '。
[0029] 该引物对可用于检测本发明所述菌株。
[0030] 本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明提供的血清13型副猪嗜血杆菌GX0905生物学性能稳定，对仔猪具有很强 的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安 全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的 免疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其 免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例2中副猪嗜血杆菌活菌数与OD_值的相关性曲线。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 实施例1血清13型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
[0035] 1.病原菌的分离
[0036] 用无菌接种环从疑似病猪新鲜的肺脏、心包积液、关节液等病料中取样，在TSA培 养基（含终浓度5%血清和0. 001 %的NAD)上划线接种，37°C培养24h?48h后观察生长 情况，对疑似菌落进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落，在TSA固体培养基上采取分区划线 法，进行3?5次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。
[0037] 2.病原菌的鉴定
[0038] 2. I NAD依赖性试验
[0039] 在II级生物安全柜中，用接种环挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无 NAD的 TSA平皿上，在挑去金黄色葡萄球菌垂直于水平划线，37°C培养24h?48h，结果出现了"卫 星生长现象"，即在葡萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。
[0040] 2. 2 镜检
[0041] 挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰 氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具 有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。
[0042] 2. 3生化鉴定试验
[0043] 在II级生物安全柜中，用接种环分别挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌 落，水平划线于新的TSA培养基上，于37°C培养14h?16h。刮取多个菌落（成团状最佳）， 分别接种尿素酶、氧化酶、硝酸盐还原、蛋白胨水（D引哚）、葡萄糖、阿拉伯糖、鹿糖、果糖、半 乳糖、麦芽糖和〇NPG(f3 -半乳糖苷）等微量生化鉴定管中，并在每个微量生化鉴定管中加 入3 μ 1?5 μ 10. 1 % NAD，并设置对照管。于37°C培养24h?48h，观察并参照厂家说明书 判定试验结果。结果为半乳糖、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、尿素、ONPG、硝酸盐还原、尿素 酶、麦芽糖为阳性，而阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、乳糖、山梨醇、硫化氢、Π 引噪为阴性。生化结果 表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。
[0044] 2. 4 PCR 鉴定
[0045] 将待检菌株菌液12, 000r/min离心3min，弃去上清液后，用无菌DEPC水悬浮，在 振荡器上涡旋lmin，于沸水中水浴20min，取出后置于-20°C冰箱中冻结。冻融后12, OOOr/ min离心Imin，上清液即为模板DNA。
[0046] 参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物，对分离的疑 似HPS菌株进行PCR鉴定。
[0047] 上游引物 F :5' -GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'
[0048] 下游引物 R :5' -GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3'
[0049] PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0050] 以菌液DNA为模板，反应体系（25 μ 1)如下：
[0051] rTaq-Mix 12.5μ1 DEPC 水 7'5μΙ 上游引物Pl Ι.ΟμΙ 下游引物Ρ2 Ι.ΟμΙ 模板 DNA 3.0μ1
