一种拯救流感病毒的方法

一种拯救流感病毒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种拯救重组流感病毒的方法。该方法包括：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2、PB1、PA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体。2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。从该拯救重组流感病毒的方法中得到的重组流感病毒疫苗株在鸡胚中具有高复制力，比传统疫苗在鸡胚中的生长滴度也要高，通过对疫苗种子毒进行抗原性检测发现，疫苗种子毒的抗原性与亲本病毒没有明显差异。
【专利说明】一种拯救流感病毒的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒疫苗生产领域中一种拯救流感病毒的方法，特别涉及在鸡胚中具 有高繁殖力的流感病毒疫苗株的制备方法。

【背景技术】
[0002] H9N2亚型禽流感病毒是一种低致病性禽流感病毒，主要感染鸡、鸭、鹅、候鸟等禽 类，但可造成蛋鸡的产蛋量严重下降，肉鸡和青年鸡的复合型呼吸道疾病和死淘率升高，造 成严重的经济损失，目前H9N2亚型禽流感病毒已经成为流行于我国鸡群中的主要流感病 毒亚型。值得注意的是，H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类，而且无需经过中间宿主 即可突破种间屏障感染哺乳动物和人，自1998年全球首次发现人感染H9N2亚型禽流感病 毒病例后，人感染H9N2亚型禽流感病毒病例时有发生，凸显出其公共卫生学意义。因此，对 禽流感病毒进行连续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒变异规律，筛选出合适的疫苗株， 研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感病毒疫苗是急需的。
[0003] 全病毒灭活苗是人们主要使用的禽流感疫苗，多用鸡胚制备而成。因此，一个理想 的疫苗株首先应该在鸡胚中生长良好而且安全，然而，绝大多数流感病毒自然株对鸡胚有 致病性，而且病毒的生长滴度也较低，这为大批量生产禽流感疫苗带来了诸多不便。为了克 服这一缺点，目前多用遗传重组方法制备高繁殖力的预备疫苗株。
[0004] H9N2亚型禽流感病毒为A型流感病毒，A型流感病毒的基因组为单股负链、分节段 的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚 合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2,片段2编码聚合酶亚基PBl，片段3编码聚合酶亚基PA ; 片段4编码血凝素 HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是 病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种 基质蛋白Ml和M2,是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NSl和NS2。血凝 素 HA和神经氨酸酶NA经常发生抗原漂移和转换，是导致流感暴发的主要原因。
[0005] 人HlNl流感病毒A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有 效地复制。因此，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组 (6+2模式）构建8质粒拯救系统，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何制备出在鸡胚中繁殖力高于传统6+2模式得 到的重组病毒毒株。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了 8+7模式拯救流感病毒的方法，该方法 将流感病毒鸡胚适应株的7个基因片段（HA除外）与待拯救流感病毒毒株的8个基因片段 共转染包装细胞，使除待拯救流感病毒毒株的编码HA的RNA片段外的14个RNA片段自由 组合，进行病毒拯救，得到重组流感病毒。
[0008] 本发明所提供的拯救流感病毒的方法（也就是构建重组流感病毒的方法），包括 以下步骤：
[0009] 1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中PBl的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病 毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所 述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NSl和 NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感 病毒毒株中PBl的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述 待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、 编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2 的cDNA分子和编码所述待摇救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子 每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述 al-al5中的重组表达载体：al、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重 组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应 株中PBl的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PBl基因表达载体；a3、含有编 码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基 因表达载体；a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其 名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA 分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；a6、含有编码所述流感病毒 鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体； a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称 为鸡胚适应株NS基因表达载体；a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子 的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；a9、含有编码所述待拯 救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PBl基 因表达载体；alO、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其 名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；all、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中 HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；al2、含 有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感 病毒毒株NP基因表达载体；al3、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重 组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；al4、含有编码所述待拯救流 感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因 表达载体；al5、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子的重组表达载 体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；
[0010] 2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
[0011] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒可为A型流感病毒。
[0012] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株可为A/PR/8/34,所述待拯 救流感病毒毒株可为 A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。
[0013] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是SEQ ID No. 9的 第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 9由2280个核苷酸组成，其编码序列是 第1-2280位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PBl是SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷 酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 15由2274个核苷酸组成，其编码序列是第1-2274位核苷 酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白 质，SEQ ID No. 14由2151个核苷酸组成，其编码序列是第1-2151位核苷酸；所述流感病毒 鸡胚适应株中NP是SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 12 由1497个核苷酸组成，其编码序列是第1-1497位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NA 是SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 11由1365个核苷酸 组成，其编码序列是第1-1365位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中Ml是SEQ ID No. 10的 第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示，所述流感病毒鸡胚适应株中M2是SEQ ID No. 