一种美国白蛾天蚕素a基因及其表达蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种美国白蛾天蚕素A基因及其表达蛋白和应用。该美国白蛾天蚕素A基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明首次从美国白蛾中克隆的天蚕素A基因的cDNA全长序列，并获得其表达蛋白，依据该蛋白序列，首次用化学方法合成C末端酰胺化的美国白蛾天蚕素A抗菌肽，采用琼脂糖孔穴扩散法测定合成抗菌肽美国白蛾天蚕素A抗菌肽对大肠杆菌E.coliK12D31和农杆菌AgrobacteriumEHA105的抗菌活性，具有很强的抗细菌活性，在抑菌中具有广泛的应用前景。
【专利说明】—种美国白蛾天蚕素A基因及其表达蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种美国白蛾天蚕素A (Cecropin A)基因及其表达蛋白和应用。
【背景技术】
[0002]抗菌肽是一类具有广谱高效杀菌活性的多肽类物质，是自然界中特别是昆虫非特异性免疫系统的一个必不可少的组成部分。1972年，瑞典科学家Boman等最早从天蚕蛹中发现抗菌肽cecropins，接着又从各种不同动物(哺乳类、两栖类等)和植株内分离得到了抗菌肽，此外部分细菌也能产生抗菌肽。随着研究的不断深入，发现部分抗菌肽还对某些致病真菌、病原虫、病毒甚至肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，是一类具有重要潜在应用价值的活性物质。抗菌肽具有不同于传统抗生素的独特抗菌机制，但对机体无毒副作用、无残留，这为解决细菌对传统抗生素日益增强的问题提供新思路。
[0003]根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前惜古比天蚕、家蚕Cecropin A cDNA已被克隆,并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，而美国白蛾Cecropin A的cDNA还未被克隆出来,关于美国白蛾Cecropin A基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种美国白蛾天蚕素A基因。本发明的另一目的是提供上述美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供上述美国白蛾天蚕素A基因的应用。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
一种美国白蛾天蚕素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述的美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]所述的美国白蛾天蚕素A基因在抗细菌活性中的应用。
[0008]所述的美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白在抗细菌活性中的应用。
[0009]一种美国白蛾天蚕素A抗菌肽，所述的美国白蛾天蚕素A抗菌肽的多肽序列为美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白序列的一部分，具体序列为:RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK。
[0010]所述的美国白蛾天蚕素A抗菌肽在抗细菌活性中的应用。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明首次从美国白蛾中克隆的天蚕素A基因的cDNA全长序列，并获得其表达蛋白，依据该蛋白序列，首次用化学方法合成C末端酰胺化的美国白蛾天蚕素A抗菌肽，采用琼脂糖孔穴扩散法测定合成美国白蛾天蚕素A抗菌肽对大肠杆菌E.coli K12D31和农杆菌Agrobacterium EHA105的抗菌活性，具有很强的抗细菌活性，在抑菌中具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是美国白蛾天蚕素A抗菌肽对大肠杆菌的抗菌活性结果图；
图2是美国白蛾天蚕素A抗菌肽对农杆菌的抗菌活性结果图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
[0014]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。以下实施例中使用的美国白蛾由徐州林业站提供。
[0015]实施例1 克隆 Cecropin A cDNA 1、提取美国白蛾总RNA。
[0016]应用RNA抽提试剂(TIANGEN)按照其操作手册提取美国白蛾蛹脂肪体的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，大于95%，紫外分光光度计测定其浓度为720ng/^L，满足使用需求。
[0017]2、采用Transgen cDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。
[0018]I)引物设计:根据NCBI惜古比天蚕,家蚕及果蝇Cecropin A序列比对设计兼并引物:
Cec-Al:5’ - ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，
Cec-A2:5’ _ NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3'
