一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的方法。将分离自韩国庆南南海岸一带土壤的、能够制造出高聚合度壳寡糖的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)AMI09接种到LB培养液内，然后通过振荡培养得到接种用培养液，对大量培养于MS培养基的培养液进行离心分离得到上清液，浓缩所述上清液后进行洗涤，实施离子交换层析和凝胶过滤层析处理，最后用去离子水透析，由此制造出壳聚糖酶。由本发明的菌株制成的耐热性壳聚糖酶，在60℃的反应条件下也可以稳定地制造出6糖含量高的高聚合度壳寡糖。
【专利说明】一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的 方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚醣是由D-氨基葡萄糖通过β_1，4键连接而成的多糖类，一般通过甲壳素 (chitin)脱去乙酰基的方法来制成。这种壳聚糖作为分子量达到数十万道尔顿的高分子物 质可应用于各种生产领域，但由于存在粘性高、不溶于中性或碱性水的问题而限制了其在 生产上的应用。为了解决该技术难题，人们尝试了通过分解壳聚醣来制造水溶性壳寡糖的 方法。通过尝试得知当所制成的壳寡糖具有6糖以上聚合度时，其具有较大的增强人体免 疫性、抗肿瘤以及抗菌作用等，因此制造高聚合度壳寡糖成为现今该领域的研究趋势。
[0003] 作为通过分解壳聚醣来生产水溶性壳寡糖的制造方法，已知的有酸分解法和酶分 解法。虽然采用酸分解法的壳寡糖的制造方法比较简单，但经过壳聚糖分解而制造出来的 壳寡糖中含有大量的单糖和二糖等超低分子，而这些超低分子的壳寡糖在增强人体免疫 性、抗肿瘤和抗菌作用等方面较弱。相反，对于利用酶分解法而制造出来的壳寡糖的制造方 法，虽然其具有根据所使用的酶可获得具有各种聚合度的壳寡糖的优点，但在酶分解法中 作为核心部分的分解酶并没有得到充分开发，因此必须对高活性酶进行探索性研究。
[0004] 作为分解壳聚糖的酶已知的有壳聚糖酶（Chitosanase)，其大多主要发现于芽孢 杆菌属（Bacillus sp.)细菌内。比如韩国10-0227040号专利涉及的芽孢杆菌属GM44、韩 国10-0396833号专利涉及的芽孢杆菌属HSB-21、韩国10-0541044号专利涉及的苏云金芽 孢杆菌（Bacillus thuringiensis)、日本公开专利公报昭61-280277号所涉及的芽孢杆菌 属7-M、日本特开公报昭63-94971所涉及的环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans)LCC-U日 本特开公报平2-79972号所涉及的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)BN-262等。利用上 述微生物制造壳聚糖酶时，其酶活性为I. 0?5. 4U/mL，比较低，因此限制了其在生产上的 应用。另外，利用由上述方法制造出来的壳聚糖酶时，在壳聚糖的分解物中2糖或3糖含量 为13?40%，比较高，相反，分解物中5糖和6糖以上的壳寡糖含量仅为20%以下。而且， 目前在所开发的、用于壳寡糖生产的酶中，大部分壳聚糖酶的热稳定性较低，只能在50°C以 下的较低温度下才能保持稳定，因此在与高聚合度壳聚糖酶的反应条件方面受到了限制。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决上述现有技术中的不足，提供一种热稳定性高、能够将壳 聚糖分解成高度聚合糖的壳聚糖酶
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种壳聚糖酶，该聚糖酶分离自土壤芽孢杆菌属 AMI09菌株。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种应用上述方案中聚糖酶生产壳寡糖的方法，所述 聚糖酶为上述方案中所述的聚糖酶，包括如下步骤：
[0008] SI :从土壤试料中分离芽孢杆菌属AMI09菌株；
[0009] S2 :培养芽孢杆菌属的AMI09菌株；
[0010] S3 :从培养液中分离壳聚糖酶；
[0011] S4 :制备壳寡糖的干燥粉末。
[0012] 上述方案中优选的是，所述步骤Sl中包括如下步骤：
[0013] al:用灭菌蒸馏水稀释取自韩国庆南南海岸一带的土壤试料；
[0014] a2:将步骤al中的土壤稀释液涂抹在MS琼脂培养基上进行培养；
[0015] a3:将步骤a2中培养基上的菌落进行纯化；
[0016] a4:测定各菌落的壳聚糖酶活性、分离得到符合条件的壳聚糖酶的AMI09菌株。
[0017] 上述任一方案中优选的是，，所述a2步骤中MS琼脂培养基为含有0. 5%壳聚糖、 0· 5%酵母提取物、0· 2% Κ2ΗΡ04、0· 1% Κ2ΗΡ04、0· 07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、 0· 01% CaCl2的培养基。