10的第1-26位和第715-982 位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 10由982个核苷酸组成，其编码序列是第1-982 位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NSl是SEQ ID No. 13的第1-693位核苷酸序列编码 的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示，所述流感 病毒鸡胚适应株中NS2是SEQ ID No. 13的第1-30位和第503-838位核苷酸序列编码的蛋 白质，SEQ ID No. 13由838个核苷酸组成，其编码序列是第1-838位核苷酸；所述待拯救流 感病毒毒株中PB2是SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 3 由2280个核苷酸组成，其编码序列是第1-2280位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PBl 是SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 4由2274个核苷酸 组成，其编码序列是第1-2274位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No. 5的 第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 5由2151个核苷酸组成，其编码序列是 第1-2151位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷 酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 1由1683个核苷酸组成，其编码序列是第1-1683位核苷 酸；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白 质，SEQ ID No. 6由1497个核苷酸组成，其编码序列是第1-1497位核苷酸；所述待拯救流 感病毒毒株中NA是SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 2由 1401个核苷酸组成，其编码序列是第1-1401位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中Ml是 SEQ ID No. 7的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨 基酸序列如SEQ ID No. 16所示，所述待拯救流感病毒毒株中M2是SEQ ID No. 7的第1-26 位和第715-982位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQ ID No. 7由982个核苷酸组成，其编码序 列是第1-982位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中NSl是SEQ ID No. 8的第1-654位核 苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 17所 示，所述待拯救流感病毒毒株中NS2是SEQ ID No. 8的第1-30位和第503-838位核苷酸序 列编码的蛋白质，SEQ ID No. 8由838个核苷酸组成，其编码序列是第1-838位核苷酸。
[0014] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子是CPB21、CPB22、CPB23或CPB24 的cDNA分子：CPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸的cDNA 分子；CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的cDNA分子；CPB23、在严格条件下与 所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子； CPB24、与所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且编码所述RNA 聚合酶PB2亚基的cDNA分子；
[0015] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的cDNA分子是CPB11、CPB12、CPB13或CPB14 的cDNA分子：CPBlI、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA 分子；CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的cDNA分子；CPB13、在严格条件下与 所述CPBll或所述CPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PBl亚基的cDNA分子； CPB14、与所述CPBll或所述CPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述RNA 聚合酶PBl亚基的cDNA分子；
[0016] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子是CPA1、CPA2、CPA3或CPA4的 cDNA分子：CPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分 子；CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 14的cDNA分子；CPA3、在严格条件下与所 述CPAl或所述CPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；CPA4、 与所述CPAl或所述CPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述RNA聚合酶 PA亚基的cDNA分子；
[0017] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子是CNPl、CNP2、CNP3或CNP4的 cDNA分子：CNPl、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分 子；CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的cDNA分子；CNP3、在严格条件下与所述 CNPl或所述CNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP的cDNA分子；CNP4、与所述CNPl 或所述CNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述核蛋白NP的cDNA分子；
[0018] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子是CNAl、CNA2、CNA3或CNA4的 cDNA分子：CNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分 子；CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的cDNA分子；CNA3、在严格条件下与所 述CNAl或所述CNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶NA的cDNA分子；CNA4、与所 述CNAl或所述CNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述神经氨酸酶NA的 cDNA分子；
[0019] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子是CMl、CM2或CM3的cDNA 分子：CM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子；CM2、在严格条件下与所 述CMl限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白Ml和M2的cDNA分子；CM3、与所述CMl限定 的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述基质蛋白Ml和M2的cDNA分子；
[0020] 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的cDNA分子是CNSUCNS2或CNS3的 cDNA分子：CNSl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子；CNS2、在严格条件 下与所述CNSl限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NSl和NS2的cDNA分子；CNS3、与 所述CNSl限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述非结构蛋白NSl和NS2的 cDNA分子；
[0021] 编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21、RPB22、RPB23或RPB24 的cDNA分子：RPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的cDNA 分子；RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的cDNA分子；RPB23、在严格条件下与 所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子； RPB24、与所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且编码所述RNA 聚合酶PB2亚基的cDNA分子；
[0022] 编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子是RPB11、RPB12、RPB13或RPB14 的cDNA分子：RPBll、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸的cDNA 分子；RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的cDNA分子；RPB13、在严格条件下与 所述RPBll或所述RPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PBl亚基的cDNA分子； RPB14、与所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且编码所述RNA 聚合酶PBl亚基的cDNA分子；
