可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质及其应用。本发明利用Strep-tag多肽可与负载有Strep-Tactin蛋白的基质相结合的特性，可在不同基质表面连接多肽。将生物靶向分子进行化学衍生形成生物分子-Strep-tag偶联物，通过Strep-tag与Strep-Tactin的特异性识别作用将生物分子-Strep-tag偶联物固定于基质表面。加入生物素后，生物素与Strep-Tactin的竞争结合会破坏生物分子与基质的连接，从而实现对待测物的可逆捕获和释放。本发明制备及使用过程简单、快速，并且重复性好，可广泛用于肿瘤标志物检测、细胞捕获和释放等领域。
【专利说明】可逆组装和分解的strep-tag多化标记的生物分子衍生化 基质及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物、化学及材料科学领域，涉及一种可逆组装和分解的Strep-tag 多肤标记的生物分子衍生化基质及其应用。
【背景技术】
[0003] Str巧-tag纯化系统是基于Str巧-tag多肤和特殊设计的Str巧-Tactin (streptavidin的变体）之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系 统，其技术开发的原理是生物素（biotin)和链霉亲和素（str巧tavidin)之间的结合反 应。Str巧-tag多肤包含Strep-tag I和Strep-tag II，它们对Strep-Tactin的结合亲 和力比对streptavidin高。在亲和纯化过程中，附了 tag的蛋白质结合在被固定了的 Strep-Tactin上。短暂的洗涂步骤之后，在同一缓冲液中加入特异性竞争剂生物素即可将 纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。该系统具有简单、易使用、可在生理条件下进行竞争性洗 脱等特点，已被广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化及鉴定领域。但目前该一系统并未运 用于循环肿瘤细胞的捕获及释放，限制了其应用范围。
[0004] 循环肿瘤细胞是进入外周血的肿瘤细胞，其检测可有效地应用于体外早期诊断及 个性化治疗等。循环肿瘤细胞的无损分离、捕获和再培养可W为循环肿瘤细胞的基因和蛋 白质分析提供研究基础。但由于肿瘤细胞具有数量稀少及异质性等特点，因此需要发展能 高效分离肿瘤细胞的方法。
[0005] 目前，针对于循环肿瘤细胞捕获及释放的方法有较多报道，但往往存在缺乏特异 性、探针制备过程繁琐、操作过程复杂、捕获及释放过程对细胞有较大损伤等问题，关于循 环肿瘤细胞的无损分离及体外培养仍较少被报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可逆组装和分解的 Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质及其在细胞的捕获及释放中的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种可逆组装和分解的Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质为将Strep-tag多 肤标记的生物分子固定在负载有Strep-化ctin蛋白的基质上得到。
[0008] 所述的str巧-tag多肤包括strep-tag I (含九个氨基酸，其序列为Ala -hp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly)、Str巧-tag II (含八个氨基酸，其序列为 T;rp-Se;r-His-P;r〇-Gln-Phe-Glu-Lys)及其相关的衍生物和类似物。
[0009] 所述的生物分子包括抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体等可W对 细胞、蛋白、核酸、生物小分子进行特异性识别和捕获的蛋白或核酸。
[0010] 所述的str邱-tag多肤标记的生物分子为偶联strep-tag多肤的生物分子（生物 分子-Str巧-tag偶联物）。
[0011] 当生物分子为抗体时，Str巧-tag多肤标记的抗体优选通过包含如下步骤的方法 制备得到；通过高楓酸轴或高楓酸钟将抗体化端的糖残基氧化成酵基后与Strep-tag多肤 上的氨基反应得到Strep-tag多肤标记的抗体。
