一种microRNA比色传感器的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于功能核酸的microRNA(miRNA)比色传感器，该传感器通过引入分子信标以实现对靶miRNA的高特异性的识别，通过链替代聚合反应（SDA）、nicking trigger引发的滚环扩增，及DNAzyme信号放大等生物放大策略实现对痕量miRNA高灵敏的检测。应用本发明的传感器对miRNA进行检测，miRNA的浓度在10aM-1nM范围内呈线性关系，线性方程式为Y=0.5929+0.02916LogX，相关系数为0.994，最低检测限为5aM。与现有技术比较，所述传感器灵敏度高、特异性好、成本低、操作简便，检测周期短，适用于实际样品的测定。
【专利说明】-种microRNA比色传感器的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种比色传感器的制备与应用。
【背景技术】
[0002] microRNA (miRNA)是一类新型的肿瘤标志物，由含莖环结构的miRNA前体经Dicer 酶加工而成的一类高度保守的非编码单链小RNA分子（约19-23个核苷酸），其表达具有 时序性和组织特异性，通过降解mRNA或抑制蛋白的翻译来调节靶基因的表达，在细胞生 长、增殖、凋亡、应激及肿瘤的发生发展中起着重要作用。miRNA在细胞、组织、血清及体液 中均可检测到，其通过激活癌基因或沉默抑癌基因诱导肿瘤的发生，在肿瘤组织中miRNA 表现与正常组织含量完全不同的异常表达，研究发现80%以上的肿瘤组织中miRNA-126、 miRNA-143及miRNA-145明显表达下调，相反另一些miRNA如miRNA-21则明显表达上调， 提示某些特异性miRNAs的异常表达通常对一些肿瘤的发生发展具有重要的提示意义，如 miRNA-21是血清中最早发现的一类miRNA，其在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中高表达， 而另一些 miRNA (如循环外泌体 miRNA21、miRNA144、miRNA200a、miRNA200b、miRNAc 等） 的异常表达或表达量的调整同样见于卵巢癌患者，胃癌患者中miR-20b、miR-20a、miR-17、 miR-21等表达上升，乳腺癌中miRNA-21、miRNA-195及miRNA-155表达上升。与mRNA相 t匕，miRNA体内代谢周期长，含量仅占总mRNA的约0. 01%，单个细胞中的平均拷贝数约为 500,不同类型miRNA量的差异范围达到数量级，其在组织、血液和体液中能抵抗内源性RNA 酶的降解，在极端环境中（如冷冻、培化和强酸强碱）也能保持稳定。研究证明将患者血清 中异常表达的miRNA与其他常见肿瘤标志物（如CA125)联合检测有助于提高卵巢癌的早 起诊断敏感性或特异性进而提高早期诊断率。因此，miRNA作为一种新型肿瘤标志物在分 子水平上对肿瘤的早期筛查、早期诊断、临床治疗及预后起着至关重要的作用。miRNA对临 床肿瘤的早期检测及诊疗监测具有重要意义，但由于miRNA具有痕量、序列短及序列相似 性高的特点，这对其检测方法应用于实际临床实践的灵敏度和特异性提出了很高的要求， 传统的常规检测方法通常不能满足临床工作对肿瘤早期、快速、准确检测的实际需要。近年 来，随着对miRNA功能研究的不断深入，miRNA的检测与生物分析方法已不断发展为分子生 物学和生物医学的重要研究领域。传统的miRNA检测方法主要有Northern印迹、微阵列 杂交、RT-PCR等，但各种方法互有优劣，目前尚缺乏简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。 Northern印迹是最早用于各种miRNA分析的技术，被认为是miRNA研究分析的金标准，该 方法由于检测步骤复杂、耗时长、通量低、灵敏度低且需对大量的样品进行检测，不适于对 日常miRNA进行分析。微阵列技术具有高通量检测能力并能对多种miRNA进行分析，然序 列短及序列相似性高的miRNA具有交叉杂交的可能性，导致该方法的灵敏度及特异性均降 低，因而只适于一般的筛查分析，而不适于精确定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特异 性和灵敏度而被广泛用于miRNA的检测，但操作过程需要逆转录步骤和温度循环，且需设 计引物及昂贵仪器，从而限制了该方法的使用。
[0003] 因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，现有技术旨在建立一 种比色传感器用于miRNA的快速、灵敏、特异检测。
【发明内容】
[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种检测miRNA的比色传 感器，包括扩增反应体系和催化反应体系，所述扩增反应体系包括针对miRNA的茎环模板、 哑铃状滚环模板、具有链置换活性的DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、dNTP、缓冲体系。
[0005] 优选地，所述扩增反应体系中，所述茎环模板是由分子信标MB和功能核酸⑶NA杂 交获得的MB/⑶NA。
[0006] 优选地，所述分子信标MB包括3个DNA片段，片段I为特异性识别miRNA的茎环 部分，片段II为与功能核酸GDNA互补的部分，片段III的互补序列与哑铃状滚环模板部分互 补。
[0007] 优选地,所述分子信标MB的序列如SEQ ID NO. 1所示,具体为：
[0008] 5，-GTCAGATGAATTCGTGTGAGAGCACCTCAGCCCGCCCAACGCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCT AGACGCGCG-3,。
[0009] 更优选地，所述分子信标MB的序列，具体为：