[0023] 编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1、RPA2、RPA3或RPA4的 cDNA分子：RPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5的cDNA分子；RPA3、在严格条件下与所述RPAl 或所述RPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子；RPA4、与所述 RPAl或所述RPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述RNA聚合酶PA亚基 的cDNA分子；
[0024] 编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1、RHA2、RHA3或RHA4的 cDNA分子：RHA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子； RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的cDNA分子；RHA3、在严格条件下与所述RHAl 或所述RHA2限定的cDNA分子杂交且编码血凝素 HA的cDNA分子；RHA4、与所述RHAl或所 述RHA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述血凝素 HA的cDNA分子；
[0025] 编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1、RNP2、RNP3或RNP4的 cDNA分子：RNPl、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 6的cDNA分子；RNP3、在严格条件下与所述RNPl 或所述RNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP的cDNA分子；RNP4、与所述RNPl或所 述RNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述核蛋白NP的cDNA分子；
[0026] 编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1、RNA2、RNA3或RNA4的 cDNA分子：RNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子； RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子；RNA3、在严格条件下与所述RNAl 或所述RNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶NA的cDNA分子；RNA4、与所述RNAl 或所述RNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述神经氨酸酶NA的cDNA分 子；
[0027] 编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子是RMl、RM2或RM3的cDNA 分子：RMl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子；RM2、在严格条件下与所述 RMl限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白Ml和M2的cDNA分子；RM3、与所述RMl限定的 cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述基质蛋白Ml和M2的cDNA分子；
[0028] 编码所述待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子是RNSl、RNS2或RNS3的 cDNA分子：RNSl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子；RNS2、在严格条件下 与所述RNSl限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NSl和NS2的cDNA分子；RNS3、与所 述RNSl限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述非结构蛋白NSl和NS2的cDNA 分子。
[0029] 上述拯救流感病毒的方法中，所述包装细胞可为293T细胞、C0S7细胞、MDCK细胞、 VERO细胞、WI-38、HL-8、HeLa细胞和Chang C/I/L/K细胞中的一种或两种以上。
[0030] 上述拯救流感病毒的方法中，所述真核细胞表达载体可为PLLB-A或PLLB-G，所述 15个重组表达载体可为如下15个重组表达载体：所述鸡胚适应株PB2基因表达载体可为 将编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到 的重组表达载体；所述鸡胚适应株PBl基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株 中PBl的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应 株PA基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的 StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株NP基因表达载体可为将编码所述 流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载 体；所述鸡胚适应株NA基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分 子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株M基因表达载体 可为将编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位 点间得到的重组表达载体；所述鸡胚适应株NS基因表达载体可为将编码所述流感病毒鸡 胚适应株中NSl和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体； 所述待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的 cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株 PBl基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子插入pLLB-G的 StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中PA基因表达载体可为 将编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位点间得到的 重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中HA基因表达载体可为将编码所述待拯救流感 病毒毒株中HA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待 拯救流感病毒毒株中NP基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA 分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中NA 基因表达载体可为将编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI 切割位点间得到的重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中M基因表达载体可为将编码 所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的 重组表达载体；所述待拯救流感病毒毒株中NS基因表达载体可为将编码所述待拯救流感 病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位点间得到的重组表达载体。
[0031] 上述拯救流感病毒的方法中，将所述15个重组表达载体按照等质量混合后导入 所述包装细胞中，得到所述重组流感病毒。
[0032] 由上述拯救流感病毒的方法制备的重组流感病毒也属于本发明的保护范围。
[0033] 上述重组流感病毒中，所述重组流感病毒可为Rl-Rll中任一种重组流感病毒：
[0034] 所述Rl是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0035] 所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0036] 所述R3是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0037] 所述R4是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0038] 所述R5是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0039] 所述R6是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0040] 所述R7是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0041] 所述R8是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0042] 所述R9是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述 流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段I、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0043] 所述RlO是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所 述流感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片 段2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA 的RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适 应株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述 待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0044] 所述Rll是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所 述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PBl的RNA片 段2、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA 的RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适 应株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述 流感病毒鸡胚适应株中NSl和NS2的RNA片段8。
