一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-A3a基因的分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-A3a基因的分子标记及应用。所述分子标记由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。实验证明：通过该分子标记能快速筛选出具有Glu-A3a基因的小麦品种，相应的面粉品质也会提高，从而加速含有优质基因的小麦新品种的育成步伐。
【专利说明】一种普通小麦低分子量谷蛋白Gl u-A3a基因的分子标记及 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-A3a基因 的分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上三大重要粮食作物之一，是全世界约20%人口的主食。小麦面粉中 含有其它作物所没有的蛋白质面筋成分，让小麦面团具有粘弹性和延展性，适合制作成面 包、馒头、面条、饼干、糕点等多种食品。小麦也是人们日常饮食中重要的蛋白质来源之一， 小麦面粉中约含10% -15%的蛋白质。小麦种子蛋白按其功能的不同分为两大类：一类为 代谢蛋白，另一类为贮藏蛋白。代谢蛋白分为水溶性的清蛋白（albumins)和盐溶性的球蛋 白（globulins)两种，主要与营养品质有关；IC藏蛋白也分为醇溶蛋白（gliadins)和谷蛋 白（glutenins)两种，主要影响小麦的加工品质。谷蛋白和醇溶蛋白约占种子蛋白的85% 左右。
[0003] 麦谷蛋白包括高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS)两 种，分别占胚乳总蛋白含量的10%和40%左右。LMW-GS基因不含有内含子，且基因较小。 一个LMW-GS基因的长度在900-1200bp之间，多数LMW-GS基因含有250-300个氨基酸残基。 其中谷氨酰胺和脯氨酸占氨基酸总数的50%左右，大约分别为30%和15%。此外LMW-GS 基因拷贝数较多，大概有10-15个到35-40个。这些LMW-GS基因大部分位于第1部分同源 染色体短臂上的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上，这些位点与编码醇溶蛋白的Gli-I位点 紧密连锁。Glu-3位点存在大量的等位变异，最近的研宄显示，在小偃54小麦品种中，鉴定 到了 14个唯一的低分子量谷蛋白亚基。有4个在Glu-A3位点，3个在Glu-B3位点，7个在 Glu-D3 位点。
[0004] 低分子量谷蛋白约占种子贮藏总蛋白的三分之一左右，占麦谷蛋白的60%左右， 是组成麦谷蛋白大聚体的重要成分，因而有理由认为，低分子量谷蛋白的数量和组成对小 麦品质具有显著影响。在对澳大利亚小麦品种的鉴定中，得知LMW-GS对Rmax的作用大于 HMW-GS。根据最近的研宄，Glu-3位点对Rmax的贡献率排序如下：Glu-A3b>Glu-A3d>Glu-A 3e>Glu-A3c，Glu-B3i>Glu-B3b = Glu-B3a>Glu-B3e = Glu-B3f = Glu-B3g = Glu-B3h>Glu -B3c, Glu-D3e>Glu-D3b>Glu-D3a>Glu-D3c>Glu-D3d。研宄表明，对于不同 Glu-3 亚基，组合 为Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b的品种具有最好的延伸性，亚基组合为Glu-A3b、Glu-B3b 和Glu-D3c的品种的延伸性也较好，亚基组合为Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b，Glu-A3b、 Glu-B3b和Glu-D3c以及Glu-A3c、Glu-B3b和Glu-D3c的品种，其面包品质最好。一些研 宄认为有些LMW-GS对某些小麦加工品质参数的影响效应比HMW-GS大。由此可见，LMW-GS 与小麦品质之间具有密切的关系，不同亚基的影响也不尽相同。
[0005] HMW-GS主要决定小麦面粉的粘弹性，而LMW-GS则主要决定小麦的面筋强度。对 于HMW-GS来说，由于其基因拷贝数较少，易于用SDS-PAGE区分，等位基因变异及其与小麦 品质的关系已得到了广泛深入的研宄，针对其重要亚基的功能标记也已经开发和应用。然 而，因为LMW-GS数目较多、分子量小且在电泳图谱上与大量的醇溶蛋白相互重叠，因此对 LMW-GS及其编码基因与品质参数之间关系的研宄相对较少。随着研宄分析方法的不断改 进，大量的LMW-GS亚基和基因得到鉴定和克隆，其对加工品质的重要性以及研宄的必要性 逐步得到认识，有关LMW-GS对品质的研宄越来越受到重视。现代社会，随着人民生活水平 的提高，对小麦品质的要求越来越高，培育出优质的小麦新品种对于育种工作者也是迫在 眉睫。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因的引物 对。
[0007] 本发明提供的引物对由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
[0008] 上述引物对中，所述编码Glu-A3a基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所 不O
[0009] 本发明的另一个目的是提供上述所述的引物对在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否 含有Glu-A3a基因中的应用。
[0010] 本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基 因的试剂盒。
[0011] 本发明提供的试剂盒包含上述所述的引物对。
[0012] 上述所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因中的应用 也是本发明的保护范围。
[0013] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a 基因的方法，包括如下步骤：
[0014] (1)提取待测小麦品种的基因组DNA ;
