鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒。本发明提供的引物对，由如下5对引物对组成：引物对1(序列1和序列2)、引物对2(序列3和序列4)、引物对3(序列5和序列6)、引物4(序列7和序列8)、引物对5(序列9和序列10)。应用本发明所提供的试剂盒对仓储豆象进行种的鉴定，具有不受标本个体发育状态及样品完整性的影响，具有省时、高效、准确的优点。本发明可在粮食储藏部门和检疫部门广泛应用。
【专利说明】鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地指一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 豆象属鞘翅目（Coleoptera)豆象科（Bruchinae)，分布于除南极之外的世界 各大陆，尤其以亚洲的热带区以及中美和南美的数量最多。豆象科昆虫目前全世界记 录约1400种，分属于58个属。该科昆虫大约84 %的种类取食豆科植物种子，成为栽 培豆科植物的一类重要害虫。我国储藏物中豆象科昆虫共记载有18种，其中绿豆象 Callosobruchus chinensis (Linnaeus)、香豆象 Bruchus rufimanus Boheman 和碗豆象 Bruchus pisorum(Linnaeus)为我国主要的储藏豆类害虫；而菜豆象Acanthoscelides obtectus(Say)和四纹?象Callosobruchus maculatus为我国规定禁止入境的检疫性害 虫。
[0003] 由于豆象个体微小（约2-5mm)且种间外部形态极为相似等原因，传统的形态学鉴 定技术仅能鉴定具有明显特征形态的成虫，并要求工作人员具有丰富的种类鉴定经验。同 时，豆象能够以卵、幼虫、蛹、成虫随寄主果实和运输工具等进行远距离人为传播，且以卵、 幼虫、蛹等非成虫态样品为主，需将其饲养至成虫才能进行种类鉴定。因此，传统的基于形 态学特征的豆象种类鉴定技术已不能满足快速、准确鉴定豆象种类的需求。
[0004] 随着现代分子生物学技术的发展，利用现代分子生物学技术进行豆象种类鉴定， 不受豆象发育阶段和环境条件的影响，对于非成虫态的样品及形态结构不完整的成虫样 品，均能从基因序列上获得准确、可靠的鉴定信息。
[0005] 但是，分子生物学鉴定方法主要包括同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性分 析（RFLP)技术、随机扩增DNA多态性分析（RAPD)技术、核酸序列分析技术及特异引物PCR 技术。限制性片段长度多态性PCR技术结果较为准确，但筛选所需限制性内切酶种类的工 作量较大。
[0006] 目前，还没有一种高效、便捷鉴别不同仓储豆象种类的鉴定方法。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及 其试剂盒，从分子水平对豆象进行种类鉴定，是一种高效、便捷的方法，对于采取有效的防 治措施和检疫处理措施具有重要意义。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对，其 由以下5对引物对组成，分别为引物对1?引物对5 :
[0009] 1)引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
[0010] 2)引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
[0011] 3)引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
[0012] 4)引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
[0013] 5)引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
[0014] 其中，序列1由22个核苷酸组成；序列2由22个核苷酸组成；序列3由25个核苷 酸组成；序列4由21个核苷酸组成；序列5由22个核苷酸组成；序列6由22个核苷酸组 成；序列7由19个核苷酸组成；序列8由26个核苷酸组成；序列9由22个核苷酸组成；序 列10由22个核苷酸组成。
[0015] 所述仓储豆象为如下中至少一种：豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象。
[0016] 基于上述引物对本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的试剂盒，包括如 下5对引物对中至少一对：
[0017] 1)引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
[0018] 2)引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
[0019] 3)引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
[0020] 4)引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
[0021] 5)引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
[0022] 进一步地，所述试剂盒中组成每对引物的两条单链DNA的摩尔数相同。
[0023] 所述仓储豆象为如下中至少一种：豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象。
[0024] 在所述试剂盒中，所述引物对1特异于豌豆象；所述引物对2特异于四纹豆象；所 述引物对3特异于蚕豆象；所述引物对4特异于菜豆象；所述引物对5特异于绿豆象。
[0025] 所述试剂盒还包装有：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0026] 本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的方法，包括以下步骤：
[0027] 1)以待测仓储豆象的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1或3所述5对引物 对进行PCR扩增，获得相应的扩增产物，检测PCR扩增产物大小；
[0028] 若所述引物对1扩增产物的大小为166bp，则待测仓储豆象为豌豆象；
[0029] 若所述引物对2扩增产物的大小为276bp，则待测仓储豆象为四纹豆象；
[0030] 若所述引物对3扩增产物的大小为167bp，则待测仓储豆象为蚕豆象；
[0031] 若所述引物对4扩增产物的大小为432bp，则待测仓储豆象为菜豆象；
[0032] 若所述引物对5扩增产物的大小为274bp，则待测仓储豆象为绿豆象。
[0033] 在上述方法中，所述PCR扩增中，PCR扩增的退火温度为54°C。
[0034] 在上述方法中，所述PCR扩增中，反应体系中每对引物的两条单链DNA的摩尔比 均为1 : 1。本发明中，每对引物中单条引物在各自的PCR反应体系中的摩尔浓度均为 0· 4 μ M 〇
[0035] 在上述方法中，所述166bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列11 ;所述 276bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列12 ;
[0036] 所述167bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列13 ;
[0037] 所述432bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列14 ;
