一种用于溢油污染岸滩生物修复的固定化菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种用于溢油污染岸滩生物修复的固定化菌剂及其制备技术，有效解决岸滩溢油生物修复过程中施加的菌体易受海浪、紫外线、温度等环境条件影响的问题。其中用于制备固定化菌剂的固定化材料包含海藻酸钠、聚乙烯醇和活性炭，其质量比为4～6：8～12：1～2。本发明所涉及固定化菌剂采取包埋方法进行制备，与游离菌体相比具有更好的石油降解能力、耐冲刷性能以及重复使用性能。在2013年黄岛“11.22”溢油岸滩修复的应用实践中也证明了该固定化菌剂在实际岸滩环境可保持良好的活性，其岸滩油污修复效果显著，国内尚未见相同的溢油生物修复技术报道，具有很好的开发应用前景。
【专利说明】-种用于溢油污染岸滩生物修复的固定化菌剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于石油及石油产品污染海岸线的生物修复【技术领域】，具体涉及一种用于 溢油污染岸滩生物修复的固定化菌剂及其制备技术和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，日益严重的海洋溢油污染引起了世界各国海洋管理部口及生态学家的关 注。生物修复技术具有安全高效、修复彻底、无二次污染、环境效益好等优点，被公认为是处 理海洋溢油特别是清理岸滩油污最有效的方法之一。但目前生物修复在实际应用中还存在 一些问题，特别是溢油污染岸滩复杂的环境条件严重影响了施加石油降解菌的存活率及降 解活性。从20世纪80年代末起，国内外开始研究通过物理、化学和生物方法的结合，增强 生物修复效果。因此，进一步寻求新的技术W减少海洋环境对生物修复过程的不利影响成 为解决问题的关键。
[0003] 微生物固定化技术是从20世纪60年代迅速发展起来的一项技术，该技术能够将 游离微生物细胞固定于限定的空间、避免菌体流失、提高菌体利用率、并提供适合的微环境 长期保持菌体活性。自20世纪70年代起，该技术就已开始应用于水处理行业，具有微生物 密度高、流失少、效率高、稳定性强、耐毒害能力强等优点，可显著增强生物修复的效果。在 海洋环境生物修复过程中，需要降低海浪冲刷、海水稀释、紫外线照射W及潮间带温盐变化 等不利环境条件的影响，而微生物包埋固定化技术可作为一种主要手段解决上述问题。目 前，国内针对海洋石油姪降解菌固定化菌剂的研发和相关制备技术尚未见报道。本专利基 于海洋环境±著石油姪降解菌，建立了固定化菌剂制备技术，为海洋溢油污染岸滩的生物 修复提供技术储备和理论指导。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于溢油污染岸滩生物修复的固定化菌剂，有效解决溢 油岸滩生物修复过程中施加菌剂易受海浪、紫外线、温度等环境条件影响的问题，弥补现有 技术的不足。
[0005] 本发明首先提供一种用于制备固定化菌剂的固定化材料，所述的固定化材料包含 海藻酸轴、聚己帰醇和活性炭，其质量比为4?6 ;8?12 ;1?2 ;
[0006] 上述固定化材料用于制备适用于海洋溢油污染岸滩的生物修复的固定化菌剂；
[0007] 本发明还提供一种固定化菌剂的制备技术，包含使用上述的固定化材料和石油姪 降解菌，采用包埋方法进行制备；
[0008] 本发明所采用的石油姪降解菌主要是自海洋环境筛选的±著细菌，包括食焼菌 (Alcanivorax sp.)、海杆菌（Marinobacter sp.)、解环菌（切cloclasticus sp.)等。
[0009] 固定化菌剂中石油姪降解菌的细胞浓度优选为l〇9CFU/g?l〇iiCFU/g。
[0010] 本发明的固定化菌剂的制备方法如下；将聚己帰醇、海藻酸轴和活性炭灭菌处理 后；采用8(TC恒温水浴溶解到无菌海水中，冷却至4(TC，然后与石油姪降解菌的菌息液均 匀混合；通过蠕动粟将上述液态制剂滴入饱和测酸和3%?8% CaCls的混合溶液中并揽 拌，交联至制剂凝固；分离固定化菌剂颗粒，并进行真空冷冻干燥。
[0011] 本发明的固定化菌剂可用于海洋溢油污染岸滩的生物修复，其应用方法如下；将 固定化菌剂装填到网袋中，然后平铺于溢油污染岸滩表面，其使用量为1. Okg/m2?1.化g/ 2 m。
[0012] 本发明所涉及固定化菌剂针对溢油岸滩环境特点，采取包埋法制备固定化菌剂， 与游离菌体相比具有更好的石油降解能力、耐冲刷性能W及重复使用性能。在2013年黄岛 "11. 22"溢油岸滩修复的应用实践中也证明了该固定化菌剂在实际岸滩环境可保持良好的 活性，其溢油污染岸滩修复效果显著，具有很好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为固定化菌剂扫描电镜图；
[0014] 图2为固定化菌剂机械性能比较示意图；
[0015] 图3为固定化菌剂石油降解率比较示意图；
[0016] 图4为回收固定化菌剂的二次石油降解率比较示意图；
[0017] 图5为经固定化菌剂生物降解后残留石油中的焼姪含量比较示意图；
[0018] 图6为经固定化菌剂生物降解后残留石油中的芳姪含量比较示意图；
[0019] 图7为黄岛"11. 22"溢油污染岸滩现场生物修复图；
[0020] 图8为黄岛"11. 22"溢油污染岸滩生物修复区与自然风化区沉积物中的石油含量 比较示意图。
[0021] 其中：
