利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法及其引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及作物分子育种【技术领域】，尤其涉及利用分子标记检测瓠瓜果实苦味的方法。发明采用特殊混池的BSA方法，筛选到杭州长瓜和蒲县瓠瓜中与苦味互补基因连锁的InDel标记BID89及BID50，利用这两个标记扩增待检测的材料，可以根据两标记的基因型组合，推测其含有的互补基因的类型，进而推测该品种的果实是否会出现苦味，鉴别技术简单，易于应用。CGMCC 972220140924
【专利说明】利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法及其引物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及作物分子育种【技术领域】，尤其涉及利用分子标记检测瓠瓜果实苦味的 方法。
【背景技术】
[0002] 瓢瓜[Zageaaria siceraria (Molina) Standi.]，又名长瓜、蒲瓜、夜开花、葫芦 等，隶属葫芦科（β/ca^iiaceae)葫芦属（Zageftaria)。瓢瓜主要以嫩果做蔬菜用，在我国 已经有7000多年的栽培历史，是南方地区夏季重要的瓜类蔬菜作物之一。瓠瓜果实变苦是 影响瓠瓜生产最突出的问题之一，即使少量食用苦味瓠瓜也会造成人畜中毒；在生产中只 要出现少量苦味瓠瓜，其它同批的瓠瓜就无法进入市场，给生产者特别是专业化、规模化生 产基地带来巨大的经济损失，严重影响了瓠瓜产业的健康发展。前人研究表明，瓠瓜苦味受 一对互补基因控制，即只有显性基因与J共同存在时全株果实才产生浓烈苦味（张谷曼 1981)。遗传分析显示，基因型为SS妨iJi、SS妨i/i的单株果实呈现苦味，基 因型为的单株果实不会出现苦味。目前在生产 中，苦味的鉴别主要依赖于植株开花结果后对果实的感官品尝，受时间限制强，感官品尝后 又极易对人体造成为害。对单个瓠瓜品种来说，果实苦味源于其双亲分别携带的苦味互补 基因聚合后互作的表型。利用与目标基因（苦味基因）紧密连锁的分子标记，可以方便地检 测出某一品种是否携带目标基因，进而推断目标性状的表型(果实苦味有无)，对指导瓠瓜 育种和生产上避免损失具有重要的实际意义。
[0003] 分子标记即可识别的等位变异，简单的说，就是对两个材料同时扩增基因组上的 一段序列后，可以通过电泳技术或杂交信号区分出二者之间的差异。目前在瓠瓜上，尚未报 道与苦味基因连锁的分子标记及利用分子标记鉴别果实苦味的方法。
[0004] 分子标记类型众多，检测手段各有差异。基于PCR的分子标记，因其技术简单、成 本低，重复性高在作物中得到广泛的应用，一般的实验室均可操作。常见的基于PCR的分 子标记包括SSR、InDel、CAPs等类型。（说明：SSR，Simple Sequence Repeat，简单序列重 复，即在某一基因组区段上出现几个核苷酸组合的串联重复，通过扩增两亲本的串联区段， 根据串联重复数目的差异区分不同品种；InDel，Insertion-deletion,插入缺失标记，指的 是两种亲本在基因组上的差异，相对于另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定 数量的核苷酸插入或缺失；CAPs, Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，酶切扩增 多态性序列，根据已知某一段基因组序列上的酶切位点设计引物，扩增该片断后用专一的 限制性内切酶酶切扩增产物，电泳分离后能够酶切的亲本将出现两条带，不能酶切的亲本 依然出现一条带，据此区分不同亲本。）。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种与瓠瓜品种果实苦味基因连锁的InDel标记，本 发明的第二个目的是提供一种筛选上述的InDel标记的方法，本发明的第三个目的是提供 一种利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法，本发明首先利用特殊混池 BSA方法，获 得与苦味基因连锁的分子标记，进而利用这些标记扩增需要鉴别的品种，根据其基因型判 断该品种所结的果实是否呈现苦味。
[0006] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 一种与瓠瓜品种果实苦味基因连锁的InDel标记，该InDel标记由BID50引物组和 BID89引物组构成，其引物序列如下： BID50 上游引物：5，- ccatgagccaagagcca-3，； BID50 下游引物：5，- gctgtgtctcttgaagctctaa-3，； BID89 上游引物：5，- cgcttctggtttataggtttac-3，； BID89 下游引物：5，- gctaaaccaatcaaaacctaag-3，。