[0045] 本发明还保护从上述拯救流感病毒的方法（本发明的8+7模式拯救流感病毒的方 法）中获得流感病毒疫苗株的方法。
[0046] 本发明获得流感病毒疫苗株的方法，包括从上述拯救流感病毒的方法制备的所述 重组流感病毒中筛选得到流感病毒疫苗株的步骤。
[0047] 由上述获得流感病毒疫苗株的方法制备的流感病毒疫苗株也属于本发明的保护 范围。
[0048] 上述流感病毒疫苗株中，所述流感病毒疫苗株具体可为上述Rl或R2。
[0049] 本发明还保护在鸡胚中繁殖上述重组流感病毒的方法。
[0050] 本发明的实验证明，本发明的8+7模式将流感病毒鸡胚适应株的7个基因片段（HA 除外）与待拯救流感病毒毒株的8个基因片段共转染包装细胞，使除HA的RNA片段外的14 个RNA片段自由组合，增加了基因片段的组合方式，使疫苗株的选择范围更加广泛，具有操 作简便、成本较低等优点。从本发明的8+7模式拯救流感病毒方法得到的重组流感病毒中 能得到在鸡胚中具有高效复制力的疫苗株，如本发明的8+7模式得到的上述Rl和R2疫苗 株在鸡胚中的生长滴度比亲本毒株（即待拯救毒株）高出10倍之多，比传统6+2模式得到 的疫苗株在鸡胚中的生长滴度也要高出10倍（Rl和R2的生长滴度均为IO 9 8EID5cZmL，待 拯救流感病毒毒株A/chicken/Hebei/YT/2010 (H9N2)的生长滴度为108_ 5EID5qAiL，传统6+2 模式得到的疫苗株R37的生长滴度为108_ 8EID5ciAiL)。通过对疫苗种子毒进行抗原性检测发 现，本发明的8+7模式得到的疫苗种子毒的抗原性与亲本病毒没有明显差异。用本发明的 8+7模式得到的疫苗种子毒免疫SPF鸡后HI抗体水平都达到2 8以上。本发明的8+7模式 拯救流感病毒的方法可在拯救流感病毒和制备流感病毒疫苗中得到广泛的应用。

【具体实施方式】
[0051] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0052] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 下述实施例中所用的 A/PR/8/34(Abt. M, dejongej, etal. Improvement of H5N1influenza vaccine viruses:Influence of internal gene segments of avian and human origin on production and hemagglutinin content. Vaccine. 2011，29:5153-5162)，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明 的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0055] 下述实施例中所用的 A/chicken/Hebei/YT/2〇10(H9N2) (GenBank:KC82l269· 1) 公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它 用途使用。
[0056] 下述实施例中所用的表达载体pLLB-A和pLLB-G (刘金华等，用于构建流感病毒的 反向遗传系统的载体及应用，CN 101343636A)，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只 为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0057] 下面以A/PR/8/34(简称PR8)作为流感病毒鸡胚适应株，以A/chicken/Hebei/ YT/2010(H9N2)(简称YT)作为待拯救流感病毒毒株，阐述本申请的拯救流感病毒的方法。
[0058] 实施例1、利用本发明的反向遗传操作技术进行流感病毒的拯救
[0059] 一、8+7模式构建重组流感病毒
[0060] 本步骤采用8+7模式进行流感病毒的拯救，其方法如下：将编码PR8中PB2的cDNA 分子、编码PR8中PBl的cDNA分子、编码PR8中PA的cDNA分子、编码PR8中NP的cDNA分 子、编码PR8中NA的cDNA分子、编码PR8中Ml和M2的cDNA分子和编码PR8中NSl和NS2 的cDNA分子，以及编码YT中PB2的cDNA分子、编码YT中PBl的cDNA分子、编码YT中PA 的cDNA分子、编码YT中HA的cDNA分子、编码YT中NP的cDNA分子、编码YT中NA的cDNA 分子、编码YT中Ml和M2的cDNA分子和编码YT中NSl和NS2的cDNA分子这15个cDNA 分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达质粒，所述15个重组表达质粒为 下述al_al5中的重组表达质粒：
[0061] al、含有编码PR8中PB2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PB2基因表 达质粒；
[0062] a2、含有编码PR8中PBl的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PB1基因表 达质粒；
[0063] a3、含有编码PR8中PA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-PA基因表达 质粒；
[0064] a4、含有编码PR8中NP的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-NP基因表达 质粒；
[0065] a5、含有编码PR8中NA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-NA基因表达 质粒；
[0066] a6、含有编码PR8中Ml和M2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为PR8-M基因 表达质粒；
[0067] a7、含有编码PR8中NSl和NS2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称PR8-NS基因 表达质粒；
[0068] a8、含有编码YT中PB2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PB2基因表达 质粒；
[0069] a9、含有编码YT中PBl的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PBl基因表达 质粒；
[0070] alO、含有编码YT中PA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-PA基因表达质 粒；
[0071] all、含有编码YT中HA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-HA基因表达质 粒；
[0072] al2、含有编码YT中NP的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NP基因表达质 粒；
[0073] al3、含有编码YT中NA的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NA基因表达质 粒；
[0074] al4、含有编码YT中Ml和M2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-M基因表 达质粒；
[0075] al5、含有编码YT中NSl和NS2的cDNA分子的重组表达质粒，其名称为YT-NS基 因表达质粒；
[0076] 将所述15个重组表达质粒导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
[0077] 其中，编码PR8中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的第 1-2280位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中PBl的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中PA的cDNA分子的核苷酸序列是 序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中NP的cDNA分子的 核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；编码PR8中NA 的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子； 编码PR8中Ml和M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子；编 码PR8中NSl和NS2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子；编 码YT中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的 cDNA分子；编码YT中PBl的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274 位核苷酸的cDNA分子；编码YT中PA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5 的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；编码YT中HA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中 SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子；编码YT中NP的cDNA分子的核苷酸序列 是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；编码YT中NA的cDNA分子的 核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子；编码YT中Ml和 M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子；编码YT中NSl和NS2 的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子。
[0078] 真核细胞表达载体为pLLB-G或pLLB-A，包装细胞为293T细胞。
[0079] 具体方法如下：
[0080] 1、制备15个重组表达质粒