[0015] (2)以所述基因组DNA为模板，采用上述所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物；若扩增产物大小为507bp，则待检测的小麦品种含有或候选含有Glu-A3a基因。
[0016] 上述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为58°C。
[0017] 本发明通过在普通小麦中国春中克隆得到低分子量谷蛋白亚基Glu_A3a的基因 序列，并根据Glu-A3a基因单核苷酸突变位点设计一对特异性引物Glu-A3F/Glu-A3R，提供 了鉴定小麦Glu-A3a基因等位变异的分子标记，用于该基因的筛选，对利用分子标记辅助 选择高产小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为在48个含有不同的低分子量谷蛋白亚基的品种中分子标记的检测结果。
[0019] 图2为在含有不同的Glu-A3位点的Aroona近等基因系以及CS-IS1(IB)代换系 和CS+1S 11S1附加系中分子标记的检测结果。
[0020] 图3为分子标记在重组自交系和Aroona近等基因系中的检测结果。其中，图3a 为重组自交系的SDS-PAGE图；图3b为分子标记在重组自交系（1-15)和Aroona近等基因 系（17-23)中的扩增结果。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023] 实验材料 CS，CS-n 和 CB037A 在文献"Zitong Yu，Caixia Han，Xing Yan,Xiaohui Li,Guoliang Jiang,and Yueming Yan*,Rapid Characterization of Wheat Low Molecular Weight Glutenin Subunits by Ultraperformance Liquid Chromatography (UPLC) , Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61，4026-4034. "中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0024] 实验材料 CS-ISl(IB)代换系在文献 "Wang Shunli, Yu Zitong, Cao Min,Shen Xxi, Li Ning, Li Xiaohui, Ma Wujun, Wei β gerber H,Zeller F, Hsam S, Yan Yueming, Molecular mechanisms of HMff glutenin subunits from ISl genome of Aegilops longissima positively affecting wheat breadmaking quality. PloS 0ne2013, 8(4) :e58947. "中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0025] 实施例里表2中编号为4-57的材料在"Wang L，Li G，Pefia RJ，Xia X，He Z, Development of STS markers and establishment of multiplex PCR for Glu_A3 alleles in common wheat(Triticum aestivum L.). J Cereal Sci2010,51 (3):305-312. " 中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0026] 实施例1、鉴定普通小麦品种中是否含有Glu_A3a基因的方法
[0027] UDNA 提取
[0028] 用CTAB法提取小麦叶片的DNA，提取所得DNA拿CldH2O溶解，DNA经1 %琼脂糖凝 胶电泳进行质量检测，提取的DNA要求无明显杂质、条带清晰、无降解。
[0029] 2、PCR 扩增
[0030] 以上述步骤1获得的小麦基因组DNA为模板，采用表1中的引物进行PCR扩增。
[0031] 表1、用于鉴定普通小麦Glu_A3a基因等位变异的引物序列
[0032]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因的引物对； 所述引物对由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述编码Glu-A3a基因的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID No. 3所示。
3. 权利要求1或2所述的引物对在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因中 的应用。
4. 一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因的试剂盒，该试剂盒包含权利 要求1所述的引物对。
5. 权利要求4所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因中的应 用。
6. -种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有Glu-A3a基因的方法，包括如下步骤： (1) 提取待测小麦品种的基因组DNA; (2) 以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；若扩增产物大小为507bp，则待检测的小麦品种含有或候选含有Glu-A3a基因。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为 58。。。
8. 权利要求1所述引物对或权利要求6所述方法在鉴定含有低分子量谷蛋白亚基的小 麦中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，含有Glu-A3a基因的小麦为含有低分子量 谷蛋白亚基的小麦。
【文档编号】C12N15/11GK104480198SQ201410670432
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】晏月明, 甄守民, 马超颖, 李小辉 申请人:首都师范大学