同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法
【专利摘要】同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，步聚如下：①制备低渗液；②制备精子形态固定液；③单纯 精子低渗、形态固定 处理；④固定精子形态的精液，离心处理，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释，得稀释精液；⑤稀释精液与磷酸盐缓冲液充分混匀，离心，去上清液，精子沉淀物加磷酸盐缓冲液洗涤，最后得洗涤后的精子沉淀物加明胶，得配置精液；⑥所述的配置精液置入载玻片上，干燥；⑦将载玻片在25℃条件下加精子形态固定液固定；⑧载玻片中加入的苯胺蓝染色；⑨载玻片用自来水冲洗，然后将载玻片侵泡0.9%(重量)氯化钠中脱色；⑩载玻片自然晾干或吹干，加甘油封固液2滴，盖玻片封片。
【专利说明】同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法
[0001]
【技术领域】
本发明涉及一种实验方法，确切地说是一种同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法。
[0002]【背景技术】:
细胞通过细胞膜进行物质交换和新陈代谢活动。精子在发生过程中极易受到外界因素和化学物质的影响，精子膜对这些物质的传递能力直接影响精子的活力和新陈代谢，从而关系到精子能否获能，完成受精的全过程。人类精子的核成熟是精子结构功能成熟的关键环节，对于维持遗传物质的完整性、保证父方遗传信息的正确传递，具有重要的意义。精子核成熟不良，能对精子功能和受精结局造成较大的不良影响。研究发现，精子膜是否完整与精子核蛋白是否异常，两者的结果相结合可作为临床评价男性生育力的指标之一，有助于提高判定男性是否不育准确度，为男性不育的预防和治疗提供咨询及诊断重要参考依据，为探讨男性不育发病机制提供新的方向。但是，目前，检测精子膜是否完整的方法和检测精子核蛋白是否异常的方法需分别进行，即需要采集两组精液分别进行不同的检测。然而，只有同组精液同时检测精子膜是否完整及精子核蛋白是否异常的结论才具有参考价值。现有的实验方法均难以同时判断同一条精子的膜及核蛋白是否有受损，难以对精子的质量作出精确的评价。
[0003]
【发明内容】
:
本发明的目的是，提供一种同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，该方法可以同时显示同一条精子膜是否完整及核蛋白是否完整。解决了单一实验方法存在的缺陷，能够更精确地评价精子质量，为临床提供一种同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，其步聚如下:
[0005]①制备低渗液；
低渗液为每1001111蒸馏水中含0.7358柠檬酸钠和1.358果糖，离子强度为0.15，渗透压15011108111八讲20 (摩斯摩尔，即毫渗量)的溶液。
[0006]②制备精子形态固定液
(1)将薯蓣洗净，切片，在541干燥2小时，粉碎至90目，得到干燥后的薯蓣粉末；
(2)将步骤(1)所得干燥后的薯蓣粉末加入石油醚中得到混合浆液，将混合浆液于901回流4501！！，过滤混合浆液，得薯蓣粉末滤饼；所述干燥后的薯蓣粉末和石油醚的质量体积比为18:2?31111 ；
(3)将步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼在701下干燥1.5小时，加入乙醇和水体积比为4:1的混合液浸泡3.5小时，回流1小时后过滤，得到滤饼；所述步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼和混合液的质量体积比为18:2^1 ；
(4)将步骤(3)所得滤饼加入蒸馏水中浸泡1小时，用微波加热进行提取，微波功率为800^微波加热间歇进行，累计加热时间5分钟，过滤，得到滤饼残渣；所述步骤(3)所得滤饼和蒸馏水的质量体积比为:90^10001 ；
(5)将步骤(4)所得滤饼残渣加入石油醚中萃取2次，收集上层液，萃取时步骤(4)所得滤饼残渣和石油醚的质量体积比为18:100^1 ；
(6)将步骤(5)所得上层液加入水饱和的正丁醇中，萃取3次，每次萃取时上层液和水饱和的正丁醇的体积比为1:1 ；萃取后静置分层，收集下层液；将下层液进行减压蒸馏除去溶剂，干燥1小时，得到薯蓣皂苷元；把上步中的薯蓣皂甙元加入100%无水乙醇中溶解，配制浓度为21118/1111的精子形态固定液。