[0019]2)逆转录:在DEPC处理的1.5mL Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ L，Oligo d (T)18 (0.5 μ g/ μ L)1 μ L, 2 X TS React1n Mix 10 μ L, DEPC 水 5 μ L，TransScriptRT/RI Enzyme Mix I μ L ;42°C孵育 30min, 85°C加热 5min 失活 TransScript RT。将得到的cDNA分装后-20°C保存。
[0020]3) PCR:利用逆转录所得模板进行PCR,体系为25 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物(上游引物:5’ - ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物:5’ - TTATTTTCCT AATGCTTTTGCGGTAC-3，)各 I μ L，2.5mmol/L dNTP 2 μ L, 1XDreamTaq buffer 2.5 μ L, cDNA 模板
1.5 μ L，DreamTaq 酶 0.3 μ LjPddH2O 16.7 μ L0 反应程序为:94°C 5min, (94 °C 30s, 58 °C30s, 72°C Imin)，30个循环，最后72°C延伸1min。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到DNA条带,克隆入pMD19-T载体,经含Amp抗生素(50mg/mL)的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，得到192bp的片段,将该序列与惜古比天蚕和家蚕Cecropin A比对,具有很高的同源相似性，因此确定该序列为美国白蛾Cecropin A cDNA,序列全长如SEQ ID N0.1所不,共440碱基，其中1-58号碱基为该基因的5’UTR非编码区，59-247号碱基是该基因的全长编码序列ORF区，翻译63个氨基酸(从137-247号碱基是该基因的功能区，翻译37个氨基酸)，248-250为终止密码子序列，251-440号碱基为该基因的3’ UTR非编码区。所表达的蛋白序列如SEQID N0.2所示，共63个氨基酸，为基因的ORF区表达产物。
[0021]实施例2
根据实施例1所获得的美国白蛾天蚕素A蛋白序列，体外合成美国白蛾天蚕素A抗菌肽的多肽序列(N端一C端):RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK，主要具体过程如下:
首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N, N ' - 二环己基碳二亚胺(DCC, Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。
[0022]重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽，并且C末端酰胺化，以每管I毫克分装。纯度用HPLC分析高达95%以上。
[0023]利用0.9%NaCl 溶液倍比稀释分别配成 lmg/mL,0.5mg/mL,0.25mg/mL,0.125mg/mL, 0.0625mg/mL, 0.03125mg/mL, 0.01563mg/mL, 0.00781mg/mL 浓度的美国白蛾天香素 A 抗菌肽溶液。
[0024]I)抗大肠杆菌疋co7iK12D31活性鉴定
检测采用琼脂糖孔穴扩散法测定合成美国白蛾天蚕素A抗菌肽对大肠杆菌E.co7iK12D31的抗菌活性。接种K12D31于液体LB培养基，37°C 200rpm培养至对数生长期，按1%菌量加至融化的LB琼脂糖培养基中(35-50°C )，混匀后按1mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于37°C培养箱8小时，观察抑菌活性，结果见图1，具有很强的抗菌活性。
[0025]2)抗农杆菌活性鉴定
采用琼脂糖孔穴扩散法测定合成抗菌肽美国白蛾天蚕素A对农杆菌Agrobac teriumEM 1 5的抗菌活性。接种EHA105于液体LB培养基，28°C 200rpm培养至对数生长期，按1%菌量加至融化的LB琼脂糖培养基中(35-50°C )，混匀后按1mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于28°C培养箱16小时，观察抑菌活性，结果见图2，具有很强的抗菌活性。
【权利要求】
1.一种美国白蛾天蚕素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.权利要求1所述的美国白蛾天蚕素A基因在抗细菌活性中的应用。
4.权利要求2所述的美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白在抗细菌活性中的应用。
5.一种美国白蛾天蚕素A抗菌肽，其特征在于:所述的美国白蛾天蚕素A抗菌肽的多肽序列为美国白蛾天蚕素A基因的表达蛋白序列的一部分，具体序列为:RffKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGKo
6.权利要求5所述的美国白蛾抗菌肽-天蚕素A在抗细菌活性中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK104357452SQ201410616987
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】诸葛强, 张嘉鑫, 武小龙, 王晓立, 潘惠新, 尹佟明 申请人:南京林业大学