[0081] 制备PB2基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PB2，pLLB-PR8-PB2是在pLLB-G的 StuI切割位点间插入SEQ ID No. 9所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质 粒；制备PBl基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PBl，pLLB-PR8-PBl是在pLLB-G的StuI切 割位点间插入SEQ ID No. 15所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制 备PA基因的重组表达质粒pLLB-PR8-PA，pLLB-PR8-PA是在pLLB-G的StuI切割位点间插 入SEQ ID No. 14所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NP基因 的重组表达质粒PLLB-PR8-NP，pLLB-PR8-NP是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 12所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NA基因的重组表达 质粒 PLLB-PR8-NA，pLLB-PR8-NA 是在 pLLB-A 的 StuI 切割位点间插入 SEQ ID No. 11 所 示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备Ml和M2基因的重组表达质 粒PLLB-PR8-M，pLLB-PR8-M是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 10所示的 cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NSl和NS2基因的重组表达质粒 pLLB-PR8-NS，pLLB-PR8-NS 是在pLLB-A 的 StuI 切割位点间插入 SEQ ID No. 13 所示的 cDNA 分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PB2基因的重组表达质粒pLLB-YT-PB2， PLLB-YT-PB2是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 3所示的cDNA分子，其它核 苷酸不变得到的重组表达质粒；制备PBl基因的重组表达质粒pLLB-YT-PBl，pLLB-YT-PBl 是在pLLB-G的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 4所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得 到的重组表达质粒；制备PA基因的重组表达质粒pLLB-YT-PA，pLLB-YT-PA是在pLLB-G的 StuI切割位点间插入SEQ ID No. 5所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质 粒；制备HA基因的重组表达质粒pLLB-YT-HA，pLLB-YT-HA是在pLLB-A的StuI切割位点间 插入SEQ ID No. 1所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NP基因的 重组表达质粒pLLB-YT-NP，pLLB-YT-NP是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 6 所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备NA基因的重组表达质粒 pLLB-YT-NA，pLLB-YT-NA 是在 pLLB-A 的 StuI 切割位点间插入 SEQ ID No. 2 所示的 cDNA 分 子，其它核苷酸不变得到的重组表达质粒；制备Ml和M2基因的重组表达质粒pLLB-YT-M， pLLB-YT-M是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 7所示的cDNA分子，其它核苷酸 不变得到的重组表达质粒；制备NSl和NS2基因的重组表达质粒pLLB-YT-NS，pLLB-YT-NS 是在pLLB-A的StuI切割位点间插入SEQ ID No. 8所示的cDNA分子，其它核苷酸不变得到 的重组表达质粒。
[0082] 2、反向遗传操作技术制备重组流感病毒进行病毒的拯救
[0083] 1)包装细胞的准备：将293T细胞和MDCK细胞按照2:1的比例铺于6孔细胞板， 铺板后18-24h进行转染，此时细胞85%左右融合，进行转染前用PBS缓冲液轻轻洗两次细 胞。
[0084] 2)混合重组表达质粒：将步骤1中的15个重组表达质粒等质量混合（500ng)加 入I. 5mL离心管中。
[0085] 3)转染：向已加入重组表达载体的I. 5mL离心管中加入200 μ L Opti-MEM培养基 (无血清、无抗生素）和IOuL Lipofectmine 2000转染试剂，瞬时离心以混勻，室温放置 45min后再加入700 μ L Opti-MEM培养基于离心管中。吸净6孔板中的细胞液，用PBS缓冲 液洗两次后，吸净残余的PBS ;将I. 5mL离心管中的液体全部移入6孔板中，37°C培养6h，随 后加入含有2 μ g/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培养基于6孔板中，ImL/孔，37°C培养48-72h 后，置于_80°C保存备用。转染40块6孔板,共240个孔。
[0086] 4)重组流感病毒毒株的增殖：将转染后冻存的细胞液从-80°C冰箱中取出，待其 融化后吹打混匀细胞液，接种鸡胚，35°C孵化箱中培养48-72h后，将鸡胚置于4°C冰箱中冻 过夜，收获尿囊液，测定其凝集红细胞的活性。若无血凝活性，则盲传一代，放弃仍无血凝活 性的样本，得到重组流感病毒。
[0087] 3、重组流感病毒的传代与鉴定
[0088] 1)、重组流感病毒的传代
[0089] 将步骤2的重组流感病毒在鸡胚上进行连续传代，将含重组流感病毒的尿囊液分 别以10'10'KT 4稀释度接种鸡胚，挑选出HA效价最高的重组流感病毒尿囊液再以相同 的方式接种鸡胚，在鸡胚中连续传10代。
[0090] 2)重组流感病毒的鉴定
[0091] 在MDCK细胞长至90%时铺板，将传代的重组流感病毒尿囊液用含有1 %双抗（青 霉素和链霉素）的DMEM进行10倍倍比稀释。用PBS缓冲液洗两次后，每孔加入400-600 μ L 重组流感病毒尿囊液，轻摇混匀，使重组流感病毒尿囊液均匀覆盖，置于CO2培养箱37°C孵 育lh。在孵育终止前5-10min，将含有TPCK-胰酶的双抗DMEM与4%琼脂按照3:1比例混 合，吹吸混匀，使覆盖液中TPCK-胰酶终浓度为2-5 μ g/mL。孵育终止后，将细胞板中重组流 感病毒尿囊液弃掉，每孔加入3mL覆盖液，置于4°C冰箱15-20min使之凝固，之后移入CO 2 培养箱37°C培养，24h后开始观察空斑形成情况（每12h观察一次）。待出现空班后，用白 枪头将斑挑下，置于含双抗DMHM的I. 5mL离心管中，震荡混匀后接种鸡胚，收获尿囊液，对 病毒进行全基因组序列测定。
[0092] 测序结果表明按照上述8+7模式得到了 36种重组流感病毒，其病毒名称分别为 R1-R36,如表1所示：
[0093] Rl的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0094] R2的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0095] R3的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码所述YT中 HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml 和M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0096] R4的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0097] R5的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0098] R6的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0099] R7的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0100] R8的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0101] R9的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0102] RlO的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中 HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中Ml 和M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0103] Rll的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0104] R12的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2的 RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0105] R13的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中 HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml 和M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0106] R14的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2的 RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0107] R15的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0108] R16的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0109] R17的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和 M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0110] R18的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0111] R19的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0112] R20的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0113] R21的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2的 RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0114] R22的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0115] R23的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2的 RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0116] R24的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中 HA的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml 和M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0117] R25的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0118] R26的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0119] R27的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2的 RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0120] R28的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0121] R29的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中 HA的RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml 和M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0122] R30的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0123] R31的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0124] R32的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码PR8中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和M2 的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0125] R33的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0126] R34的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中PB2 的RNA片段I、编码PR8中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA的 RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码所述YT中NA的RNA片段6、编码所述PR8中 Ml和M2的RNA片段7、编码所述YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0127] R35的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码YT中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码YT中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码PR8中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和 M2的RNA片段7、编码YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0128] R36的基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码PR8中 PB2的RNA片段1、编码YT中PBl的RNA片段2、编码PR8中PA的RNA片段3、编码YT中HA 的RNA片段4、编码YT中NP的RNA片段5、编码YT中NA的RNA片段6、编码YT中Ml和M2 的RNA片段7、编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0129] 上述36种重组流感病毒中，编码PR8中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是将 SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链 核糖核酸；编码PR8中PBl的RNA片段2的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 15的第1-2274 位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中PA的 RNA片段3的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸所示单链的反向互补 链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中NP的RNA片段5的核苷酸序列均是 将SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单 链核糖核酸；编码PR8中NA的RNA片段6的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 11的第1-1365 位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中Ml和 M2的RNA片段7的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 10的第1-982位核苷酸所示单链的反向 互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码PR8中NSl和NS2的RNA片段8的核 苷酸序列均是将SEQ ID No. 13的第1-838位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换 为U得到的单链核糖核酸；编码YT中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 3 的第1-2280位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码 YT中PBl的RNA片段2的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸所示单链 的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中PA的RNA片段3的核苷 酸序列均是将SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U 得到的单链核糖核酸；编码YT中HA的RNA片段4的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 1的第 1-1683位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中 NP的RNA片段5的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸所示单链的反向 互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中NA的RNA片段6的核苷酸序列 均是将SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到 的单链核糖核酸；编码YT中Ml和M2的RNA片段7的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 7的第 1-982位核苷酸所示单链的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸；编码YT中 NSl和NS2的RNA片段8的核苷酸序列均是将SEQ ID No. 8的第1-838位核苷酸所示单链 的反向互补链中的T均替换为U得到的单链核糖核酸。
[0130] 二、6+2模式构建重组流感病毒
[0131] 按照现有的6+2模式构建重组流感病毒，具体方法如下：将步骤一中的15个重 组表达质粒替换为步骤一中的如下8个重组表达质粒制备重组流感病毒：pLLB-PR8-PB2、 PLLB-PR8-PB1、pLLB-PR8-PA、pLLB-YT-HA、pLLB-PR8-NP、pLLB-YT-NA、pLLB-PR8-M 和 PLLB-PR8-NS。除了用上述8个重组表达质粒转染包装细胞外，其它操作与步骤一相同，得 到的重组流感病毒只有一种，其名称为R37,其基因组RNA与R13完全相同。
[0132] 三、重组流感病毒EID5tlAiL及红细胞凝集效价的测定
[0133] 1、重组流感病毒EID5tlAiL的测定
[0134] 1)鸡胚的选择与标记：将9-lld鸡胚置于暗室，用照蛋器观察，选择可自由晃动， 血管清晰的健康鸡胚，剔除血管细、不清晰的弱鸡胚，标记出每个鸡胚的气室，避开大血管 记。
[0135] 2)重组流感病毒液倍比稀释：试验前30min从_80°C冰箱中将冻存的重组流感病 毒液取出，置于4°C冰箱中自然融化。准备10个1.5mL灭菌离心管，每管中加入900yL含 双抗的PBS缓冲液。第一管中加入100 μ L重组流感病毒原液，充分混匀后吸出100 μ L至 第二管，依次进行10倍倍比稀释至第十管，做好标记，倍比稀释后的重组流感病毒液置于 冰上保存。
[0136] 3)接种重组流感病毒：将标记好的鸡胚分别用碘酊和75%乙醇消毒，打孔器消毒 后在气室上方和胚体标记处打孔。将ImL注射器沿胚体处小孔插入0. 5cm，注入0. ImL接种 物，每个稀释度重组流感病毒液接种3个鸡胚，做好标记。石蜡封口，置孵化箱中孵育，每天 检查两次，及时将死亡鸡胚置于4°C冰箱中。
[0137] 4)检测：接毒48_72h后将鸡胚置于4°C冰箱中过夜，冻死鸡胚，防止出血。将鸡胚 表面用酒精消毒后，用镊子将气室打开，用移液枪吸取25 μ L重组流感病毒尿囊液至96孔 血凝板，进行血凝实验。计算出36株重组流感病毒尿囊液的EID5Q/mL，挑选出重组流感病 毒尿囊液EID 5tlAiL较高的重组流感病毒作为疫苗候选株。重组病毒株尿囊液的EID5ciAiL值 见表1。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒毒株Rl-Rll尿囊液的EID 5ciAiL高于 采用6+2模式得到的重组流感病毒毒株R37尿囊液的EID5(l/mL。
[0138] 2、重组流感病毒红细胞凝集效价的测定