[0007]③单纯精子低渗、形态固定处理:
向每11111步骤①中所述的低渗液11111加入精液0.11111，混匀，在水温为37。〇的水中水浴20分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；将上述的低渗处理后精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精子沉渣用步骤②中所述的精子形态固定液0.稀释混匀，在水温为371的水中水浴5分钟，得固定精子形态的精液；
④取0.步骤③中所述的固定精子形态的精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10^1071111得稀释精液；
⑤取步骤④中所述的稀释精液0.与0.磷酸盐缓冲液充分混匀，1000转/分离心3分钟，去上清液，精子沉淀物加0.101磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤次数可为3次，最后得洗涤后的精子沉淀物加0.明胶，得配置精液；
⑥吸取步骤⑤中所述的配置精液20微升置入载玻片上，空气中自然干燥；
⑦将步骤⑥中所述的载玻片在251条件下加②中所述的精子形态固定液0.固定1.5分钟；
⑧室温下向步骤⑦所述的载玻片中加入0.4001/1的苯胺蓝染色5分钟，使载玻片上的精液充分染色；
⑨将步骤⑧中所述的载玻片用自来水缓慢冲洗，然后将载玻片侵泡0.9%^重量)氯化纳中脱色19分钟；
⑩将步骤⑨中所述的载玻片自然晾干或吹干，加甘油封固液2滴，盖玻片封片；在普通光学显微镜油镜(放大1000倍)下观察载玻片的200个精子。
[0008]所述步骤①中所述的蒸馏水是去离子水。
[0009]本发明的有益效果在于:它可同时检测精子核蛋白及膜完整性，所得结论更具备临床参考价值。共测定62例正常生育男性，得出同时检测精子核蛋白及膜完整性实验与单独检测膜完整性实验不同的结论，即精子在低渗溶液里进行实验后，接着进行精子苯胺蓝染色核蛋白检测，得到的精子形态变化及核蛋白改变共有4种类型(八-0),其中:
八型精子是精子膜与核蛋白均完整的，精子头部未被苯胺蓝染色而尾部肿胀，这种精子是具有活动能力或是活的，是正常的精子；
8型精子是核蛋白完整而精子尾部膜受损，精子头部未被苯胺蓝染色而尾部未肿胀，我们观察到这种精子是有活动能力的精子；如果单纯用精子低渗肿胀实验判断，结果这种8型精子就是死的或没有活动能力的精子；
0型精子是精子核蛋白受损而尾部膜未受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部肿胀，这种精子在单纯精子低渗肿胀实验里就判断为活动的精子，因为精子尾膜是肿胀的，即完整的。我们的实验结果证实了单纯精子低渗肿胀实验对于判断精子活动能力和膜的完整性是不完全的。
[0010]0型精子是精子核蛋白受损而尾部也受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部未肿胀，这种精子是死精子，在单纯精子低渗肿胀实验中这种精子也是死亡的精子。
[0011]对于八型精子和0型精子，单纯精子低渗肿胀实验和精子低渗肿胀实验/苯胺蓝染色精子核蛋白检测结合实验判断结果是一致的，即八型精子是活动的和头膜-尾膜完整的精子，0型精子是精子核蛋白和膜均损伤的精子，是死亡的精子，但对8型精子，单纯精子低渗肿胀实验只能判断其为死精子，实际上这种精子是活精子，只是精子尾部膜受到损伤；而对型精子的判断，单纯精子低渗肿胀实验则判断为活精子，实际上这种精子是死精子，应用精子低渗肿胀实验/精子苯胺蓝染色核蛋白检测结合实验，就能对这些精子做出正确判断。
[0012]人体正常体液渗透压约为313！1108111八曲20，细胞在低于此渗透压阈值的情况下就会发生肿胀甚至破裂，而高于此阈值则会导致皱缩。精子也是人体的一种细胞(生殖细胞)，在313！1108111八曲20条件下其形态不发生改变。我们把从中药山药萃取得到的薯蓣皂甙元加入无水乙醇中溶解，薯蓣皂甙元为醇溶性的，有很好的固定精子的作用，这样精子在加入苯胺蓝染色实验中处理精子所用的磷酸盐缓冲液(即义高渗液，渗透压大于时精子卷曲肿胀的尾部就不会再由于高渗液的作用而不再卷曲肿胀，这是做好本实验的关键。此外，我们将原来精子苯胺蓝染色实验中所用的固定液甲醇用薯蓣皂甙元乙醇液替代，效果很好。甲醇是具有较高毒性的有机溶剂，试验中不小心溅到眼里能够引起失明，挥发后对环境也有不利影响。
[0013]步骤③中如果不加精子形态固定液而直接进入步骤④中，加入磷酸盐缓冲液(^88)后精子因为进入等渗或高渗透压的液体中肿胀的尾部会解除肿胀，就不能够观察到同一个精子头部核蛋白及尾部膜的改变。
