一种高产油栅藻及其培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产油栅藻及其培养方法和应用。自富营养化水域分离获得的藻种经18S rDNA序列分析和显微形态鉴定，确定该藻为栅藻属(Scenedesmus sp.)成员，其序列号为KF999043。该藻株命名为四尾栅藻SDEC-8(Scenedesmus quadricauda SDEC-8)，已于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号：CCTCC NO:M2014448。其产油培养方法为分离出四尾栅藻SDEC-8的单个藻细胞，获得的纯种细胞于实验室条件下进行曝气扩大培养。本发明四尾栅藻SDEC-8富含优质油脂，油脂含量可达到细胞干重的31.8％，脂肪酸中饱和脂肪酸可达到80％，可作为生物柴油原料。高十六烷值(61.38)和低碘值(29.38 gI2/100g)决定了以该株微藻为原料制备的生物柴油具有很好的氧化安定性。
CCTCC NO: M 2014448
2014.10.08
【专利说明】一种高产油栅藻及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物【技术领域】，特别涉及一种高产油栅藻及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于全球石化燃料消费量激增，石化储量的减少，引起了世界范围内的能 源危机，再加上石化燃料燃烧排放二氧化碳带来的环境问题，因此，寻找一种廉价的绿色再 生能源已成为世界各国政府以及民众广泛关注的科学与社会问题。研究发现，某些藻类具 有含油量高，易于培养，单位面积产量大，不与农业争地等优点，被视为新一代的，甚至是唯 一能实现替代化石燃料的生物柴油原料。其含有的16碳和18碳的脂肪酸对于生物柴油的 生产最为有利。然而生产成本高是制约微藻生物柴油规模生产的主要因素。而筛选获得容 易培养、生长快、产油高的藻种是克服微藻规模化生产瓶颈的首要的一步。早在上世纪70 年代，美国就启动了耗资2500万美元由美国国家可再生能源实验室（NREL)运作的水生物 物种项目。NREL已从海洋和湖泊中分离到3000多种藻类，从中筛选出生长快、含有高的包 括硅藻、绿藻和蓝藻等藻种300多种，但当时未解决成本问题。世界上其它各国的研究者也 都利用各种手段积极地筛选寻找能适应商业化生产的优良藻种。微藻制备生物柴油的研究 主要集中在以下几个方面：藻种分离与筛选、藻类培养、收获和脱水、油脂提取技术、藻类生 物燃料转化技术。因此，分离筛选生长速度快、油脂含量高、油质质量好的优质藻种成为从 源头上降低生物柴油产品成本的重中之重。近几年，国内多家实验室已经开始开展大规模 采集和筛选高产油藻株的工作，并且取得了一些进展。选自自然环境的微藻往往在温度、光 照和盐度适应方面具有一定的抗逆性，适于大量培养生产。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就在于克服现有技术中用于生产微藻油脂的优良藻株不足的问题， 提供一种高产油栅藻及其培养方法和应用，即在富营养化水域采集水样，分离纯化获得的 了一种具有抗逆性、易开放培养的产油微藻，并建立培养方法。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 本发明提供了一种高产油栅藻，命名为Scenedesmus quadricauda SDEC-8,分离 于济南市泉城公园富营养化湖泊中，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为： CCTCC N0:M 2014448。保藏日期：2014年10月8日。地址：武汉，中国典型培养物保藏中 心（武汉大学）；邮编：430072 ;保藏编号：CCTCC N0:M 2014448。四尾栅藻SDEC-8富含优 质油脂，油脂含量可达到细胞干重的31. 8%，脂肪酸中饱和脂肪酸可达到80%，可作为生 物柴油原料。高十六烷值（61.38)和低碘值（29. 38gI2/100g)决定了以该株微藻为原料制 备的生物柴油具有很好的氧化安定性。
