一种生产单宁酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备单宁酶的方法。所述方法是将黑曲霉接种于含有五倍子渣的培养基中，经发酵培养后获得含单宁酶培养基，分离发酵以后培养基中所含单宁酶。所述培养基为制备单宁酸没食子酸以后剩余的五倍子渣与盐溶液的混合物。所述分离含单宁酶培养基的步骤包括：将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入含单宁酶培养基中，充分振荡浸提以后，利用滤纸过滤即得粗酶液。所得粗酶液利用硫酸铵分级沉淀或超滤浓缩，经冷冻干燥以后得到单宁酶。
【专利说明】一种生产单宁酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种利用制备单宁酸没食子酸后剩余的五倍子渣生产单宁酶的方法。
【背景技术】
[0002]目前单宁酶的生产主要采用微生物发酵的方法，固态发酵由于生产出的单宁酶活性高，而且多为胞外酶而受到广泛关注。在固态发酵过程中，往往需要添加含有单宁或单宁酸的底物作为发酵的基质，如CN200810301169.5《一种用五倍子生料固体发酵生产单宁酶的方法》，主要采用五倍子粉和麸皮的混合物作为固态发酵基质，CN201210283855.0《一种制备单宁酶的方法》主要采用农业废弃物茶叶梗作为固态发酵基质。由于直接添加五倍子粉作为固态发酵基质不仅导致基质中单宁含量过高，不利于微生物的生长，而且五倍子生料发酵过程中容易产生杂菌污染，五倍子如要进行高压蒸汽灭菌又容易发生焦化。而茶叶梗由于含有的是缩合单宁，作为固态基质发酵以后，往往不易再被利用。
[0003]五倍子是我国重要的资源昆虫产物，产量占全世界的95%以上。五倍子中富含可降解型单宁，含量可达35%-60%，目前五倍子的初加工主要用于利用酸碱水解制备单宁酸和没食子酸。每生产一吨食品级单宁酸产生的废渣高达0.9吨，这些产生的废渣中单宁酸含量达到28.6%，而且还含有纤维素、五倍子多糖、五倍子油等成分，目前对于废渣的利用还处于空白阶段，往往被当做废料直接丢弃，五倍子渣不仅没有被充分的利用，而且丢弃到环境中以后直接造成了环境的污染。
[0004]本发明的目的在于提供一种能克服上述缺点的生产单宁酶的方法。以提取单宁酸或没食子酸以后剩余的五倍子渣作为固态发酵基质来生产单宁酶，通过将固态基质高压蒸汽灭菌，接种黑曲霉进行纯种发酵生产单宁酶，不仅降低了原料的成本，改善了生产环境，同时也增加了五倍子的工业附加值。
【发明内容】
[0005]本发明旨在解决制备单宁酸或没食子酸产生的五倍子渣的利用问题，降低固态发酵生产单宁酶的原料成本，为此提供一种利用制备单宁酸没食子酸的五倍子渣生产单宁酶的方法。
[0006]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
所述生产单宁酶的方法，包括如下步骤:
(I)将制备单宁酸和没食子酸时产生的五倍子渣晒干、粉碎，得粉碎后的渣粉；将渣粉与麸皮按重量比(3 — 5):1，优选4:1混合，得渣粉麸皮混合物；按每毫升盐溶液中加入0.8—1.2克，优选I克渣粉麸皮混合物配制固体发酵培养基，然后将黑曲霉接入固体发酵培养基，在24— 32°C条件下发酵2— 5天；发酵过程中对固体发酵培养基不断翻堆；每100毫升所述盐溶液中含有如下重量的组分0.3—0.7克ΝΗ4Ν03、0.08—0.12克MgS04、0.08—0.12 克 NaCl ;优选为 0.5 克 NH4NO3'0.1 克 MgSO4、0.1 克 NaCl ； (2)发酵完毕后，每克固体发酵培养基中加入8—12晕升,优选10晕升朽1檬酸-朽1檬酸钠缓冲液，将固体发酵培养基振荡后经滤纸过滤，得到粗酶液；
(3)向粗酶液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度为40%?80%，搅拌过夜后离心，弃上清液，得到沉淀物；
(4)用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将沉淀物溶解后进行透析；
(5)用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡层析柱，然后把透析浓缩后的酶液上DEAE-纤维素阴离子交换柱，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2— 3毫升/分钟，优选2.5毫升/分钟，至流出液的A280nm〈0.02时，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加I摩尔/升NaCl进行梯度洗脱，将有单宁酶活性部分的洗脱液合并，冷冻干燥，得到单宁酶；
(6)将单宁酶用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解后采用葡聚糖G-150凝胶层析柱进行纯化，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.2—0.3毫升/分钟，优选0.25毫升/分钟，收集具有单宁酶活性的洗脱液，冷冻干燥，得到单宁酶结晶。
[0007]上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为0.01 mol/L、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
[0008]下面对本发明作进一步说明:
本发明是将黑曲霉接种于培养基中，发酵培养后获得含单宁酶培养基，分离发酵以后培养基中所含单宁酶。所述培养基为制备单宁酸没食子酸的五倍子渣与盐溶液的混合物。所述分离含单宁酶培养基的步骤包括:将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入含单宁酶培养基中，充分振荡浸提以后，利用滤纸过滤即得粗酶液。所得粗酶液利用硫酸铵分级沉淀或超滤浓缩，经冷冻干燥以后得到单宁酶。本发明创新性地采用制备单宁酸没食子酸后产生的五倍子渣来生产单宁酶，有效地解决了五倍子渣利用的问题。