[0014]表1应用单纯精子低渗！！03、单纯精子仙核蛋白检测及二者结合实验正常生育男性检测结果比较。
[0015]II 1105/八8 结合(%)^单钝八8 (%)^单钝！105 (%)
八型 66 69.8^4.2 (未染色)83.4^5.7^(1103 肿胀)73.3^5.8
8 型 66 12.5^1.8 型 66 4.5^0.7 0 型 66 13.2 + 1.6 — (染蓝色)16.6 + 2.2- 出05 未肿张)26.7 + 2.5 氺？〈0? 01及林？?0^ 001，八8与单纯！！08实验比较。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是!103/仙结合实验正常八型精子图像，头部未被苯胺蓝染色而尾部肿胀，精子膜与核蛋白均完整的，是活动的正常精子；图2是8型精子，是核蛋白完整而精子尾部膜受损，精子头部未被苯胺蓝染色而尾部未肿胀，我们观察到这种精子是有活动能力的精子；图3是型精子，精子核蛋白受损而尾部膜未受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部肿胀，这种精子在单纯精子低渗肿胀实验里就判断为活动的精子，因为精子尾膜是肿胀的，即完整的；图4是0型精子，是精子核蛋白受损而尾部也受损，精子头部被苯胺蓝染色而尾部未肿胀，这种精子是死精子；图5是！103/仙结合实验结果，可见尾部肿胀头部被苯胺蓝染色的精子；图6是单纯！！03实验精子图像。上述图像都是在显微镜下放大1000倍所观察到的。
【具体实施方式】
[0017]同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，其步聚如下:
[0018]①制备低渗液
低渗液为每1001111蒸馏水中含0.7358柠檬酸钠和1.358果糖，离子强度为0.15，渗透压15011108111八曲20 (摩斯摩尔，即毫渗量)的溶液。所述离子强度的单位是11101八8。
[0019]②制备精子形态固定液
(1)将薯蓣洗净，切片，在541干燥2小时，粉碎至90目，得到干燥后的薯蓣粉末；
(2)将步骤(1)所得干燥后的薯蓣粉末加入石油醚中得到混合浆液，将混合浆液于901回流4501！！，过滤混合浆液，得薯蓣粉末滤饼；所述干燥后的薯蓣粉末和石油醚的质量体积比为18:2?31111 ；
(3)将步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼在701下干燥1.5小时，加入乙醇和水体积比为4:1的混合液浸泡3.5小时，回流1小时后过滤，得到滤饼；所述步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼和混合液的质量体积比为18:2^1 ；
(4)将步骤(3)所得滤饼加入蒸馏水中浸泡1小时，用微波加热进行提取，微波功率为800^微波加热间歇进行，累计加热时间5分钟，过滤，得到滤饼残渣；所述步骤(3)所得滤饼和蒸馏水的质量体积比为:90^10001 ；微波加热间歇进行的具体操作可以是:每加热1111111 停一次，每次停 10-208，
(5)将步骤(4)所得滤饼残渣加入石油醚中萃取2次，收集上层液，萃取时步骤(4)所得滤饼残渣和石油醚的质量体积比为18:100^1 ；
(6)将步骤(5)所得上层液加入水饱和的正丁醇中，萃取3次，每次萃取时上层液和水饱和的正丁醇的体积比为1:1 ；萃取后静置分层，收集下层液；将下层液进行减压蒸馏除去溶剂，干燥1小时，得到薯蓣皂苷元；把上步中的薯蓣皂甙元加入100%无水乙醇中溶解，配制浓度为21118/1111的精子形态固定液。
[0020]③单纯精子低渗、形态固定处理:
向每11111步骤①中所述的低渗液11111加入精液0.11111，混匀，在水温为37。〇的水中水浴20分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；将上述的低渗处理后精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精子沉渣用步骤②中所述的精子形态固定液0.稀释混匀，在水温为371的水中水浴5分钟，得固定精子形态的精液；
④取0.步骤③中所述的固定精子形态的精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10^1071111得稀释精液；