[0018] 上述任一方案中优选的是，所述a2步骤中MS琼脂培养基为含有0. 5%壳聚糖、 0· 5%酵母提取物、0· 2% Κ2ΗΡ04、0· 1% Κ2ΗΡ04、0· 07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、 0· 01% CaCl2的培养基。
[0019] 上述任一方案中优选的是，所述步骤S2中包括如下步骤：
[0020] bl:利用LB琼脂培养基培养所述Sl步骤得到的芽孢杆菌属AMI09菌株；
[0021] b2:将芽孢杆菌属AMI09菌株接种到LB培养液中振荡培养，得到种子培养液；
[0022] b3:种子培养液接种到MS培养基上进行主培养，形成主培养液。
[0023] 上述任一方案中优选的是,所述LB琼脂培养基含有I. 0%细菌培养基用胰化蛋白 胨、0. 5 %细菌培养基用酵母提取物和I. 0% NaCl，PH值为7. 0。
[0024] 上述任一方案中优选的是，所述步骤S3中包括如下步骤：
[0025] Cl :取所述主培养液的上清液进行浓缩、洗涤得到初步溶液；
[0026] c2 :离子交换层处理cl步骤中的初步溶液，得到壳聚糖酶；
[0027] c3 :凝胶过滤层析处理；
[0028] c4 :离子水透析、冷冻干燥。
[0029] 上述任一方案中优选的是，采用分子量为cut-off :10000道尔顿的超滤器对主培 养液进行浓缩，采用PH值为5. 0的乙酸钠缓冲溶液进行洗涤。
[0030] 上述任一方案中优选的是，所述步骤S3中包括如下步骤：
[0031] dl :将步骤S3中的壳聚糖酶粉末溶解于含有壳聚糖的基质水溶液，形成酶反应 液；
[0032] d2 :第一次过滤酶反应液，浓缩酶反应液；
[0033] d3 :第二次过滤酶反应液，对酶反应液进行喷雾干燥。
[0034] 本发明的有益效果为：由本发明提供的聚糖酶壳聚糖酶具有较高的耐热性，在 60°C的反应条件下也可以稳定地制造出6糖含量高的高聚合度壳寡糖，且应用该壳聚糖酶 生产的壳寡糖具有较高含量的高聚合度壳寡糖。
【具体实施方式】
[0035] 为了更好地理解按照本发明方案的一种壳聚糖酶及应用该聚糖酶生产壳寡糖的 方法，下面对本发明的鱿鱼鱼块分级装置的一优选实施例作进一步阐述说明。
[0036] 为了利用酶法生产出6糖以上寡糖含量较高的壳寡糖，本发明的
【发明者】经过努力 研究发现，从韩国庆南南海岸一带的土壤分离出的芽孢杆菌属AMI09菌株内存在耐热性壳 聚糖酶，利用该耐热性壳聚糖酶在高温最适反应条件下能够高产6糖含量高的壳寡糖，从 而完成本发明。由此，本发明的目的在于，提供一种利用分离自芽孢杆菌属AMI09菌株的耐 热性壳聚糖酶生产出6糖含量高的高聚合度壳寡糖的制造方法。
[0037] 从土壤试料中分离芽孢杆菌属AMI09菌株。为了分离出可生产高聚合度壳寡糖 的菌株，将取自韩国庆南南海岸一带的土壤试料用灭菌蒸馏水稀释，然后将其涂抹在MS琼 脂培养基（〇.5%壳聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1( 2册04、0.1%1(2册04、0.07%]\^0 47!120、 0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaCl2)上。经1?2日后，对所得到的菌落进行分离纯化 后，测定各菌落的壳聚糖酶活性并分析壳聚糖分解产物壳寡糖的组成情况，由此选出可得 到壳聚糖酶活性高、聚合度高的寡糖的菌株。对所选出的菌株进行16S rDNA分析，结果发现 上述菌株属于新芽孢杆菌属（Bacillus)，因此被命名为芽孢杆菌属（Bacillus sp. )AMI09。
[0038] 下面结合具体实验对本发明做出进一步阐述。从取自韩国庆南南海岸一带的每 个土壤试料中，各取约lg，用灭菌蒸馏水IOml制成悬浮液后稀释，取0. ImL的稀释液涂 抹在15琼脂培养基（0.5%壳聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1(2即04、0.1%腿 2?04、0.07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaCl2、2% Agar、pH6. 8)上后，在 30°C温度下静 置培养一个星期，然后通过常用方法分离纯化出300多种菌株。将这些分离纯化的菌株接 种到5mLMS培养液中，并在温度30°C、180rpm条件下振荡培养5日后，对培养液进行离心分 离，回收上清液。接着，对上清液的壳聚糖酶活性以及由此而生成的壳聚糖分解产物进行分 析。壳聚糖酶的活力通过3, 5-二硝基水杨酸法、即定量测定生成自壳聚糖溶液的还原糖的 方法来进行测定。朝向溶解于IOmM乙酸钠缓冲溶液（PH5. 0)的1 %壳聚糖溶液0. 3mL中添 加酶液〇. 3mL后，在50°C温度下使其反应10分钟。反应结束后，添加 ION NaOH 0. 02mL进 行搅拌，12000rpm条件下进行5分钟的离心分离，由此分离出残留基质与反应上清液。