[0006] 在一个方面中，本发明提供了 一种四尾栅藻SDEC-8培养基，成份和用量为 NaN031500mg .L'lyiPOp〗.5 ?84. 3mg .L'MgSC^ .7H20 75mg .L'CaCh .2H20 36mg .I71， 梓檬酸 6mg ? I71，梓檬酸铁铵 6mg ? I71，EDTANa2lmg ? I71，Na2C0320mg ? I71，H3B032. 86mg ? I71， MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? L_\ Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始pH值在7?8之间，接种后的藻细胞密度为 0. 35 ?0. 40X 106cells ? mL、
[0007] 优选的是，培养基成份和用量为：NaN031500mg ? L-1，K2HP0440mg ? L-1， MgS04 ? 7H2075mg ? I71，CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71，梓檬酸 6mg ? I71，梓檬酸铁铵 6mg ? I71， EDTANa2lmg ? I71，Na2C0320mg ? I71，H3B032. 86mg ? I71，MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I/1，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I/1，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? I/1，Co(N03)2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始pH值=7. 1，接种后的藻细胞密度为0? 37X 106Cells ? mL'
[0008] 在另一个方面中，本发明提供一种四尾栅藻SDEC-8培养基的应用，用于培养四尾 栅藻SDEC-8,得到四尾栅藻SDEC-8藻粉。
[0009] 在一个实施例方案中，所述四尾栅藻SDEC-8藻粉的脂肪酸甲酯含量9. 55mg ? g4， 饱和脂肪酸含量为80%，十六烷值为61. 38,碘值为29. 38gl2/100g。
[0010] 本发明还提供了一种培养四尾栅藻SDEC-8的培养方法，包括如下步骤：
[0011]a)将四尾栅藻SDEC-8培养于添加BG11的培养基中，培养温度为25± 1 °C，全光 照，光照强度2000-3000Lux，培养7天，
[0012] b)将所得藻细胞转移至BG11培养基中进行扩大培养，曝气气液比为0.l-o.2vvm， 培养温度为25 ± 1 °C，全光照，光照强度2000-3000Lux，待四尾栅藻SDEC-8生长到稳定期两 天时离心、干燥即得到培养后四尾栅藻SDEC-8藻粉。四尾栅藻SDEC-8在BG11培养基中的 生长曲线见图3。四尾栅藻SDEC-8在静置BG11培养液中的比生长速率和生物量浓度分别 为0. nd'O. 25g ? L'而在曝气BG11培养液中比生长速率和生物量浓度分别为0. 27CT1、 1. 29g ? L'因此，在BG11培养基中曝气极大促进了四尾栅藻SDEC-8的生长和生物量积 累。
[0013] 优选的是，步骤b)中培养条件：培养温度为25土 TC，光照为2500Lux的连续光 照，曝气气液比为〇. 2vvm。四尾栅藻SDEC-8在曝气的BG11培养液中的油脂产率比静置培 养下的提高3倍多，而脂肪酸甲酯产率提高近9倍。曝气极大促进了栅藻SDEC-8的油脂积 累。
[0014] 本方明提供了四尾栅藻SDEC-8在处理富营养化湖泊中的应用。四尾栅藻SDEC-8 进行含氮和/或含磷废水的净化的应用。四尾栅藻SDEC-8的生产应用，用于生产高效油脂、 脂肪酸、蛋白质、淀粉、色素、多糖和/或核酸的应用。四尾栅藻SDEC-8基本上包含了 C14:0、 C16:0、C18:0和C18:1等脂肪酸，且C16和C18系含量高达96%，其中C16:0和C18:1的含 量丰富，从以上脂肪酸组成上分析符合制备生物柴油的要求。
[0015] 本发明的有益效果
[0016]本发明在当地受污染水体中筛得一株优势富油四尾栅藻SDEC-8 (Scenedesmus quadricauda SDEC-8)，该株藻的生长不需要有机质营养，可以在廉价的无机营养中通过规 模培养源源不断地获得含油脂的生物质。其培养基中适当曝气，可以加速藻液的混合，提 高藻细胞光能利用率和生长速率，本发明的四尾栅藻SDEC-8在曝气下很明显的提高了油 脂产率和生物柴油产率，具有比较好的应用前景。本发明的四尾栅藻SDEC-8 (Scenedesmus quadricauda SDEC-8)富含油脂，且比普通的淡水藻有更高的生物柴油含量，更适合的生物 柴油性质例如饱和脂肪酸含量高达80%。利用该株微藻为原料制备的生物柴油具有很好的 氧化安定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1 :四尾栅藻SDEC-8在系统关系树中的位置。
