一种用于肺癌检测的rbm5fish探针的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，该RBM5 FISH探针可用于肺癌早期诊断，与现有的分子探针联用可显著提高诊断的准确率，适用于多种类型的检测样本，如石蜡切片、细胞滴片、细胞涂片、痰细胞，可适用于多种临床样本的检测。本发明可制备成试剂盒，实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助于综合评价各分子标志物与肺癌发生发展的联系。
【专利说明】-种用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体是一种用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前世界上最常见、致死率最高的人类恶性肿瘤之一，且发病率在世界范 围内呈上升趋势。造成肺癌患者高死亡率的原因之一是早期诊断技术的缺乏。科学研究显 示，很多肺癌患者出现临床症状就诊时已处于中晚期，其5年生存率不到15%;而肺癌的早 期特别是I期的确诊将显著提高患者5年生存率至80%。
[0003] 肺癌的发生发展与一系列基因包括EGFR、KRAS、ALK等的突变相关，近年来发现 RBM5(RNA-binding motif protein 5)在肺癌发生发展中具有重要的作用。RBM5于1996 年被克隆出来，曾被命名为LUCA-15、RBM5、H37等，是RNA结合基序蛋白家族成员，位于3 号染色体短臂2区1带3亚带（3p21. 3)，在假定的人类肺癌的肿瘤抑制基因区域中。研究 发现，3p21. 3区域基因的杂合性缺失是肺癌前病变最常见的染色体改变，在人肺癌组织中 RBM5存在缺失现象，65 %的肺鳞癌患者及85%的肺腺癌患者的RBM5表达水平明显低于非 肿瘤组织。体外细胞实验及动物实验表明，RBM5具有抑制肺癌细胞生长和转移的功能。
[0004] 基因变异是肿瘤发生的早期事件，对癌症发生发展中特异基因的监测是筛查早期 癌症的有效手段。突光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)以其高灵 敏度和特异性成为目前临床上检测基因突变的重要技术。目前，ALK基因重排检测已经用 于肺癌的临床诊断中，雅培Vysis ALK Break Apart FISH探针试剂盒是肺癌FISH检测最 常用的试剂盒。由于肺癌发生发展中存在众多基因的作用，多基因检测的准确率显著高于 单基因检测，RBM5等新探针的开发将开拓肺癌检测的途径，多探针联用会显著提高诊断的 准确性。RBM5的缺失检测能在较早阶段预示人罹患肺癌的风险。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，通过制备的探针检 测RBM5的缺失诊断患者是否罹患肺癌，具有检测灵敏度高、特异性好的特点，可提高肺癌 诊断的准确率。
[0006] 为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 步骤一、克隆的筛选：通过NCBIMapview数据库检索所有含有RBM5基因的克隆， 并对这些克隆进行筛选，选择出最优的克隆；按照筛选出的最优克隆编号购买克隆Life TechnologyRPCI11.C；
[0009] 步骤二、克隆的培养：
[0010] 用牙签挑取克隆RPCI11. C，在含25 i! g/ml氯霉素的LB固体培养基上划线，将划线 后的LB固体培养基37°C静止培养16-24h获得RPCI11. C单菌落；挑取RPCI11. C单菌落转 入5ml含25 ii g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C 220rpm/min培养8-12h ;取0? 5-lml上 述培养液转入l〇〇ml含25 ii g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C 220rpm/min培养16-24h 得到克隆培养液；
[0011] 步骤三、RBM5基因的提取：
[0012] 收集上述步骤二得到的克隆培养液，3000rpm/min离心lOmin ;取沉淀，应用质粒 DNA提取试剂盒提取RBM5基因；使用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RBM5基因的浓度 和纯度；
[0013] 步骤四、RBM5基因的鉴定：
[0014] 针对RBM5基因使用上游引物和下游引物进行PCR扩增，并通过1 %糖凝胶电泳对 扩增产物片段进行分析，以完成RBM5基因的鉴定；
[0015] 步骤五、RBM5探针的制备：
[0016] 应用缺口平移法对RBM5基因进行荧光标记，对标记物进行乙醇沉淀获得RBM5探 针，避光、-20°C储存；
[0017] 步骤六、RBM5探针的验证
[0018] 使用人肺癌组织检测样本进行探针验证。
[0019] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤一中所述含有RBM5 基因的最优克隆，编号为RP11-493K19。