⑤取步骤④中所述的稀释精液0.与0.磷酸盐缓冲液充分混匀，1000转/分离心3分钟，去上清液，精子沉淀物加0.101磷酸盐缓冲液洗涤3次，最后得洗涤后的精子沉淀物加0.明胶，得配置精液；
⑥吸取步骤⑤中所述的配置精液20微升置入载玻片上，空气中自然干燥；
⑦将步骤⑥中所述的载玻片在251条件下加②中所述的精子形态固定液0.固定1.5分钟；
⑧室温下向步骤⑦所述的载玻片中加入0.411101/1的苯胺蓝染色5分钟，使载玻片上的精液充分染色；
⑨将步骤⑧中所述的载玻片用自来水缓慢冲洗，然后将载玻片侵泡0.9%^重量)氯化纳中脱色19分钟；
⑩将步骤⑨中所述的载玻片自然晾干或吹干，加甘油封固液2滴，盖玻片封片；在普通光学显微镜油镜(放大1000倍)下观察载玻片的200个精子；
步骤①中所述的蒸馏水是去离子水。
[0021]本发明未详尽描述的技术内容均为公知技术。
【权利要求】
1.同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，其特征在于:步聚如下: ①制备低渗液: 低渗液为每10ml蒸懼水中含0.735g朽1檬酸钠和1.35g果糖,渗透压150m0sm/kgH20的溶液； ②制备精子形态固定液: 将薯蓣洗净，切片，在54°C干燥2小时，粉碎至90目，得到干燥后的薯蓣粉末； 将步骤(I)所得干燥后的薯蓣粉末加入石油醚中得到混合浆液，将混合浆液于90°C回流45min，过滤混合浆液，得薯蓣粉末滤饼；所述干燥后的薯蓣粉末和石油醚的质量体积比为 Ig:2?3ml ； 将步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼在70°C下干燥1.5小时，加入乙醇和水体积比为4:1的混合液浸泡3.5小时，回流I小时后过滤，得到滤饼；所述步骤(2)所得薯蓣粉末滤饼和混合液的质量体积比为Ig:2"3ml ； 将步骤(3)所得滤饼加入蒸馏水中浸泡I小时，用微波加热进行提取，微波功率为800w，微波加热间歇进行，累计加热时间5分钟，过滤，得到滤饼残渣；所述步骤(3)所得滤饼和蒸馏水的质量体积比为Ig:9(Tl00ml ； 将步骤(4)所得滤饼残渣加入石油醚中萃取2次，收集上层液，萃取时步骤(4)所得滤饼残渣和石油醚的质量体积比为Ig:100ml ； 将步骤(5)所得上层液加入水饱和的正丁醇中，萃取3次，每次萃取时上层液和水饱和的正丁醇的体积比为1:1 ;萃取后静置分层，收集下层液；将下层液进行减压蒸馏除去溶齐U，干燥I小时，得到薯蓣皂苷元；把上步中的薯蓣皂甙元加入100%无水乙醇中溶解，配制浓度为2mg/ml的精子形态固定液； ③单纯精子低渗、形态固定处理: 向每Iml步骤①中所述的低渗液Iml加入精液0.1ml，混匀，在水温为37°C的水中水浴20分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；将上述的低渗处理后精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精子沉渣用步骤②中所述的精子形态固定液0.1ml稀释混匀，在水温为37°C的水中水浴5分钟，得固定精子形态的精液； ④取0.1ml步骤③中所述的固定精子形态的精液，用1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10X106/ml得稀释精液； ⑤取步骤④中所述的稀释精液0.1ml与0.1ml磷酸盐缓冲液充分混匀，1000转/分离心3分钟，去上清液，精子沉淀物加0.1ml磷酸盐缓冲液洗涤，最后得洗涤后的精子沉淀物加0.1ml明胶，得配置精液； ⑥吸取步骤⑤中所述的配置精液20微升置入载玻片上，空气中自然干燥； ⑦将步骤⑥中所述的载玻片在25°C条件下加②中所述的精子形态固定液0.1ml固定1.5分钟； ⑧室温下向步骤⑦所述的载玻片中加入0.4mol/L的苯胺蓝染色5分钟，使载玻片上的精液充分染色； ⑨将步骤⑧中所述的载玻片用自来水缓慢冲洗，然后将载玻片侵泡0.9%(重量)氯化纳中脱色19分钟； ⑩将步骤⑨中所述的载玻片自然晾干或吹干，加甘油封固液2滴，盖玻片封片；在普通光学显微镜油镜(放大1000倍)下观察载玻片的200个精子。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测精子核蛋白及膜完整性的方法，其特征在于:所述步骤①中所述的蒸馏水是去离子水。
【文档编号】C12Q1/02GK104357533SQ201410629753
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】张美华, 王磊光, 仕治达, 邱毅 申请人:山东省计划生育科学技术研究所