[0018] 图2 :四尾栅藻SDEC-8的显微形态学照片
[0019] 图3 :18S rRNA的PCR扩增产物电泳照片
[0020] 图4 :四尾栅藻SDEC-8在BG11中曝气和不曝气的生长曲线。
[0021] 其中，1光学显微照片，2扫描电子显微照片、比例尺6 y m，3、4透射电子显微照片、 比例尺500nm. c,叶绿体；m,线粒体；n,细胞核；py,蛋白核；s,淀粉粒；V，液泡；A代表四 尾栅藻SDEC-8。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选 择。
[0023] 实施例1四尾栅藻SDEC-8的分离鉴定：
[0024] -、样品采集
[0025] 2012年7月从山东省济南市泉城公园富营养化湖泊采集含有绿藻的水样。
[0026] 二、四尾栅藻SDEC-8的分离纯化
[0027] 分离纯化步骤：通过血球板计数法在显微镜下对植物园水样计数，将藻液密度稀 释到约3000个/ml。在超净实验台上，将BG11固体培养液倒平板（已放置过夜，无杂菌生 长），将待分离的藻液使用医用喉头喷雾器分别喷在标记好的平板上，然后盖好，放在培养 箱内培养十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，并通过显微镜检查纯藻群落， 然后用消毒过的接种环直接移植到装有培养液并经过灭菌的l〇〇ml三角烧瓶中，用纱布及 无菌膜封口，进行培养。BGll;pH控制在7.1。上述培养基如制成半固体培养基，则添加琼 脂5?6%。。在显微镜下观察藻细胞是否被纯化，若有杂藻将已经扩大培养的藻细胞用改进 的96孔板进一步分离纯化：充分振摇培养基，如藻细胞成聚合体尽量使藻细胞群体破裂为 单细胞。在显微镜下用细胞计数板计数（浓度大时需稀释后重新计数），根据所计藻细胞密 度，将培养液稀释至每50 ill含0. 9个藻细胞单位。充分混匀后，用移液枪依次吸取50 y L 培养液于96孔培养板孔中，每个培养孔中预先放有新鲜的BG11培养液（300-500 yl)，加盖 用封口膜将培养板密封，防止液体挥发。将培养板孔在光照培养箱中培养，6?12h后，在倒 置显微镜下仔细观察并标记单细胞孔。待标记的单细胞孔内细胞增至500个以上或出现颜 色时，可进行转接扩大培养。选择单细胞生长的孔用移液枪将其培养物转移至装有200mL 的新鲜培养基的培养瓶中进行扩大培养。得到一株纯藻株，命名为SDEC-8。
[0028] 三、四尾栅藻SDEC-8的鉴定
[0029] 1?四尾栅藻SDEC-8的形态鉴定
[0030] 四尾栅藻SDEC-8的藻落形态特征：在培养基平板上培养后，可观察到绿色藻落， 呈圆形、边缘整齐、光滑、有光泽。
[0031] 四尾栅藻SDEC-8的菌体形态特征：在显微镜和扫描电镜下观察其形态符合栅藻 属特征，具有片状叶绿体，藻细胞真性定形群体扁平，由2-4个细胞组成，群体细胞并列直 线排成一列；细胞长圆形、卵形，细胞上下两端广圆，群体外侧细胞的上下两端各具一向外 斜的直或略弯曲的刺，细胞壁较平滑。细胞群体长宽取决于生长时期，一般长9-26 y m，宽 8-14i!m。透射电镜观察结果显示，每个藻细胞内含有一个单独的叶绿体，并占据半个细胞， 叶绿体中包含一个很明显的蛋白核，蛋白核周围被淀粉粒包被。在细胞中可发现大小不一 的液泡，在一些液泡中可以看到深灰色的不规则油状物质。如图2;
[0032] 2?四尾栅藻SDEC-8的分子鉴定
[0033] (1) 18S rRNA 的 PCR 扩增与测序：
[0034] 实验仪器：小型离心机（Eppendorf，转速>12000r/min);电泳仪（北京六一仪器 厂）；PCR热循环扩增仪（Eppendorf);凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。
[0035] 实验方法：按照试剂盒法，从适量新鲜藻液离心并提取藻种的总DNA，对DNA样品 进行18S rRNA扩增。扩增引物如下。
【权利要求】