[0038] 所述274bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列15。
[0039] 检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
[0040] 本发明的有益效果在于：
[0041] 1)本发明针对豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象这5种世界常见的仓储 豆象，基于mtDNA CO I基因序列分别设计了特异引物，可直接鉴别以上5种仓储豆象；
[0042] 2)与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态 的鉴定；
[0043] 3)技术通用性强，对仪器设备要求不高，在实际工作中容易推广应用；
[0044] 4)操作过程简单、耗时较短、灵敏度高且较稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1为用于鉴定豌豆象引物对（引物对1)的特异性检测结果；
[0046] 图2为用于鉴定四纹豆象引物对（引物对2)的特异性检测结果；
[0047] 图3为用于鉴定蚕豆象引物对（引物对3)的特异性检测结果；
[0048] 图4为用于鉴定菜豆象引物对（引物对4)的特异性检测结果；
[0049] 图5为用于鉴定绿豆象引物对（引物对5)的特异性检测结果；
[0050] 图6为用于鉴定豌豆象引物对（引物对1)的灵敏度检测结果；
[0051] 图7为用于鉴定四纹豆象引物对（引物对2)的灵敏度检测结果；
[0052] 图8为用于鉴定蚕豆象引物对（引物对3)的灵敏度检测结果；
[0053] 图9为用于鉴定菜豆象引物对（引物对4)的灵敏度检测结果；
[0054] 图10为用于鉴定鉴定绿豆象引物对（引物对5)的灵敏度检测结果。
【具体实施方式】
[0055] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0056] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058] 实施例1特异引物对的设计
[0059] 通过在GenBank中搜索查询豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象的mtDNA CO I序列，用DNAMAN软件对目标种的mtDNA CO I序列进行比对分析，根据分析结果，针对 目的基因序列人工设计特异引物，并用Oligo软件对引物进行评估，检查引物Tm值、GC%、 错配、二聚体和发夹结构等，并用GenBank中的Blast程序检查同源序列。
[0060] 设计的5对引物对如表1所示：
[0061] 表1为特异引物序列
[0062]
【权利要求】
1. 一种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对，其特征在于：其由以下5对引物对组成，分 别为引物对1?引物对5 : 1) 引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成； 2) 引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成； 3) 引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成； 4) 引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成； 5) 引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
2. 根据权利要求1鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对，其特征在于：所述仓储豆象为 如下中至少一种：豌豆象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象。
3. -种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的试剂盒，其特征在于：包括如下5对引物对中至少 一对： 1) 引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成； 2) 引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成； 3) 引物对3由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成； 4) 引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成； 5) 引物对5由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中组成每对引物的两条单 链DNA的摩尔数相同。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述仓储豆象为如下中至少一种：豌豆 象、四纹豆象、蚕豆象、菜豆象和绿豆象。
6. 根据权利要求3?5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包装有：PCR 反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
7. -种鉴定或辅助鉴定仓储豆象的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1)以待测仓储豆象的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1或3所述5对引物对进 行PCR扩增，获得相应的扩增产物，检测PCR扩增产物大小； 若所述引物对1扩增产物的大小为166bp，则待测仓储豆象为豌豆象； 若所述引物对2扩增产物的大小为276bp，则待测仓储豆象为四纹豆象； 若所述引物对3扩增产物的大小为167bp，则待测仓储豆象为蚕豆象； 若所述引物对4扩增产物的大小为432bp，则待测仓储豆象为菜豆象； 若所述引物对5扩增产物的大小为274bp，则待测仓储豆象为绿豆象。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，PCR扩增的退火温度为 54。。。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，反应体系中每对引物的 两条单链DNA的摩尔比均为1 : 1。
10. 根据权利要求7?9中任一所述的方法，其特征在于： 所述166bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列11 ; 所述276bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列12 ; 所述167bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列13 ; 所述432bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列14 ; 所述274bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列15。
【文档编号】C12Q1/68GK104498593SQ201410717232
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】刘昌燕, 万正煌, 焦春海, 李莉, 陈宏伟, 刘良军, 伍广洪 申请人:湖北省农业科学院粮食作物研究所