[0020] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤四中RBM5PCR扩增的 上游引物为：AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA，下游引物为：GCACCCTACACTTTATCACAGCA。
[0021] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤六RBM5探针的验证 具体包括如下步骤：
[0022] (1)将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2)将RBM5探 针与玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3)杂交后，对玻片进行洗涤；(4)使 用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5)使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
[0023] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤（1)所述待检测组织 的预处理为：
[0024] (a)石蜡切片 8〇°C溶蜡 3〇min，
[0025](b)Histo-Clear II脱錯 15 分钟，
[0026](c)无水乙醇浸泡10分钟，
[0027](d)流水冲洗10分钟，
[0028](e)蛋白酶 K 8ug/ml 消化 lh 40min，
[0029] (f)流水冲洗30分钟。
[0030] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤（2)将所述RBM5探 针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为：
[0031] (a)将经过步骤（1)预处理的石蜡切片98°C水浴浸泡45分钟，
[0032] (b)蒸馏水浸泡5分钟，
[0033] (c)用吸水纸吸干石蜡切片上的水分，
[0034] (d)用7 ill杂交缓冲液溶解CEP-3探针和RBM5探针，补加水至10 iil，
[0035](e)将溶解好的10illCEP-3探针和RBM5探针混合液加到切片上的样本区域上，
[0036] (f)用封片胶封片，
[0037] (g)封片后的切片75°C静止7分钟，
[0038] (h)转入含有37°C热水的杂交湿盒中37°C杂交16_24h。
[0039] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤（3)所述玻片洗涤 为：
[0040] (a)杂交后打开湿盒，用镊子撕去封片胶，
[0041] (b)将玻片转入25°C的2XSSC/0. 1% NP-40洗液中，室温浸泡5分钟，去掉盖玻 片，
[0042] (c)将去掉盖玻片后的玻片转入72°C的2XSSC/0.3%NP_40洗液中，洗涤5分钟，
[0043] (d)将洗涤后的玻片迅速转入70%乙醇中，室温浸泡5分钟。
[0044] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤（4)所述复染方法 为：
[0045] (a)用镊子取出70%乙醇中的玻片，暗处自然干燥，
[0046] (b)加入10ulDAPI，盖上盖玻片，
[0047] (c)用锡纸包裹起来，直接观察或放入-20°C冰箱保存。
[0048] 如上所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，步骤（5)所述观察方法 为：
[0049] (a)用荧光显微镜观察，依次用红色、绿色、蓝色激发光滤光片观察单色结果，
[0050] (b)在三通位置观察三色结果，
[0051] (c)用 FISH2.0 软件采图，
[0052](d)结果判定：统计细胞内红色荧光信号和绿色荧光信号信号点的数目并进行比 较，在人肺癌组织细胞中，CEP-3探针呈红色信号，RBM5探针呈绿色信号，细胞内出现绿色 荧光信号说明RBM5探针制备良好且探针与细胞DNA杂交成功，两种荧光信号的出现说明探 针检测体系优良，适合同一样本不同探针的检测，当细胞内存在两个红色荧光信号和一个 绿色荧光信号时说明细胞存在RBM5基因的缺失。
[0053] 本发明与现有技术相比，具有下列优点：
[0054](1)本发明提供了一种肺癌早期诊断的新的分子探针的制备方法，该分子探针与 现有的分子探针联用可显著提高诊断的准确率；
[0055] (2)本发明适用于多种类型的检测样本，如石蜡切片、细胞滴片、细胞涂片、痰细 胞，可适用于多种临床样本的检测；
[0056] (3)本发明提供的检测方法不使用甲酰胺试剂进行杂交后的样本洗涤，安全性 好；
[0057] (4)本发明提供的技术体系重复性好，分子诊断及分子医学检验等领域的技术人 员可独立操作；
[0058] (5)本发明可制备成试剂盒，实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助 于综合评价各分子标志物与肺癌发生发展的联系。
