提高盐霉素发酵水平的方法
【专利摘要】一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉菌DSMZ41398中失活位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇，减少其对盐霉素生物合成前体物的竞争，实现盐霉素产量的提高。采用本发明的方法，可使盐霉素的发酵终产量提高8倍以上，实验室摇瓶水平达到6.3g/L。
【专利说明】提高盐霉素发酵水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种提高盐霉素发酵水平的方法。 技术背景
[0002] 放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60%以上是由放 线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一 直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿 瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生 物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅 酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。
[0003] 盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌（Streptomyces albus)产生的。盐霉 素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革 兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同，为钠钾离子的螯合载体， 通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为 抗球虫病药物，1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂，自1993年经 我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜牧 业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目前 临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重要 性，本 申请人:的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因簇， 2012年完成了其产生菌白色链霉素 DSMZ41398(Str印tomyces albus DSMZ41398)的全基因 组测序。通过对基因组进行分析，在其染色体上我们找到了多个活跃的I型聚酮合酶生物 合成基因簇，他们和盐霉素分享部分的前体，这暗示着这些基因簇的存在会分散前体物的 供应，消弱盐霉素合成的前体供应，进而影响盐霉素的产量。
[0004] 通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类 化合物的最终产量。在阿维菌素产生菌中中断阿维菌素的生物合成可以大大提高寡霉素 的产量，红霉素高产菌株全基因组测序后发现其中多个聚酮合酶生物合成基因簇均发生失 活突变。然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过失活其中的活跃I型聚酮合 酶生物合成基因簇来改变前体代谢流的流量和流向，使其更多的流向盐霉素的生物合成途 径，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，在于提供一种提高盐霉素发酵水平的方法。该方法通过中断一个I 型生物合成基因簇，解除前体物供应的竞争、提高盐霉素前体的供应来实现盐霉素的高产。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] -种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉素 DSMZ41398 (Sti^ptomyces albus DSMZ41398)的染色体1，200, 120bp-l, 200, 750bp位置引入基因突变，导致位于SLNW T0868-SLNWT0920(1，173, 724bp-l，276, 916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活，使盐霉素 在发酵中的产量得以提高；
[0008] 所述白色链霉素 DSMZ41398染色体上1，200, 120bp-l，200, 750bp的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 所述I型PKS生物合成基因簇失活的构建步骤如下：
[0010] 第一步：设计并构建用于1，200, 120bp-l，200, 750bp区域进行失活的同源重组质 粒载体I;
[0011] 第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌白色链霉素 DSMZ41398中进行同源重组；
[0012] 第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段 大小的差异筛选得到 SLNWT0868-SLNWT0920(1, 173, 724bp-l, 276, 916bp)的 I 型 PKS 生物 合成基因簇失活的突变株。
[0013] 所述的质粒载体I的构建方法是在质粒PJTU1278的Spel/Kpnl位点插入 来自 1，200, 120bp-l, 200, 750bp 区域左侧 1410 的 PCR 片段 Spel/Hindlll 和来自 1，200, 120bp-l, 200, 750bp 区域右侧 1352bp 的 PCR 片段 Hindlll/Kpnl。
[0014] 所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33°C、220转/分 钟的转速下培养36?48小时后，转接到种子培养基，于33°C、220转/分钟的转速下培养 16?20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。
[0015] 所述TSBY培养基含有：TSB 3%，酵母提取物0.5%，蔗糖10. 3%;所述种子培养基 含有：葡萄糖4 %，黄豆饼粉3 %，酵母提取物1 %，碳酸钙0. 2 % ;所述发酵培养基含有：胚 芽粉0. 8 %，黄豆饼粉0. 5 %，氯化钾0. 22 %，氯化钠0. 1 %，尿素0. 16 %，酒石酸0. 2 %，硫 酸镁0. 01 %，磷酸氢二钾0. 01 %，碳酸钙0. 5 %，大豆油15 %。
[0016] 所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3%的接种量转接于种子培养基， 所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10%的接种量转接于发酵培养基。
[0017] 本发明的方法可以部分解除前体物供应的竞争、提高盐霉素前体的供应，以此来 提高盐霉素发酵，最终盐霉素发酵产量提高了 800%以上，最终产量达到6. 3g/L，通过本发 明的方法可显著提高盐霉素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。
[0018] 本发明所涉及的菌株白色链霉菌DSMZ41398已经在SCI数据库文献《Yurkovich ME,Tyrakis PA,Hong H, Sun Υ,Samborskyy Μ, Kamiya Κ,Leadlay PF:A late-stage intermediate in salinomycin biosynthesis is revealed by specific mutation in the biosynthetic gene cluster..Chembiochem 2012，Jan 2 ;13(1):66_71》中公开