[0010] 5，-GTCAGATGAATTCGTGTGAGAGCACCTCAGCCCGCCCAACGCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCT AGACGCGCG 6C SPACER-3'。该序列可以防止非特异性扩增。
[0011] 优选地，所述G-DNA的序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为：
[0012] 5' -GGGTTGGGCGGGTTGGG-3'
[0013] 更优选地，所述G-DNA的序列，具体为：
[0014] 5'-GGGTTGGGCGGGTTGGG 6C SPACER-3'。该序列可以防止非特异性扩增。
[0015] 优选地，所述分子信标MB和功能核酸⑶NA的摩尔比例为I : 1?1. 6:1，更优选为 1. 2:1，在该比例下背景信号最小。
[0016] 优选地，所述扩增反应体系中，所述茎环模板的终浓度为0. 1?5μΜ，更优选为 1 μ Mo
[0017] 本发明的传感器通过引入所述茎环模板，能够实现对靶miRNA的高特异性的识 别。
[0018] 优选地，所述哑铃状滚环模板的序列如SEQ ID NO. 3,具体为：
[0019] 5，-GTGAGAGCCCAACCCGCCCTACCCTAGACCTCAGCTCTCACACGAATTCCCGTCAGATGAATTCG T-3，。
[0020] 优选地，所述哑铃状滚环模板为5'端磷酸化的模板。
[0021] 优选地，所述扩增反应体系中，哑铃状滚环模板的终浓度为IOOng/ μ L?600ng/ μ L，更优选为500ng/y L。
[0022] 所述哑铃状滚环模板通过自身互补链接3'端和5'端，简化了常规线性滚环模板 的反应所需的步骤。
[0023] 本发明的传感器，引入茎环模板和哑铃状滚环模板，通过链替代聚合反应（SDA)、 nicking trigger引发的滚环扩增的生物放大策略，可实现对痕量miRNA的高灵敏的检测。
[0024] 进一步地，所述扩增反应体系中，所述具有链置换活性的DNA聚合酶是Phi29 DNA Polymerase ;所述限制性核酸内切酶是Nb. BbvCI。
[0025] 优选地，所述扩增反应体系中，Phi29 DNA Polymerase的终浓度为0· 1?0· 2U/ μ L，更优选为0· 2υ/μ L。
[0026] 优选地，所述扩增反应体系中，Nb. BbvCI的终浓度为0. 05?0. 25U/ μ L，更优选为 I. 5U/y L0
[0027] 进一步地，所述扩增反应体系中，缓冲体系选自Phi29DNA Polymerase Buffer和 Cutsmart buffer。
[0028] 优选地，所述扩增反应体系还包括BSA和RNase。
[0029] 扩增反应体系中，dNTP、BSA、Phi29DNA Polymerase Buffer、Cutsmart buffer、 RNase均为常见组分，其含量亦为常规。一般而言，dNTP含量为IOmM,使用终浓度为200 μ M， RNase 终浓度含量为 lU/ul，BSA、Phi29DNA Polymerase Buffer、Cutsmart buffer 则稀释 为IX左右即可。
[0030] Phi29DNA Polymerase> Nb. BbvCI> dNTP> BSA> Phi29DNA Polymerase Buffer> Cutsmart buffer、均可经市售途径购买获得，市售染料会有不同的浓缩倍数（如20X， 50X)，在配置扩增反应体系时，一般作适当的稀释即可。
[0031] 优选地，扩增反应在 I X Phi29DNA Polymerase Buffer 和 I X Cutsmart buffer 混 合液中进行，每100 μ L扩增反应体系中包含如下成分，其终浓度分别为：
【权利要求】
1. 一种检测miRNA的比色传感器，包括扩增反应体系和催化反应体系，所述扩增反应 体系中包括针对miRNA的茎环模板、哑铃状滚环模板、具有链置换活性的DNA聚合酶、限制 性核酸内切酶、dNTP、缓冲体系。
2. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述扩增反应体系中，所述茎环模 板是由分子信标MB和功能核酸GDNA杂交获得的MB/GDNA，所述分子信标MB的序列如SEQ ID NO. 1所示，所述功能核酸⑶NA的序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 根据权利要求2所述的比色传感器，其特征在于，所述分子信标MB和功能核酸GDNA 的摩尔比例为1:1?1. 6:1。
4. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述扩增反应体系中，所述茎环模 板的终浓度为〇. 1?5 y M。
5. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述哑铃状滚环模板的序列如SEQ ID NO. 3。
6. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述扩增反应体系中，哑铃状滚环 模板的终浓度为l〇〇ng/ ii L?600ng/ y L。
7. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述扩增反应体系中，所述具有链 置换活性的DNA聚合酶是Phi29DNA Polymerase ;所述限制性核酸内切酶是Nb.BbvCI ;所述 缓冲体系选自 Phi29DNA Polymerase Buffer 和 Cutsmart buffer。
8. 根据权利要求1所述的比色传感器，其特征在于，所述催化反应体系包括Hemin、 ABTS2-和 H202。
【文档编号】C12Q1/68GK104404140SQ201410629839
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】丁世家, 李丹丹, 程伟, 颜玉蓉, 袁泰先, 张晔, 李胜强, 丁小娟, 袁睿, 吴茳铃 申请人:重庆医科大学