[0012] 当生物分子为除抗体外的链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体等生物分 子时，所述的Strep-tag多肤标记的生物分子优选通过包含如下步骤的方法制备得到；通 过1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（l-eth5d-3-(3-dimeth}daminop;ropyl )carbodiimide hy化ochloride,邸C ?肥1)、N-轻基玻巧醜亚胺（N-Hy化oxysuccinimide, N服）活化链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体等生物分子的駿基，再与Strep-tag 多肤的氨基连接得到Strep-tag多肤标记的生物分子。
[0013] 所述的负载有Strep-化ctin蛋白的基质为商品化负载有Strep-化ctin的磁珠或 商品化含Strep-化ctin的树脂球、孔板等，也可将Strep-化ctin蛋白修饰于任一种基质 上。
[0014] 当可逆组装和分解的Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质中的生物分子 为链酶亲和素时，还可W将另外一种生物分子生物素化后通过与链酶亲和素的作用固定在 负载有Strep-化ctin蛋白的基质上。
[0015] 本发明通过将Strep-tag多肤连接生物分子制得Strep-tag多肤标记的生物分 子；再利用Str巧-tag多肤可与负载有Strep-化ctin蛋白的基质相结合的特性，将多肤 标记的生物分子固定于基质表面，制得具有优异生物祀向性的Strep-tag多肤标记的生物 分子衍生化基质。将生物素与Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质赔育，生物素与 Strep-Tactin的竞争结合会破坏生物分子与基质的连接，从而实现对待测物的可逆捕获和 释放。
[0016] 上述Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质可用于细胞的捕获及释放。当生 物分子为抗体，在制备多肤标记的抗体衍生化基质用于细胞的捕获和释放时，可W通过W 下两种方式：先将二抗通过高楓酸轴或高楓酸钟氧化，然后与Strep-tag多肤连接获得多 肤标记的二抗，再通过二抗与一抗的作用固定可W用于细胞识别的一抗；也可W直接将一 抗通过高楓酸轴或高楓酸钟氧化，然后与Strep-tag多肤连接获得多肤标记的一抗，用于 细胞的捕获。
[0017] 一种Str巧-tag多肤标记的生物分子衍生化基质用于细胞的捕获及释放的方法， 包括如下步骤： (1)将Strep-tag多肤标记的生物分子衍生化基质与细胞混合并赔育后分离，提取特 异性捕获细胞的基质。
[0018] (2)将特异性捕获细胞的基质与生物素或其衍生物巧日脱硫生物素代替）混合后赔 育，提取释放后的细胞进行后续分析。
[0019] 优选的，一种strep-tag多肤标记的抗体衍生化基质用于细胞捕获及释放的方法 包括如下步骤： (1)将5?1000 y g/mL的抗体与20mM高楓酸轴或高楓酸钟按照体积比1:1混合，赔 育0. 5?2小时后，通过高楓酸轴或高楓酸钟将抗体化端的糖残基氧化成酵基，将所得物 超滤洗涂，提取氧化的抗体。
[0020] (2)将0. 1?lOOmg/mL的Str巧-tag多肤与步骤（1)得到的氧化的抗体按照摩尔 比1?50:1 (多肤：抗体）混合，赔育0. 5?8小时后，Str巧-tag多肤上的氨基与抗体的 酵基形成醜胺键，将所得物超滤洗涂，提取Strep-tag多肤标记的抗体。
[002。 （3)将0. 1?lOOmg/mL步骤（2)得到的Strep-tag多肤标记的抗体与浓度为0. 1? 200mg/mL的商品化负载有Strep-化ctin的磁珠按照体积比1:0. 1?50混合并赔育0. 5? 8小时后，将所得物充分洗涂分离，提取Strep-tag多肤标记的抗体衍生化磁珠。
[0022] (4)将Strep-tag多肤标记的抗体衍生化磁珠与细胞混合，赔育5?45min后分 离，提取特异性捕获细胞的磁珠。
[0023] (5)将特异性捕获细胞的磁珠与生物素或其衍生物巧日脱硫生物素代替）混合后， 赔育5?45min，提取释放后的细胞进行后续分析。