[0139] 用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25 μ L，用微量移液器吸取抗原（待测 重组流感病毒毒株的尿囊液）25 μ L于第1孔中并挤压6次混匀，吸出25 μ L至第2孔，依次 进行2倍倍比稀释到第11孔，弃去25 μ L。向每孔中依次加入25 μ L 1%红细胞悬液置于 微量振荡器上震荡lmin，室温静置30min后观察实验结果。结果判定：将反应板倾斜45°， 沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或者不完全被病 毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞 被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原红细胞凝集效 价（Hemagglutinin test,简称HA)，即沉淀的前一孔的稀释倍数为该抗原的效价。重组流 感病毒毒株的尿囊液HA滴度见表1。结果表明，采用8+7模式得到的重组流感病毒Rl-Rll 尿囊液的HA滴度高于采用6+2模式得到的重组流感病毒R37尿囊液。
[0140] 表1、重组流感病毒毒株及YT原毒尿囊液的EID5ciAiL及HA滴度
[0141]

【权利要求】
1.拯救流感病毒的方法，包括以下步骤： 1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中 PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚 适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感 病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的 cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒 株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流 感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述 待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA 分子和编码所述待摇救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单 独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述al_al5 中的重组表达载体： al、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 鸡胚适应株PB2基因表达载体； a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 鸡胚适应株PB1基因表达载体； a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡 胚适应株PA基因表达载体； a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡 胚适应株NP基因表达载体； a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡 胚适应株NA基因表达载体； a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名 称为鸡胚适应株M基因表达载体； a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其 名称为鸡胚适应株NS基因表达载体； a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体； a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体； al〇、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体； all、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体； al2、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体； al3、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为 待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体； al4、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名 称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体； al5、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其 名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体； 2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流感病毒为A型流感病毒。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是 SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PB1是 SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是 SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NP是 SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NA是 SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中Ml是 SEQ ID No. 10的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中M2的 氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示；所述流感病毒鸡胚适应株中NS1是SEQ ID No. 13的第 1-693位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示；所述待拯救流感病毒毒株中PB2是SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PB1是SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NA是SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸序 列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中Ml是SEQ ID No. 7的第1-759位核苷酸序列 编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示；所述待 拯救流感病毒毒株中NS1是SEQ ID No. 8的第1-654位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待 拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 17所示。
4. 根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于： 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子是CPB21、CPB22、CPB23或CPB24的 cDNA分子： CPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子； CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的cDNA分子； CPB23、在严格条件下与所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚 合酶PB2亚基的cDNA分子； CPB24、与所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所 述RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子是CPB11、CPB12、CPB13或CPB14的 cDNA分子： CPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子； CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的cDNA分子； CPB13、在严格条件下与所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚 合酶PB1亚基的cDNA分子； CPB14、与所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所 述RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子是CPA1、CPA2、CPA3或CPA4的cDNA 分子： CPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 14的cDNA分子； CPA3、在严格条件下与所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶 PA亚基的cDNA分子； CPA4、与所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述 RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子是CNP1、CNP2、CNP3或CNP4的cDNA 分子： CNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的cDNA分子； CNP3、在严格条件下与所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP 的cDNA分子； CNP4、与所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述核 蛋白NP的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子是CNA1、CNA2、CNA3或CNA4的cDNA 分子： CNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子； CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的cDNA分子； CM3、在严格条件下与所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶 NA的cDNA分子； CNA4、与所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述神 经氨酸酶NA的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的cDNA分子是CM1、CM2或CM3的cDNA分 