[0007] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 一种筛选上述的InDel标记的方法，该方法包括以下的步骤： 1) 群体及材料准备：选择无苦味的杭州长瓜和蒲县瓠瓜杂交，其F1代植株所结的果实 均呈现苦味，F2代植株果实苦与不苦出现9:7的分离； 2) 特殊BSA池构建：在&代，选择6株果实无苦味的单株构建杂合池，;将果实出现苦 味的&代单株继续种植，鉴定其子代的果实，选择子代果实苦味不分离的F 2单株建成纯合 池； 3) 标记筛选：利用162对InDel标记在亲本间和两池间进行多态性筛选，筛选到InDel 标记BID89在纯合池中只出现和杭州长瓜一致的条带，在杂合池中同时出现了两亲本的条 带；BID50在纯合池中只出现和蒲县瓢瓜一致的条带，在杂合池中同时出现两亲本的条带。
[0008] 为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案： 一种利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法，该方法包括以下的步骤： 1) DNA提取、PCR反应及电泳：DNA提取采用试剂盒，按照说明提取；PCR反应体积为 12. 5μ 1，包含 10 - 20 ng模板DNA，IXPCR buffer，50 mM KC1，0. I mM dNTP，0. 75 - I. 5 mM MgCl2,0. 2 μΜ引物，IU Taq聚合酶；所述的引物采用权利要求1所述的BID50引物组或 BID89引物组，BID89引物组与BID50引物组的PCR反应程序为94°C预变性3分钟，94°C变 性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸40秒，循环35次，最后72°C总延伸5分钟，4°C保存；取 3μ1 PCR产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，Acr = Bis = 19:1或39:1，指示剂为 二甲苯青，电泳电压为200V，电泳时间1小时，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件 对图片进行处理，观察； 2) 检测结果分析：根据电泳结果对BID50、BID89的带型进行赋值，带型与杭州长瓜一 致的赋值为1，与蒲县瓠瓜一致的赋值为〇,杂合带型赋值为2,赋值后的组合将出现以下情 况：
【权利要求】
1. 一种与瓠瓜品种果实苦味基因连锁的InDel标记，其特征在于该InDel标记由 BID50引物组和BID89引物组构成，其引物序列如下：
2. -种筛选权利要求1所述的InDel标记的方法，其特征在于该方法包括以下的步 骤： 1) 群体及材料准备：选择无苦味的杭州长瓜和蒲县瓠瓜杂交，其匕代植株所结的果实 均呈现苦味，F2代植株果实苦与不苦出现9:7的分离； 2) 特殊BSA池构建：在&代，选择6株果实无苦味的单株构建杂合池，;将果实出现苦 味的&代单株继续种植，鉴定其子代的果实，选择子代果实苦味不分离的F2单株建成纯合 池； 3) 标记筛选：利用162对InDel标记在亲本间和两池间进行多态性筛选，筛选到InDel 标记BID89在纯合池中只出现和杭州长瓜一致的条带，在杂合池中同时出现了两亲本的条 带；BID50在纯合池中只出现和蒲县瓢瓜一致的条带，在杂合池中同时出现两亲本的条带。
3. -种利用分子标记鉴别瓠瓜品种果实苦味的方法，其特征在于该方法包括以下的步 骤： 1. DNA提取、PCR反应及电泳：DNA提取采用试剂盒，按照说明提取；PCR反应体积为 12. 1，包含 10 - 20ng模板DNA，1XPCRbuffer，50mMKC1，0. 1mMdNTP，0. 75 - 1. 5mM MgCl2,0. 2iiM引物，1UTaq聚合酶；所述的引物采用权利要求1所述的BID50引物组或BID89引物组，BID89引物组与BID50引物组的PCR反应程序为94°C预变性3分钟，94°C变 性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸40秒，循环35次，最后72°C总延伸5分钟，4°C保存；取 3illPCR产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，Acr:Bis= 19:1或39:1，指示剂为 二甲苯青，电泳电压为200V，电泳时间1小时，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件 对图片进行处理，观察； 2) 检测结果分析：根据电泳结果对BID50、BID89的带型进行赋值，带型与杭州长瓜一 致的赋值为1，与蒲县瓠瓜一致的赋值为〇,杂合带型赋值为2,赋值后的组合将出现以下情 况：
【文档编号】C12Q1/68GK104480107SQ201410639499
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】吴新义, 吴晓花, 徐沛, 汪宝根, 鲁忠富, 胡耀文, 李国景 申请人:浙江省农业科学院