【专利附图】
【附图说明】
[0059] 图1所示为本发明RBM5基因的电泳鉴定结果，其中1道为DNA Marker，2道是空 白对照，3道为RBM5PCR扩增产物，PCR扩增产物的分子量为363bp;
[0060] 图2所示为本发明RBM5探针的电泳鉴定结果，其中1道为DNA Marker，2道为RBM5 基因，3道为RBM5探针，探针长度为300-600bp，用红色方框突出显示；
[0061] 图3所示为本发明人肺癌组织石蜡切片RBM5探针和CEP-3探针的检测结果，其 中，CEP-3探针呈红色信号，RBM5探针呈绿色信号），图片右边的箭头指示的细胞细胞内同 时具有两个红色荧光信号点和两个绿色荧光信号点，其不存在RBM5基因的缺失，图片左边 的箭头指示的细胞细胞内具有两个红色荧光信号点和一个绿色荧光信号点，这个细胞存在 RBM5基因的缺失。
【具体实施方式】
[0062] 下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0063] 本发明提供一种用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，包括如下步骤：
[0064] 步骤一、克隆的筛选：
[0065] 通过NCBI Mapview数据库检索所有含有RBM5基因的克隆，并对这些克隆进行筛 选，选择出最优的克隆；所述含有RBM5基因的最优克隆，编号为RP11-493K19。
[0066] 按照筛选出的最优克隆编号购买克隆LifeTechnologyRPCI11.C;
[0067] 步骤二、克隆的培养：
[0068] 用牙签挑取克隆RPCI11. C，在含25 ii g/ml氯霉素的LB固体培养基上划线，将划线 后的LB固体培养基37°C静止培养16-24h获得RPCI11. C单菌落；
[0069] 挑取RPCI11. C单菌落转入5ml含25 y g/ml氯霉素的LB液体培养基中， 37°C 220rpm/min 培养 8-12h;
[0070] 取0. 5-lml上述培养液转入100ml含25iig/ml氯霉素的LB液体培养基中， 37°C 220rpm/min培养16-24h，得到克隆培养液。
[0071] 步骤三、RBM5基因的提取：
[0072] 收集上述步骤二得到的克隆培养液，3000rpm/min离心lOmin ;取沉淀，应用质粒 DNA提取试剂盒提取RBM5基因，DNA提取试剂盒可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen 公司的 Plasmid Midi Kit;
[0073] 使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RBM5基因的浓度和纯度，RBM5基因的浓 度检测可使用市售的DNA Marker，优选Lambda DNA/HindIII。
[0074] 步骤四、RBM5基因的鉴定：
[0075] 针对RBM5基因使用上游引物和下游引物进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增，并通过1 %糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，以完成RBM5基因的 鉴定。
[0076]其中，RBM5PCR 扩增的上游引物为：AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA，其 DNA 序列如 SEQ ID NO: 1 所示；下游引物为：GCACCCTACACTTTATCACAGCA，其 DNA 序列如 SEQ ID N0:2 所示。
[0077] RBM5基因的鉴定具体步骤为：
[0078] (1)将PCR所需试剂冰浴溶解。
[0079] (2)在PCR管中加入以下物质：
[0080]
【权利要求】
1. 一种用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 步骤一、克隆的筛选： 通过NCBI Mapview数据库检索所有含有RBM5基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选 择出最优的克隆；按照筛选出的最优克隆编号购买克隆Life Technology RPCI11.C; 步骤二、克隆的培养： 用牙签挑取克隆RPCI11. C，在含25ii g/ml氯霉素的LB固体培养基上划线，将划线后 的LB固体培养基37°C静止培养16-24h获得RPCI11. C单菌落；挑取RPCI11. C单菌落转入 5ml含25 ii g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C 220rpm/min培养8-12h ;取0. 5-lml上述 培养液转入l〇〇ml含25ii g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C 220rpm/min培养16-24h 得到克隆培养液； 步骤三、RBM5基因的提取： 收集步骤二得到的克隆培养液，3000rpm/min离心lOmin ;取沉淀，应用质粒DNA提取试 剂盒提取RBM5基因；使用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RBM5基因的浓度和纯度； 步骤四、RBM5基因的鉴定： 针对RBM5基因使用上游引物和下游引物进行PCR扩增，并通过1 %糖凝胶电泳对扩增 产物片段进行分析，以完成RBM5基因的鉴定； 步骤五、RBM5探针的制备： 应用缺口平移法对RBM5基因进行荧光标记，对标记物进行乙醇沉淀获得RBM5探针，避 光、-20°C储存； 步骤六、RBM5探针的验证： 使用人肺癌组织检测样本进行探针验证。