[0052] 反应条件：94°C预变性4min ;94°C变性50S，59°C退火50S，72°C延伸lmin，运行30 个循环；72°C再延伸lOmin，PCR产物4°C保存。以DEPC水为模板作阴性对照。
[0053] 用I XTAE电泳缓冲液配制的终浓度1. 3%琼脂糖，融化后加入适量DuRed核酸染 料一起倒入制胶板封固，取上述PCR产物5 μ 1加入样品孔中，在I X TAE电泳缓冲液中加以 适当电场使DNA样品向正极移动30min?60min。电泳结束后在Bio-Rad GelDoc凝胶电泳 成像分析系统成像观察，结果出现预期PCR扩增产物的片段为822bp。
[0054] 2. 516S rRNA PCR 扩增产物测序
[0055] 将1. 3 %的琼脂糖凝胶中电泳检测为阳性后扩增的PCR产物（DNA片段），利用DNA 凝胶回收试剂盒回收PCR产物，然后与PMD18-T克隆载体连接，由生工生物工程（上海）股 份有限公司进行DNA测序，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0056] 2. 6血清学分型
[0057] 根据KeilSteia和Rapp-GabrielSon (1992)所建立的方法，即利用琼脂扩散试验 (Gel diffusion，⑶）血清学分型的方法鉴定副猪嗜血杆菌血清型。利用标准菌株用健康 新西兰大白兔制备高免分型血清；用分离菌株按照上述文献制备沉淀抗原。琼脂扩散试验 过程大致如下：凝胶的配制：琼脂糖lg，氯化钠8. 5g，溶于100ml PH7. 2?7. 4PBS中，置于 微波炉IOmin融解，加入含量0. lg/100ml硫柳采防腐，倒平板3mm?4mm厚，用打孔器在平 板上按需要打孔（孔径3mm，孔间距4mm)，热熔封底；然后在中央孔加分离菌株制备的沉淀 抗原，周围孔加标准的阳性血清，放入湿盒中，于37°C 24h后观察结果，连续观察2d?3d。 主要观察抗原与抗体孔之间的是否出现清晰的白色沉淀线，若有则判定为阳性，反之则判 定为阴性。结果抗原与13型阳性血清发生反应，出现白色沉淀，证明分离的菌株为血清13 型副猪嗜血杆菌，并命名为GX0905。
[0058] 实施例2白油佐剂灭活疫苗制备
[0059] 1、抗原制备
[0060] 将副猪嗜血杆菌GX0905株接种在TSA固体培养基上复苏，连续传3代复壮，将复 壮的副猪嗜血杆菌接种于TSB液体培养基中，在摇床内37°C培养12h?14h左右，作为种 子液，再将种子液按培养基总体积的1 %接种于预热到37°C的TSB液体培养基，37°C，180r/ min振荡扩大培养14h?16h，用分光光度计测定菌液0D_值，根据活菌数与OD _值相关 性标准曲线公式，计算细菌总菌含量。然后向菌液中加入终浓度0. 2%的甲醛灭活细菌，置 于37°C恒温箱灭活14h?16h，灭活期间，没4h?5h摇动一次。到时间后，取灭活的菌液， 在TSA固体培养基划线培养，置于37°C培养48h，观察是否灭活彻底。将完全灭活的菌液 4000r/min离心20min，弃去上清，生理盐水悬浮沉淀，洗绦3次，最后一次加入适当体积的 生理盐水，使菌液浓度为1. 0X 101° CFU/mL，向其中加入终浓度为0. 01 %的硫柳汞溶液，置 4 °C保存备用。
[0061] 2、疫苗制备
[0062] 将灭活检验合格的菌液按体积加入终浓度为4%的灭菌吐温-80,边加边搅拌，至 完全溶解，制成灭活疫苗水相。水相与白油佐剂的比例为1:3。将白油佐剂在实验室高速分 散机搅拌器中缓慢搅拌，再取适量水相缓慢加入，开动电机乳化5min?10min，直至乳化完 全，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为2. 5 X 109CFU/mL，置于 4°C保存。
[0063] 实施例3铝胶佐剂灭活疫苗制备
[0064] 抗原制备步骤如实施例2。
[0065] 疫苗制备：
[0066] 将灭活检验合格的菌液与等量含量为20%的灭菌氢氧化铝盐水稀释液均匀混合， 在室温下静置沉淀24h，按全量总体积的1/2吸出上清液，再加入终含量万分之一的硫柳汞 溶液。疫苗成品中细菌的含量为2. 5X IO9CFUAiL CFU/mL，置于4°C保存。
[0067] 实施例4 206佐剂灭活疫苗制备
[0068] 抗原制备步骤如实施例2。
[0069] 疫苗制备：
[0070] 将灭活检验合格的抗原与等体积灭菌206佐剂均匀混合。将206佐剂在实验 室高速分散机搅拌器中缓慢搅拌，再取等量混合溶液缓慢加入，启动开关乳化20min? 30min，直至乳化完全，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为 2. 5X 109CFU/mL CFU/mL，置于 4°C保存。
[0071] 实施例5 GEL佐剂灭活疫苗制备
[0072] 抗原制备步骤如实施例2。
[0073] 疫苗制备：
[0074] 将灭活检验合格的抗原与GEL佐剂按照9比1的比例均匀混合。将细菌抗原在 实验室高速分散机搅拌器中缓慢搅拌，再取适量GEL佐剂缓慢加入，启动开关搅拌5min? lOmin，直至完全混合均匀，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量 为 2. 5X 109CFU/mL CFU/mL，置于 4°C 保存。