此 时，将所得到的上清液〇.3mL添加到ImL DNS溶液中，并在沸水中加热5分钟。加热结束后 使其充分冷却，然后测定其在550nm下的吸光度，并根据用D-氨基葡萄糖检测而得到的标 准曲线，定量测定出还原糖量。壳聚糖酶的活力单位（U)被定义为，在特定条件下，一分钟 内生成Iumole的D-氨基葡萄糖的酶量。通过与上述相同的方法，从300多种分离纯化的菌 株中最终选出了壳聚糖酶活性高、且生产出高聚合度壳寡糖的菌株。将最终选出的菌株放 至Ij 5mL的MS培养液内，在温度30°C、180rpm条件下，振荡培养3天后，采用Sambrook等方法 提取染色体遗传基因。为了进行种类分析，将以上述提取的染色体遗传基因为主要种型，利 用16s rDNA分析用通用引物27F和1492R实施聚合酶链反应。PCR产物pBluescript II SK(+) (Stratagene，USA)的EcoRV限制性内切位点实施亚克隆后测序。对于每个分离菌株 的16s rDNA碱基序列，通过NCBI的BLASTn程序进行分析。每个分离菌株与解淀粉芽孢杆 菌具有99. 9%的相同性而极其相似，因此将其命名为芽孢杆菌属AMI09 (Bacillus sp. AMI 09)。下表为分离自土壤的芽孢杆菌属AMI09菌株与其他芽孢杆菌属之间的对比。
[0039]
【权利要求】
1. 一种壳聚糖酶，其特征在于，该聚糖酶分离自土壤芽孢杆菌属AMI09菌株。
2. -种应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述聚糖酶为权利要求1所述的 聚糖酶。
3. 如权利要求2所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，包括如下步骤： 51 :从土壤试料中分离芽孢杆菌属AMI09菌株； 52 :培养芽孢杆菌属的AMI09菌株； 53 :从培养液中分离壳聚糖酶； 54 :制备壳寡糖的干燥粉末。
4. 如权利要求3所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S1中包 括如下步骤： al:用灭菌蒸馏水稀释取自韩国庆南南海岸一带的土壤试料； a2:将步骤al中的土壤稀释液涂抹在MS琼脂培养基上进行培养； a3:将步骤a2中培养基上的菌落进行纯化； a4:测定各菌落的壳聚糖酶活性、分离得到符合条件的壳聚糖酶的AMI09菌株。
5. 如权利要求4所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述a2步骤中 13琼脂培养基为含有0.5%壳聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1(2即04、0.1%1( 2即04、0.07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaC 12 的培养基。
6. 如权利要求2所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S2中包 括如下步骤： bl:利用LB琼脂培养基培养所述S1步骤得到的芽孢杆菌属AMI09菌株； b2:将芽孢杆菌属AMI09菌株接种到LB培养液中振荡培养，得到种子培养液； b3:种子培养液接种到MS培养基上进行主培养，形成主培养液。
7. 如权利要求6所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述LB琼脂培养 基含有1. 0%细菌培养基用胰化蛋白胨、0. 5%细菌培养基用酵母提取物和1. 0% NaCl，PH 值为7.0。
8. 如权利要求2所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S3中包 括如下步骤： cl :取所述主培养液的上清液进行浓缩、洗涤得到初步溶液； c2 :离子交换层处理cl步骤中的初步溶液，得到壳聚糖酶； c3 :凝胶过滤层析处理； c4 :离子水透析、冷冻干燥。
9. 如权利要求8所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，采用分子量为 cut-off :10000道尔顿的超滤器对主培养液进行浓缩，采用PH值为5. 0的乙酸钠缓冲溶液 进行洗漆。
10. 如权利要求2所述的应用聚糖酶生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S3中包 括如下步骤： dl :将步骤S3中的壳聚糖酶粉末溶解于含有壳聚糖的基质水溶液，形成酶反应液； d2 :第一次过滤酶反应液，浓缩酶反应液； d3 :第二次过滤酶反应液，对酶反应液进行喷雾干燥。
【文档编号】C12R1/07GK104371989SQ201410643961
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】李炜, 朴哲 申请人:中泰和（北京）科技发展有限公司, 艾美科健生物科技株式會社