子： CM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子； CM2、在严格条件下与所述CM1限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白Ml和M2的cDNA 分子； CM3、与所述CM1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述基质蛋白Ml和 M2的cDNA分子； 编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子是CNSUCNS2或CNS3的cDNA 分子： CNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子； CNS2、在严格条件下与所述CNS1限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NS1和NS2 的cDNA分子； CNS3、与所述CNS1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述非结构蛋白 NS1和NS2的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21、RPB22、RPB23或RPB24的 cDNA分子： RPB21、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的cDNA分子； RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的cDNA分子； RPB23、在严格条件下与所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚 合酶PB2亚基的cDNA分子； RPB24、与所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所 述RNA聚合酶PB2亚基的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子是RPB11、RPB12、RPB13或RPB14的 cDNA分子： RPB11、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸的cDNA分子； RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的cDNA分子； RPB13、在严格条件下与所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚 合酶PB1亚基的cDNA分子； RPB14、与所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所 述RNA聚合酶PB1亚基的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1、RPA2、RPA3或RPA4的cDNA 分子： RPA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5的cDNA分子； RPA3、在严格条件下与所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子杂交且编码RNA聚合酶 PA亚基的cDNA分子； RPA4、与所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述 RNA聚合酶PA亚基的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1、RHA2、RHA3或RHA4的cDNA 分子： RHA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子； RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的cDNA分子； RHA3、在严格条件下与所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子杂交且编码血凝素HA 的cDNA分子； RHA4、与所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述血 凝素HA的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1、RNP2、RNP3或RNP4的cDNA 分子： RNP1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 6的cDNA分子； RNP3、在严格条件下与所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子杂交且编码核蛋白NP 的cDNA分子； RNP4、与所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且编码所述核 蛋白NP的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1、RNA2、RNA3或RNA4的cDNA 分子： RNA1、其编码序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子； RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子； RNA3、在严格条件下与所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子杂交且编码神经氨酸酶 NA的cDNA分子； RNA4、与所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述神 经氨酸酶NA的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子是RM1、RM2或RM3的cDNA分 子： 冊1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子； RM2、在严格条件下与所述RM1限定的cDNA分子杂交且编码基质蛋白Ml和M2的cDNA 分子； 冊3、与所述RM1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述基质蛋白Ml和 M2的cDNA分子； 编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子是RNSURNS2或RNS3的cDNA 分子： RNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子； RNS2、在严格条件下与所述RNS1限定的cDNA分子杂交且编码非结构蛋白NS1和NS2 的cDNA分子； RNS3、与所述RNS1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述非结构蛋白 NS1和NS2的cDNA分子。
5. 由权利要求1至4中任一所述的方法制备的重组流感病毒。
6. 根据权利要求5所述的重组流感病毒，其特征在于：所述重组流感病毒为R1-R11中 任一种重组流感病毒： 所述R1是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感 病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R3是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R4是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R5是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感 病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R6是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R7是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R8是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R9是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感 病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R10是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流 感病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段 2、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R11是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待 拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段 2、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述流感病毒鸡胚适应 株中NA的RNA片段6、编码所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述流 感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的RNA片段8。
7. 获得流感病毒疫苗株的方法，包括从由权利要求1至5中任一所述的方法制备的所 述重组流感病毒中筛选得到流感病毒疫苗株的步骤。
8. 由权利要求7所述方法制备的流感病毒疫苗株。
9. 根据权利要求8所述的流感病毒疫苗株，其特征在于：所述流感病毒疫苗株为下述 R1或R2中任一种重组流感病毒： 所述R1是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R2是基因组RNA由如下8个独立的RNA片段组成的重组流感病毒：编码所述流感 病毒鸡胚适应株中PB2的RNA片段1、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的RNA片段3、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的RNA片段5、编码所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、编码所述流感病毒鸡胚适应株中Ml和M2的RNA片段7、编码所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8。
10. 繁殖权利要求5或6所述重组流感病毒的方法，其特征在于：所述方法在鸡胚中繁 殖权利要求5或6所述的重组流感病毒。
【文档编号】C12N15/85GK104372023SQ201410643862
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】孙怡朋, 刘金华, 沈晔, 蒲娟 申请人:中国农业大学