[0075] 实施例6 GEL佐剂灭活疫苗制备
[0076] 同实施例5,区别在于仅在于疫苗成品中细菌的含量为5. OX 109CFU/mL，置于4°C 保存。
[0077] 实施例7白油佐剂灭活疫苗制备
[0078] 同实施例2,区别在于仅在于疫苗成品中细菌的含量为I. OX 109CFU/mL，置于4°C 保存。
[0079] 实施例8血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株的生物学特性
[0080] 1.血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株外膜蛋白OmpA5基因序列
[0081] 根据已发表的副猪嗜血杆菌OmpA5基因序列，设计引物，扩增血清13型副猪嗜血 杆菌分离株GX0905株OmpA5基因。经测序，GX0905株外膜蛋白OmpA5基因的核苷酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0082] 2.副猪嗜血杆菌生长曲线的测定
[0083] 将副猪嗜血杆菌GX0905株接种在TSA固体培养基上复苏，然后连续传3代复壮， 将复壮的副猪嗜血杆菌接种于TSB液体培养基（含终浓度5%血清和0. 001%的NAD)中， 在摇床内37°C培养12h?14h左右，作为种子液，再将种子液按培养基总体积的1%接种 于预热到37°C的TSB液体培养基，37°C，180r/min振荡培养。培养期间每隔2h取样，倍比 稀释后接种于TSA培养基上，培养后进行平板菌落计数。用台式酸度计测定每次取样的pH 值，用分光光度计测定培养基的〇D_值，将试验结果绘制成曲线。结果表明，在TSB液体培 养基中培养，细菌接种6h开始进入对数生长期，培养18h?20h活菌数达到最高峰，在20h 后活菌数大幅度下降，到26h?34h有个小幅增长的趋势，但此后活菌数呈缓慢下降趋势。
[0084] 3.副猪嗜血杆菌在不同条件下保存时间的测定
[0085] 将复壮后副猪嗜血杆菌GX0905株接种于TSA固体培养基，37°C恒温箱培养24h 后，再分别保存于TSA、TSB、甘油+PBS溶液、甘油+血清溶液、卵黄液、卵黄液冻干，收获后 以不同条件进行保存。一定时间后将保存细菌复苏，观察是否存活，以寻找合适的副猪嗜血 杆菌的保存方法。结果见表1。
[0086] 表1副猪嗜血杆菌在不同环境条件下保存的存活时间
[0087]
【权利要求】
1. 一株血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905,其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为：CCTCC M 2014125。
2. 权利要求1所述的血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905在制备防治由血清13型副 猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
3. -种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述菌株或由权利 要求1所述菌株制备。
4. 根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活的权利要 求1所述菌株。
5. 根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为 1. 0 ?5. 0X109CFU/mL〇
6. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的含菌量为2. 5X 10 9CFU/mL。
7. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法为：培养权利要求1 所述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价灭活疫苗。
8. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂选自白油、错胶、206和GEL中的 一种。
9. 用于扩增权利要求1所述菌株的OmpA5基因的引物对，其特征在于，所述引物对的核 苷酸序列为： 上游引物：0mpA5F :CCACAAGCTAACAC ; 下游引物：0mpA5R :AACTTCTTITGAACCT。
10. 用于扩增权利要求1所述菌株的16S rRNA基因的引物对，其特征在于，所述引物对 的核苷酸序列为： 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'; 下游引物 R:5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。
【文档编号】C12R1/21GK104498384SQ201410587953
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】李晓成, 邵卫星, 吴发兴, 张志 , 刘爽, 董雅琴, 李鹏, 王佳, 于美芳 申请人:中国动物卫生与流行病学中心