[0019] 本发明所涉及的质粒pJTU1278已经在SCI数据库文献《He Y, Wang Z, Bai L, Liang J, Zhou X，Deng Z:Two pHZ1358derivative vectors for efficient gene knockout in Streptomyces. Journal of Microbiology and Biotechnology 2010,20 (4):678-682·》中 公开。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为野生型菌株白色链霉菌DSMZ41398基因失活衍生得到I型聚酮生 物合成基因簇中断菌株的示意图；其中的质粒PLQ52将野生型菌株DSMZ41398中的 1，200, 120bp-l，200, 750bp区域失活，得到基因簇中断突变株LCY-2。
[0021] 图2为基因簇中断菌株盐霉素合成基因 slnA3转录变化示意图；
[0022] 图3为基因簇中断菌株发酵前体胞内前体浓度变化示意图；
[0023] 图4为基因簇中断菌株与野生型菌株的盐霉素发酵产量示意图。
[0024] 具体实施方法
[0025] 以下实例将结合附图对本发明进一步作说明。本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。 实施例
[0026] 步骤一：质粒pLQ52的构建
[0027] 以白色链霉菌DSMZ41398的基因组DNA为模板，分别使用两组引 物 LCY-2-L-F/LCY-2-L-R、LCY-2-R-F/LCY-2-R-R 通过 PCR 扩增得到中断区域 (1，200, 120bp-l，200, 750bp)左侧I. 41kb的同源臂及右侧I. 35kb的同源臂，通过 基因测序确认同源臂的正确性；在质粒PJTU1278的Spel/Kpnl位点插入来自中断区 域（1，200, 120bp-l, 200, 750bp)左侧 I. 41kb PCR 片段（Spel/Hindlll)和中断区域 (1，200, 120bp-l，200, 750bp)右侧 I. 35kb PCR片段（Hindlll/Kpnl);通过上述方法得到用 于基因簇失活的质粒PLQ52。在37摄氏度水浴条件下，采用Spel，HindIII和KpnI三种限 制性内切酶进行酶切处理可以观察到I. 35kb和I. 41kb的两条目标条带，表明质粒构建正 确。
[0028] 步骤二：将用于和染色体发生重组的质粒pLQ52导入野生型菌株DSMZ41398,并筛 选得到1，200, 120bp-l, 200, 750bp区域缺失突变株，此突变株表征位于SLNWT0868-SLNWT0 920 (1，173, 724bp-l，276, 916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活。
[0029] 图1示意了 1，200, 120bp-l, 200, 750bp区域缺失的过程。具体操作如下：将已 构建完成用于基因缺失的质粒PLQ52转化进入宿主ET12567(含有pUZ8002质粒）中。取 ET12567于含有Amp，Kan和Chl三种抗生素的LB中于37°C过夜培养，用相同的培养基，将 过夜培养物按10%的比例转接一次并培养2. 5小时，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去 培养物中的抗生素。于此同时制备野生型菌株DSMZ41398的新鲜孢子约109个，用TES溶 液漂洗2?3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50°C热激IOmin后再冷却至室温，等体 积加入2X孢子预萌发培养液后于37°C培养3小时。将预萌发的孢子液与之前制备的宿 主菌ET12567混合（孢子和宿主菌的比例约为10 :1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干 后转移至30°C培养箱正置培养17小时后取出平板，分别取Thio和萘啶酮酸两种抗生素的 储存液40 μ L和12 μ L加入I. 5mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移 至30°C培养箱中培养。一般3?5天后可见平板上有单菌落结合子长出，采用LCY-2-C-F/ LCY-2-C-R为引物，通过菌丝体PCR和抗性验证的方法验证结合子正确后划线接种至SFM平 板，30°C培养至产孢，收集孢子后按稀释IO 7?IO8后接种至SFM平板培养2?3天可得到 单菌。继续采用LCY-2-C-F/LCY-2-C-R为引物，通过菌丝体PCR的方法对单菌落筛选得到 1，200, 120bp-l, 200, 750bp 区域缺失突变株，此突变株即为位于 SLNWT0868-SLNWT0920(1, 173, 724bp-l，276, 916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活。
[0030] 上述步骤二中所用到的引物序列如表1所示
[0031] 表 1
【权利要求】
1. 一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的染色体1，200, 120bp-l, 200, 750bp位置引入基因突变，导致位于SLNW T0868-SLNWT0920 (1，173, 724bp-l，276, 916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活，使盐霉素 在发酵中的产量得以提高； 所述白色链霉素DSMZ41398染色体上1，200, 120bp-l，200, 750bp的序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述I型PKS生物合 成基因簇失活的构建步骤如下： 第一步：设计并构建用于1，200, 120bp-l，200, 750bp区域进行失活的同源重组质粒载 体I ; 第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398 中进行同源重组； 第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小 的差异筛选得到 SLNWT0868-SLNWT0920(1, 173, 724bp-l, 276, 916bp)的 I 型 PKS 生物合成 基因簇失活的突变株。
3. 根据权利要求2所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的质粒载体I 的构建方法是在质粒PJTU1278的Spel/Kpnl位点插入来自1，200, 120bp-l，200, 750bp区 域左侧 1410 的 PCR 片段 Spel/Hindlll 和来自 1，200, 120bp-l, 200, 750bp 区域右侧 1352bp 的 PCR 片段 HindllI/Kpnl。
4. 根据权利要求1所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的发酵是指将 链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33 °C、220转/分钟的转速下培养36?48小时 后，转接到种子培养基，于33°C、220转/分钟的转速下培养16?20小时后，再转接到发酵 培养基发酵9天。
5. 根据权利要求4所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述TSBY培养基 含有：TSB3%，酵母提取物0.5%，蔗糖10. 3% ;所述种子培养基含有：葡萄糖4%，黄豆 饼粉3 %，酵母提取物1 %，碳酸钙0. 2 % ;所述发酵培养基含有：胚芽粉0. 8 %，黄豆饼粉 0. 5 %，氯化钾0. 22 %，氯化钠0. 1 %，尿素0. 16 %，酒石酸0. 2 %，硫酸镁0. 01 %，磷酸氢二 钾0.01%，碳酸钙0.5%，大豆油15%。
6. 根据权利要求4所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的转接到种子 培养基是将TSBY培养物按照3%的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是 将种子培养物按照10%的接种量转接于发酵培养基。
【文档编号】C12R1/47GK104388491SQ201410592641
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】白林泉, 芦晨阳, 蒋明, 康前进 申请人:上海交通大学