载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种新的制备载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束的方法，它可以靶向肝癌干细胞，以达到根治肝癌的目的。
【背景技术】
[0002]肝癌是全球第五常见的癌症，亦是我国癌症第二大常见的杀手，全球50%以上的肝癌发生在我国。它是临床上最常见的恶性肿瘤之一，目前发病率有逐年上升的趋势。肝癌是高侵袭性的恶行肿瘤，其恶性程度高、病情进展快，且早期无明显症状，导致大多数就诊较晚，使得其治疗难度大、疗效差，病死率高。因此，肝癌的预防和治疗是我国医药研究的一项重要而紧迫的任务。
[0003]现今肝癌的治疗手段主要包括外科治疗(即手术切除)、介入治疗、放射治疗、中医中药及免疫治疗，而手术切除至今仍是肝癌治疗的首选方案。对于大部分不能手术切除的中晚期肝癌患者，采用多种方法综合、序贯治疗是目前最有效的措施。但由于个体的特殊性，使得多种手段如何选择，如何搭配从而达到最佳疗效成为目前要解决的问题。目前用于肝癌治疗的一线药物针仅针对已分化的肿瘤细胞，它可以在较短时间内杀灭这类细胞，使肿瘤体积减小甚至消失，然而难以根除肝癌的复发，不能从根源上对肝癌进行治疗。因此治疗后肿瘤复发和转移仍是肝癌治疗中的一大难题。
[0004]肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤组织中存在的一小部分具有高度增殖能力与自我更新能力的细胞群体，是能产生肿瘤细胞的一个亚群，在肿瘤的发生、转移、复发中起着关键作用。因此，在肿瘤的治疗过程中对肿瘤干细胞的作用是非常关键的。尽管目前研究者们对此提出了很多策略，肿瘤干细胞的消除仍然是很困难的。传统的化疗药物如多柔比星和紫杉醇可以杀死多数肿瘤细胞，但是对肿瘤干细胞作用极弱甚至耐药，从而导致肿瘤中肿瘤干细胞比例的升高。研究人员通过高通量筛选等方法鉴定出几种旧的药物(如盐霉素、二甲双胍、姜黄素、戒酒硫)具有对抗肿瘤干细胞的作用。本方法中选取盐霉素作为抗肿瘤干细胞药物，将其包载于聚乙二醇-神经酰胺胶束中，有效杀伤肿瘤干细胞。
[0005]盐霉素是一类广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗家畜、家禽的球虫病，还常作为饲料添加剂在动物生产中长期应用。盐霉素(Salinomycin，SAL)又叫沙利霉素、优素精、萨里诺马辛，它是由白色链球菌(Streptomycesaldus)经发酵培养产生的一种一元羧酸聚醚类离子载体型抗生素类，具有杀菌、抑菌、抗球虫的作用，对大多数革兰氏阳性菌有抑制作用。最近研究显示，盐霉素不仅可以用于牲畜的抗球虫病，对乳腺肿瘤干细胞也具有很强的杀伤作用。2009年，《Cell》上发表文章，发现从16，000个化合物中筛选得到的盐霉素能高选择性杀死小鼠身上的人乳腺癌CSC，并且其效力比传统化疗药物紫杉醇高100倍。后续研究发现，盐霉素不仅对乳腺癌CSC具有杀灭作用，对其他许多肿瘤干细胞(肝癌，前列腺癌)均具有杀灭作用。盐霉素成为一种广谱抗肿瘤干细胞药物，受到研究人员的广泛关注，表现出很强的临床应用前景。
[0006]尽管盐霉素是一种有效的抗肿瘤干细胞药物，然而其对普通肿瘤细胞仍然有待加强，而且其毒副作用较大，这两个缺点导致了盐霉素的临床应用受到严重阻碍。联合给药是一种将多种化疗药物进行联合的给药方式，临床治疗常常需要联合给药才能达到提高化疗药物疗效和降低化疗药物毒副作用。而神经酰胺(Ceramide)是一种由鞘氨醇和脂肪酸构成的脂质分子，具有显著的化疗增敏效果。多项研究显示其能显著增强化疗药物的治疗效果，我们前期研究结果显示聚乙二醇化神经酰胺(PEG-ceramide)能形成胶束结构，胶束是一种表面活性剂分子在其浓度超过临界值后形成特殊聚集体的形状与分子在其中的空间排布的纳米药物。在水溶液中，分子的亲水基向外伸向水相，疏水基则以范德华力紧密排列。
[0007]盐霉素水溶性较差，且直接用药，对机体的毒副作用较强，同时，在体内循环时间也较短，不利于肿瘤治疗。因此迫切需要一种载体能有效的包载游离药物盐霉素、高效渗透肿瘤内部并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少非靶向器官的药物积聚，降低对机体的毒副作用，延长体内循环时间。有报道指出，将神经酰胺聚乙二醇化，能增强阿霉素诱导细胞的能力。聚乙二醇-神经酰胺是两亲性分子共聚物，具有亲水和疏水段，容易形成小粒径胶束，因此具有制备成载体包载盐霉素的可能性。而且小粒径胶束(<30nm)不仅可以逃避单核细胞吞噬作用，延长体内循环时间，增加药物在实体瘤的蓄积，还具有肿瘤组织高渗透能力，能有效地渗透入肿瘤组织内部，释放药物达到消灭肿瘤干细胞的目的。以PEG-ceramide为载体包载盐霉素制备成粒径小于30nm的胶束可以加强药物对肿瘤的靶向性与渗透性，消灭肝癌细胞和干细胞。
[0008]中国专利文献CN104257628A公开一种载盐霉素胶束及其制备方法和应用，是以DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物为载体，包载盐霉素钠的胶束。目前尚无文献报道以PEG-ceramide为载体包载盐霉素制备的胶束针对肝癌细胞和干细胞进行靶向给药。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种新的载盐霉素具有高靶向性及渗透能力的小粒径胶束及其制备方法。本发明的另一个目的是提供该胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0010]本发明选择新型抗肿瘤药物盐霉素，将其用PEG-ceramide包载用于肝癌的靶向药物治疗。