[0009]目前对于五倍子渣的利用还仅限于生产单细胞蛋白饲料和饲料复肥，对于五倍子渣中单宁酸的利用产酶还未见报道。该发明以五倍子渣中残留的单宁酸作为诱导物，加以麸皮作为固态发酵基质，高压蒸汽灭菌以后，接种黑曲霉进行纯种发酵，同时发酵以后产生的基质可用于饲料或复合肥的生产。该发明不仅提高了五倍子渣的利用率，而且具有潜在的经济价值。
【具体实施方式】
[0010]实施例1实施例中所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为0.01 mol/L、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液
所述生产单宁酶的方法，包括如下步骤:
Cl)五倍子渣预处理:将五倍子渣在太阳下晒干，晒干以后用粉碎机进行粉碎，破碎后过40目筛，得渣粉；将渣粉与麸皮按重量比4:1的比例混合，得渣粉麸皮混合物；按每毫升盐溶液中加入I克渣粉麸皮混合物配制固体发酵培养基，121°C灭菌20 min，冷却后将黑曲霉接入固体发酵培养基，在24—32 °C条件下发酵2—5天；发酵过程中对固体发酵培养基不断推翻；每100毫升所述盐溶液中含有如下重量的组分0.5克ΝΗ4Ν03、0.1克MgS04、0.1克NaCl ；
(2)发酵完毕后，每克固体发酵培养基中加入10毫升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将固体发酵培养基充分振荡后经滤纸过滤，得到粗酶液； (3)盐析:往过滤得到的粗酶液中加入研钵研碎后的硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度为40%?80%，用磁力搅拌器在4°C冰箱中过夜搅拌，然后5000 rpm离心10 min,弃上清液，得到沉淀物；
(4)透析:用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将沉淀物溶解后放入透析袋中进行透析；
(5)单宁酶的纯化:用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡层析柱，然后把透析浓缩后的酶液上DEAE-纤维素阴离子交换柱，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2.5毫升/分钟，每管收集6 mL，至流出液的A280nm〈0.02时，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加I摩尔/升NaCl进行梯度洗脱，分部收集，将有单宁酶活性部分的洗脱液合并，冷冻干燥，得到单宁酶；
(6)单宁酶的结晶:将单宁酶用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解后采用葡聚糖G-150凝胶层析柱进行纯化，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.25毫升/分钟，优选0.25毫升/分钟，每管收集3 mL，检测单宁酶活性，收集具有单宁酶活性的洗脱液，冷冻干燥，得到单宁酶结晶，其单宁酶比活力达到5000 U/mg以上。
【权利要求】
1.一种生产单宁酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)将制备单宁酸和没食子酸时产生的五倍子渣晒干、粉碎，得粉碎后的渣粉；将渣粉与麸皮按重量比(3—5):1混合，得渣粉麸皮混合物；按每毫升盐溶液中加入0.8 — 1.2克渣粉麸皮混合物配制固体发酵培养基，然后将黑曲霉接入固体发酵培养基，在24— 32°C条件下发酵2—5天；每100毫升所述盐溶液中含有如下重量的组分0.3—0.7克ΝΗ4Ν03、0.08—.0.12 克 MgS04、0.08—0.12 克 NaCl ； (2)发酵完毕后，每克固体发酵培养基中加入8—12毫升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将固体发酵培养基振荡后经滤纸过滤，得到粗酶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，在发酵过程中对固体发酵培养基不断翻堆，发酵过程中保持固体发酵培养基基质中心温度在40°C以下。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对粗酶液纯化的步骤: 向粗酶液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度为40%?80%，搅拌过夜后离心，弃上清液，得到沉淀物； 用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将沉淀物溶解后进行透析； 用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡层析柱，然后把透析浓缩后的酶液上DEAE-纤维素阴离子交换柱，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2— 3毫升/分钟，至流出液的A280nm〈0.02时，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加I摩尔/升NaCl进行梯度洗脱，将有单宁酶活性部分的洗脱液合并，冷冻干燥，得到单宁酶； 将单宁酶用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解后采用葡聚糖G-150凝胶层析柱进行纯化，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.2-0.3毫升/分钟，收集具有单宁酶活性的洗脱液，冷冻干燥，得到单宁酶结晶。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为.0.01 mol/L、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
【文档编号】C12R1/685GK104357421SQ201410643845
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】周辉, 田云, 卢向阳 申请人:湖南农业大学