2. 如权利要求1所述的用于肺癌检测的RBM5FISH探针的制备方法，其特征在于：步骤 一中所述含有RBM5基因的最优克隆，编号为RP11-493K19。
3. 如权利要求1所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在 于：步骤四中RBM5 PCR扩增的上游引物为：AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA，下游引物为： GCACCCTACACTTTATCACAGCA。
4. 如权利要求1所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步 骤六RBM5探针的验证具体包括如下步骤： (1)将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2)将RBM5探针与 玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3)杂交后，对玻片进行洗涤；(4)使用复 染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5)使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
5. 如权利要求4所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步 骤（1)所述待检测组织的预处理为： (a) 石蜡切片80°C溶蜡30min， (b) Histo-Clear II 脱錯 15 分钟， (c) 无水乙醇浸泡10分钟， (d) 流水冲洗10分钟， (e) 蛋白酶 K 8ug/ml 消化 lh 40min， (f) 流水冲洗30分钟。
6. 如权利要求4或5所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步骤（2)将所述RBM5探针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为： (a) 将经过步骤（1)预处理的石蜡切片98°C水浴浸泡45分钟， (b) 蒸馏水浸泡5分钟， (c) 用吸水纸吸干石蜡切片上的水分， (d) 用7 yl杂交缓冲液溶解CEP-3探针和RBM5探针，补加水至10 yl， (e) 将溶解好的lOul CEP-3探针和RBM5探针混合液加到切片上的样本区域上， (f) 用封片胶封片， (g) 封片后的切片75°C静止7分钟， (h) 转入含有37°C热水的杂交湿盒中，37°C杂交16-24h。
7. 如权利要求4所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步 骤（3)所述玻片洗涤为： (a) 杂交后打开湿盒，用镊子撕去封片胶， (b) 将玻片转入25°C的2XSSC/0. 1% NP-40洗液中，室温浸泡5分钟，去掉盖玻片， (c) 将去掉盖玻片的玻片转入72°C的2XSSC/0. 3% NP-40洗液中，洗涤5分钟， (d) 将洗涤后的玻片转入70%乙醇中，室温浸泡5分钟。
8. 如权利要求4所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步 骤（4)所述复染方法为： (a) 用镊子取出70%乙醇中的玻片，暗处自然干燥， (b) 加入10ul DAPI，盖上盖玻片， (c) 用锡纸包裹起来，直接观察或放入-20°C冰箱保存。
9. 如权利要求4所述的用于肺癌检测的RBM5 FISH探针的制备方法，其特征在于：步 骤（5)所述观察方法为： (a) 用荧光显微镜观察，依次用红色、绿色、蓝色激发光滤光片观察单色结果， (b) 在三通位置观察三色结果， (c) 用FISH2.0软件采图， (d) 结果判定：统计细胞内红色荧光信号和绿色荧光信号信号点的数目并进行比较， 在人肺癌组织细胞中，CEP-3探针呈红色信号，RBM5探针呈绿色信号，细胞内出现绿色荧光 信号说明RBM5探针制备良好且探针与细胞DNA杂交成功，两种荧光信号的出现说明探针检 测体系优良，适合同一样本不同探针的检测，当细胞内存在两个红色荧光信号和一个绿色 荧光信号时说明细胞存在RBM5基因的缺失。
【文档编号】C12Q1/68GK104450899SQ201410704376
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】吕家燕, 代建丽 申请人:武昌理工学院, 武汉华龙生物制药有限公司