[0011]本发明的技术方案包括:
[0012]—、新型载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束的制备；
[0013]二、新型载药胶束体外穿透肝癌干细胞能力的检测；
[0014]三、载药胶束体外抗肝癌干细胞活性。
[0015]本发明的第一方面，提供一种载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束，该胶束为:以聚乙二醇-神经酰胺为载体，包载盐霉素，粒径为ll±3nm(最优为llnm)的胶束，所述的盐霉素与载体摩尔比为1:4。
[0016]本发明的第二方面，提供一种上述载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束的制备方法，包括以下步骤:将聚乙二醇-神经酰胺溶解于氯仿中，另取盐霉素，溶解于甲醇中，将两种溶液混合，37°C下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成干燥薄膜；向旋转蒸发瓶中加入pH7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min ;过200nm的聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素。
[0017]较优的，包括以下步骤:将5mg的聚乙二醇-神经酰胺溶解于3ml氯仿中，另取0.454mg的盐霉素，溶解于1ml甲醇中，将两种溶液混合，37°C下减压旋转蒸发0.5__2h (最优为2h)除去有机溶剂，形成干燥薄膜。向旋转蒸发瓶中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min。过200nm的聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素。
[0018]为了寻找最佳盐霉素包封率，将盐霉素与PEG-ceramide载体质量比值进行了优化。优化方法为:制备不同摩尔比例(如1:2、1:3、1:4)的载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束，测其包封率，得出盐霉素与载体摩尔比为1:4时，制备的新型载药胶束盐霉素包封率最佳。
[0019]另外，为将聚乙二醇-神经酰胺和盐霉素分别选择了不同的溶剂，聚乙二醇-神经酰胺是溶解于氯仿中，盐霉素是溶解于甲醇，优点是将两种有机溶剂氯仿和甲醇以3:1的比例混合，能使盐霉素和载体材料形成最佳的分散薄膜，后期用PBS水化后得到的载药胶束包封率较高，粒径分散更均匀。若用其他试剂如乙腈溶解盐霉素也能形成薄膜，但用甲醇溶解结果更佳。水化过程充满氮气，可防止药物氧化；选择pH 7.4的磷酸盐缓冲液，制备所得胶束粒径均一，而且符合动物和人体体内环境。
[0020]本发明的第三方面，提供上述制备的新型载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0021]所述的载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束具体靶向已分化的肝癌干细胞和普通的肝癌细胞。
[0022](1)本发明制备所得新型胶束体外高靶向性及渗透能力的检测
[0023]本发明用激光共聚焦显微镜检测肝癌细胞和肝癌干细胞中对含有荧光物质胶束的摄取能力，来评价胶束体外靶向性及渗透能力。激光共聚焦显微镜可对肝癌干细胞内荧光强弱进行定性分析。
[0024](2)本发明制备所得新型载盐霉素胶束体外抗肝癌和肝癌干细胞活性
[0025]本发明采用CCK-8法测定细胞在经不同药物浓度处理后细胞存活率，来评价药物和载药纳米粒的细胞毒性。细胞的生存曲线经对数模拟后，计算细胞的IC50来定量比较其细胞毒性大小。
[0026]本发明优点在于:
[0027]本发明的新型载盐霉素聚乙二醇-神经酰胺胶束在能够提高化疗药物盐霉素疗效，降低药物毒副作用的同时可达到靶向肝癌干细胞和肝癌细胞的作用，这是一种肝癌治疗的新策略。它利用小粒径胶束载体的优势，制备纳米药物靶向治疗肿瘤，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0028]图1.薄膜分散法制备新型的载药PEG-ceramide胶束。
[0029]图2.载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束的表征，其中，A为胶束的水化粒径分布图为胶束的水化电位分布图；C为胶束的透射电镜图片。
[0030]图3.盐霉素和聚乙二醇-神经酰胺协同比例的筛选。
[0031]图4.肝癌细胞Η印G2及干细胞摄取PECF的荧光值强度。
[0032]图5.激光共聚焦检测肝癌和肝癌干细胞对胶束的摄取能力，其中，Α为肝癌细胞摄取新型载荧光物质胶束；B为肝癌干细胞摄取新型载荧光物质胶束；C为肝癌干细胞单细胞悬液摄取新型载荧光物质胶束。
[0033]图6.载盐霉素胶束及游离盐霉素对肝癌细胞和肝癌干细胞的半数抑制浓度(IC50)，其中，A为载盐霉素胶束及游离盐霉素对肝癌细胞的半数抑制浓度；B为载盐霉素胶束及游离盐霉素对肝癌干细胞的半数抑制浓度。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0035]材料和仪器
[0036]激光粒度测定仪，英国马尔文仪器有限公司；
[0037]R系列旋转蒸发器，上海申生科技有限公司；
[0038]CRGDK线肽，吉尔生化有限公司；
[0039]1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethylene glycol)-2000](ammonium sa