[0024] 本发明具有如下优点和效果： 本发明制备的多肤标记的生物分子衍生化基质具有优异的生物祀向性。将生物素与多 肤标记的生物分子衍生化基质赔育，可切断生物祀向分子与基质的连接，从而生物祀向分 子与基质剥离，实现对待测物的可逆捕获和释放。本发明操作制备及使用过程简单、快速， 并且重复性好，在一般化学及生物化学实验室均能完成。本发明捕获及释放后对细胞损伤 较小，可W用于祀细胞的可逆捕获、释放和再培养，为临床诊断和个性化治疗提供有利的工 具，可广泛用于肿瘤标志物检测、细胞捕获和释放等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[00巧]图1是实施例1制备的多肤标记二抗衍生化的树脂球的英光显微图。其中，a图为 多肤标记二抗衍生化的树脂球与FITC标记的兔抗山羊IgG反应后，树脂球显示的FITC英 光；b图为多肤标记抗体衍生化的树脂球与FITC标记的兔抗山羊IgG反应后，再经脱硫生 物素处理，树脂球上的英光强度大大减弱，表明多肤标记的二抗从树脂球上脱离。
[0026] 图2是实施例2制备的多肤标记二抗衍生化的磁珠的英光显微图。其中，a图为 多肤标记二抗衍生化的磁珠与FITC标记的兔抗山羊IgG反应后显示的FITC英光；b图为 多肤标记二抗衍生化的磁珠与FITC标记的兔抗山羊IgG反应后，再经脱硫生物素处理，磁 珠上的英光强度明显减弱，表明多肤标记的二抗可W从磁珠上脱离。
[0027] 图3是实施例3制备的多肤标记一抗衍生化的磁珠捕获和释放肿瘤细胞A431的 结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0029] 实施例1 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P册.4的PBS中，与20mM高楓酸轴 溶液按照1:1 (v/v)混合，室温条件下避光赔育比，用ImL 0. 1M P册.4的PBS超滤洗涂除 去多余的高楓酸轴并分散于ImL 0. 1M P册.4的PBS中获得氧化的二抗。
[0030] (2)将浓度为0. 3mg/mL的Strep-tag II多肤与氧化的二抗（200 y L，Img/血）按 照摩尔比20:1 (多肤：抗体）混合，室温条件下赔育30min后，超滤洗涂3次除去多余的多 肤并分散于200 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多肤标记的二抗。
[00引](3)取浓度为5mg/血的商品化负载有5化69-化(3*111的树脂球100 y L与100 y L Str巧-tag多肤标记的二抗（Img/mL)混合，室温赔育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多肤标记的二抗衍生化的树脂球。将获得的多肤标记的二抗衍生 化的树脂球与3 y L FITC标记的兔抗山羊IgG混合并在室温条件下避光赔育30min，洗涂3 次后分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中，英光显微镜下成像，其结果如图la所示；多肤标 记的二抗衍生化树脂球可W被FITC标记的兔抗山羊IgG识别并显示FITC的英光，说明二 抗成功固定于树脂球表面。
[003引 （4)将多肤标记的二抗衍生化的树脂球（100 y L，5mg/血）与FITC标记的兔抗山羊 IgG反应，洗涂除去多余的FITC标记的兔抗山羊IgG后分散于1血lOmM的脱硫生物素中， 室温条件下赔育30min，破坏抗体与树脂球的连接，实现对抗体的释放。其英光显微镜照片 如图化所示，经脱硫生物素处理后树脂球的英光强度大大减弱，表明多肤标记的二抗衍生 化的树脂球可W进行可逆组装和分解。
[003引 实施例2 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P册.4的PBS中，与20mM高楓酸轴 溶液按照1:1 (v/v)混合，室温条件下避光赔育比，用ImL 0. 1M P册.4的PBS超滤洗涂除 去多余的高楓酸轴并分散于ImL 0. 1M P册.4的PBS中获得氧化的二抗。
[0034] (2)将浓度为 0. 3mg/mL 的 Strep-tag II 多肤与氧化的二抗（200 y L，Img/mL)按照 摩尔比3:1混合，室温赔育30min后，超滤洗涂3次除去多余的多肤并分散于200 uL 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多肤标记的二抗。