1. 一种高产油栅藻，其特征在于，分离于富营养化湖泊中，命名为Scenedesmus quadricauda SDEC-8,已于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号 为：CCTCC NO:M 2014448。
2. -种如权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8培养基，其特征在于：成份和用量为NaN031500mg ? I71，K2HP04 22. 5 ?84. 3mg ? I71，MgS04 ? 7H20 75mg ? I71，CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71，柠 樣酸 6mg ? L S 朽1 樣酸铁按 6mg ? L S EDTANa2 lmg ? L \ Na2C03 20mg ? L \ H3B03 2. 86mg ? L S MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? L_\ Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始pH值在7?8之间，接种后的藻细胞密度为 0. 35 ?0. 40X 106cells ? mL、
3. -种如权利要求2所述的四尾栅藻SDEC-8培养基，其特征在于：培养基成份和用量 为 NaN03 1500mg ? I71，K2HP04 40mg ? I71，MgS04 ? 7H20 75mg ? I71，CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71，柠 樣酸 6mg ? L S 朽1 樣酸铁按 6mg ? L S EDTANa2 lmg ? L \ Na2C03 20mg ? L \ H3B03 2. 86mg ? L S MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? L_\ Co (N03)2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始 pH 值=7. 1，接种后的藻细胞密度为 0? 37X 106cells ? mL 丄。
4. 一种如权利要求3所述的四尾栅藻SDEC-8培养基的应用，其特征在于，所述的培养 基培养四尾栅藻SDEC-8,得到四尾栅藻SDEC-8藻粉。
5. 如权利要求4的应用，其特征在于，所述四尾栅藻SDEC-8藻粉的脂肪酸甲酯含量 9. 55mg ? g-1，饱和脂肪酸含量为80%，十六烷值为61. 38,碘值为29. 38gl2/100g。
6. -种培养权利要求1的四尾栅藻SDEC-8的培养方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 将四尾栅藻SDEC-8培养于添加BG11的培养基中，培养温度为25±1°C，全光照，光 照强度2000-3000Lux，培养7天； b) 将所得藻细胞转移至BG11培养基中进行扩大培养，曝气气液比为0. 1-0. 2vvm，培养 温度为25 ± 1 °C，全光照，光照强度2000-3000Lux，待四尾栅藻SDEC-8生长到稳定期两天时 离心、干燥即得到培养后四尾栅藻SDEC-8藻粉。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中培养条件：培养温度为25±1°C， 光照为2500Lux的连续光照，曝气气液比为0. 2vvm。
8. -种如权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8在处理富营养化湖泊中的应用。
9. 权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8进行含氮和/或含磷废水的净化的应用。
10. 权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8用于生产高效油脂、脂肪酸、蛋白质、淀粉、色 素、多糖和/或核酸的应用。
【文档编号】C12P7/64GK104328053SQ201410628249
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】裴海燕, 宋明明, 胡文容, 张硕, 韩琳, 韩飞 申请人:山东大学