[002引图2、图3、图4中的Sn ;表示不同组的固定化菌剂；FB ;表示游离菌体处理；NC ;表 示阴性对照处理；柱上方的不同字母表示差异显著，P < 0. 05。
[0023] 图5中的n-Cm ;表示m碳正构焼姪，如n-C16为十六碳正构焼姪。
[0024] 图 6 中的 C0-N、C0-F、C0-D、C0-P、CO-C 分别为蔡、巧、二苯并喔吩、菲、屈；Cl (C2， C3, C4)-蔡表示在碳原子上修饰有1(2, 3,4)个焼基；Cl (C2, C3)-巧表示在碳原子上修饰 有1 (2, 3)个焼基；Cl (C2, C3)-二苯并喔吩表示在碳原子上修饰有1 (2, 3)焼基；Cl (C2, C3， C4)-菲表示在碳原子上修饰有1 (2, 3,4)个焼基；Cl (C2)-屈表示在碳原子上修饰有1 (2) 个焼基。Sn ;表示不同组的固定化菌剂；FB ;表示游离菌体处理；NC ;表示阴性对照处理。
【具体实施方式】
[0025] 本发明所用到的培养基分别为0NR7a培养基和M8培养基，其中0NR7a培养基每 升含有 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCla ? 6&0,3. 98g NaaSO" 1. 46g CaCla ? 2&0,1. 30g TAPS0, 0.72g KCl，0.27g 畑典1，89. OOmg 化2册〇4*7&0,83. OOmg NaBr, 31. OOmg NaHC〇3,27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCla ? 6&0, 2. 60mg 化F，2. OOmg FeCla ? 4&0,调节 pH 至 7. 6。
[0026] M8培养基为在0NR7a培养基的基础上每升添加2g己酸轴，0. 5g蛋白腺，0. 5g酵母 提取物，0. 5g马铃墓浸出粉，0. 2g葡萄糖，0. 2g藏糖，0. 05g苹果酸轴，0. 05g巧樣酸H轴， 0. 05g酒石酸钟轴，调节抑至7. 6。
[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0028] 实施例I固定化菌剂制备材料组成的确定及其制备技术
[0029] 所使用的海洋微生物包括食焼菌Alcanivorax sp.97C0-5(CGMCC No. 3735)、 Alcanivorax sp.97C〇-6(CGMCC No. 3736)和海杆菌 Marinobacter sp.PY97S(CGMCC No. 3244)。
[0030] 取-8(TC甘油管藏的菌株于M8培养基中活化并扩大培养至ODew = 1.2;在 7, SOOrpm条件下离也Smin获得菌体，无菌海水洗涂两次，按1:10 (w/v)比例采用无菌海水 重息；将H种菌息液按1?3:1?2:2?4比例均匀混合构建石油降解菌群DClO的菌息液， 4°C保存待用。W蠕动粟滴落法制备固定化菌剂。按照表1确定固化剂的组成比例。将聚己 帰醇和海藻酸轴及活性炭置于试管，灭菌（12rC，15min)处理；8(TC恒温水浴中溶解于无 菌海水中，再冷却至4(TC，按照菌息液与固定化试剂（v/v)l : 10的比例均匀混合。蠕动粟 滴入饱和测酸和3 %?8 % CaCls的混合溶液（交联剂）中，息臂式揽拌器（转速10化pm) 揽拌，交联0.化?化，分离固定化颗粒。分离收集的固定化颗粒-2(TC冷冻1化后，进行真 空冷冻干燥，制得固定化菌剂。
[0031] 表1 ;制备固定化菌剂采用的固化剂组分的正交试验设计
[0032]
【权利要求】
1. 一种固定化材料，其特征在于，所述的固化材料包含有海藻酸钠、聚乙烯醇和活性 炭，其质量比为4?6 :8?12 :1?2。
2. 权利要求1所述的固定化材料在制备固定化菌剂中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的固定化菌剂为适用于海洋溢油污染 岸滩的生物修复的固定化菌剂。
4. 一种固定化菌剂，其特征在于，所述的固定化菌剂包含有权利要求1所述的固定化 材料，以及海洋石油烃降解菌。
5. 如权利要求4所述的固定化菌剂，其特征在于，所述的固定化菌剂中石油烃降解菌 的细胞浓度为1〇9?l〇nCFU/g。
6. 如权利要求4所述的固定化菌剂，其特征在于，所述的菌体包括食烷菌、海杆菌、解 环菌中的一种或几种。
7. 权利要求4所述的固定化菌剂的制备方法，其特征在于，所述的方法是将聚乙烯醇、 海藻酸钠和活性炭灭菌处理后；采用无菌海水在80°C恒温水浴中溶解冷却至40°C，然后与 石油烃降解菌的菌悬液均匀混合；通过蠕动泵将液态制剂滴入饱和硼酸和4% CaCl2的溶 液中搅拌，交联至制剂凝固，分离固定化颗粒，然后进行真空冷冻干燥。
8. 权利要求4所述固定化菌剂在海洋溢油污染岸滩的生物修复中的应用。
9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，是将权利要求4所述的固定化菌剂装填到网 袋中，放置于溢油污染岸滩表面，其使用量为1. 〇?1. 5kg/m2。
【文档编号】C12N11/14GK104357435SQ201410606305
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】高伟, 郑立, 崔志松, 陈宇, 高祥兴, 李馨子, 李倩, 栾晓 申请人:国家海洋局第一海洋研究所, 中海石油环保服务（天津）有限公司