[00对 （3)取浓度为50mg/血的商品化负载有的磁珠10 y L经100 y L buffer W (lOOmM Tris/肥 1 pH 8. 0，150mM 化Cl，lmM 邸TA)洗涂 2 后分散于 200yL 多肤 标记的二抗中，室温赔育30min后，洗涂3次并分散于lOOuL 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多 肤标记的二抗衍生化的磁珠。将获得的多肤标记的二抗衍生化的磁珠与3y L FITC标记的 兔抗山羊IgG混合并在室温条件下赔育30min，洗涂3次后分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的 PBS中，英光显微镜下成像，其结果如图2a所示；多肤标记的二抗衍生化的磁珠可W被FITC 标记的兔抗山羊IgG识别并显示FITC的英光，说明抗体成功固定于磁珠表面。
[0036] (4)将多肤标记的二抗衍生化的磁珠与FITC标记的兔抗山羊IgG反应，洗涂除去 多余的FITC标记的兔抗山羊IgG后分散于2mM的生物素中，赔育30min，破坏抗体与磁珠的 连接，释放抗体。其英光显微镜照片如图化所示，经生物素处理后英光强度明显减弱，表明 多肤标记的二抗衍生化的磁珠可W进行可逆组装和分解。
[0037] 实施例3 (1)取Img羊抗小鼠IgG (二抗）分散于1血0. 1M P册.4的PBS中，与20mM高楓酸轴 溶液按照1:1 (v/v)混合，室温条件下避光赔育比，用ImL 0. 1M P册.4的PBS超滤洗涂除 去多余的高楓酸轴并分散于ImL 0. 1M P册.4的PBS中获得氧化的二抗。
[0038] (2)将浓度为 0. 3mg/mL 的 Strep-tag II 多肤与氧化的二抗（200 y L，Img/mL)按照 摩尔比3:1混合，室温赔育30min后，超滤洗涂3次除去多余的多肤并分散于200 uL 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多肤标记的抗体。
[0039] (3)取浓度为 50mg/mL 负载有 Str巧-Tactin 的磁珠 10 y L 经 100 y L buffer W (lOOmM Tris/肥1 pH 8. 0，150mM NaCl，lmM EDTA)洗涂2后分散于200yL多肤标记的抗体 中，赔育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中获得多肤标记的二抗衍 生化的磁珠。
[0040] (4)将多肤标记的二抗衍生化的磁珠与10 y g鼠抗人化CAM抗体(一抗）混合，赔 育30min后，洗涂3次并分散于100 y L 0. 1M pH7. 2的PBS中，得到连接有多肤标记的一抗 衍生化的磁珠。
[00川 （5)取lX105个人皮肤癌A431细胞(表达化CAM抗原)分散于400ilLlXPBS中， 之后加入100 y L Img/mL上述（4)中多肤标记的一抗衍生化的磁珠。室温下赔育30min后， 经磁力架吸引Imin，除去未捕获的细胞，将捕获的细胞进行计数并统计捕获效率。
[0042] (5)将特异性捕获细胞的磁珠分散于400 y L 2mM的生物素，室温下赔育30min，经 磁力架吸引除去磁珠，得到被释放的细胞，进行计数获得释放效率。结果如图3所示，多肤 标记的一抗衍生化的磁珠用于A431细胞的捕获可获得86%的捕获效率，加入生物素后70% 的细胞被释放。W上结果说明本发明的多肤标记的一抗衍生化的磁珠可进行可逆组装和分 解，因而能用于细胞的捕获和释放。
[0043] 上述实施例表明本发明方法制备得到的多肤标记的生物分子衍生化基质具有较 好的祀向识别功能，可应用于生物医学研究领域。
[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：通过将Strep-tag多肽标记的生物分子固定于负载有Strep-Tactin蛋白的基质上得到。
2. 根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基 质，其特征在于： 所述的Strep-tag多肽包括Strep-tag I、Strep_tag II及其相关的衍生物和类似物； 所述的生物分子为对细胞、蛋白、核酸、生物小分子进行特异性识别和捕获的蛋白或核 酸，包括抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体。
3. 根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化 基质，其特征在于：所述的Strep-tag多肽标记的生物分子为偶联Strep-tag多肽的生物分 子。
4. 根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基 质，其特征在于： 当生物分子为抗体时，Strep-tag多肽标记的抗体通过包含如下步骤的方法制备得到： 通过高碘酸钠或高碘酸钾将抗体Fc端的糖残基氧化成醛基后与Strep-tag多肽上的氨基 反应得到Strep-tag多肽标记的抗体； 当生物分子为除抗体外的生物分子时，所述的Strep-tag多肽标记的生物分子通过包 含如下步骤的方法制备得到：通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟 基琥珀酰亚胺活化链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体的羧基，再与Strep-tag多 肽的氨基反应得到Strep-tag多肽标记的生物分子。
5. 根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化 基质，其特征在于：所述的负载有Strep-Tactin蛋白的基质为商品化负载有Strep-Tactin 的磁珠或商品化含Strep-Tactin的树脂球、孔板，或将Strep-Tactin蛋白修饰于其他基质 上。
6. 根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基 质，其特征在于：所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质中 的生物分子为链酶亲和素时，将另外一种生物分子生物素化后通过与链酶亲和素的作用固 定在负载有Strep-Tactin蛋白的基质上。
7. 权利要求1-6任一项所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生 化基质在细胞的捕获及释放中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：当生物分子为抗体，在制备多肽标记的 抗体衍生化基质用于细胞的捕获和释放时，通过以下两种方式：1)先将二抗通过高碘酸 钠或高碘酸钾氧化，然后与Strep-tag多肽连接获得多肽标记的二抗，再通过二抗与一抗 的作用固定用于细胞识别的一抗；2)直接将一抗通过高碘酸钠或高碘酸钾氧化，然后与 Strep-tag多肽连接获得多肽标记的一抗，用于细胞的捕获。
9. 权利要求1-6任一项所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生 化基质用于细胞的捕获及释放的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质与细胞混合，孵育后分离，提取特异 性捕获细胞的基质； (2) 将特异性捕获细胞的基质与生物素或其衍生物混合，孵育后分离，提取释放后的细 胞进行后续分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的strep-tag多肽标记的生物分子 为Strep-tag多肽标记的抗体时，包括如下步骤： (1) 将5?1000 ii g/mL的抗体与20mM高碘酸钠或高碘酸钾按照体积比1:1混合，孵育 0. 5?2小时后，将所得物超滤洗涤，提取氧化的抗体； (2) 将0? 1?100mg/mL的Strep-tag多肽与步骤（1)得到的氧化的抗体按照摩尔比 1?50:1混合，孵育0. 5?8小时后，将所得物超滤洗涤，提取Str印-tag多肽标记的抗体； (3) 将0? 1?100mg/mL步骤（2)得到的Strep-tag多肽标记的抗体与浓度为0? 1? 200mg/mL的商品化负载有Strep-Tactin的磁珠按照体积比1:0. 1?50混合并孵育0. 5? 8小时后，将所得物洗涤分离，提取Strep-tag多肽标记的抗体衍生化磁珠； (4) 将Str印-tag多肽标记的抗体衍生化磁珠与细胞混合，孵育5?45min后分离，提 取特异性捕获细胞的磁珠； (5) 将特异性捕获细胞的磁珠与生物素或其衍生物混合后，孵育5?45min，提取释放 后的细胞进行后续分析。
【文档编号】C12N5/00GK104437411SQ201410776505
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】黄卫华, 陆宁宁, 谢敏, 程世博 申请人:武汉大学