一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，特别是一种利用SSR分子标记快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法。其利用SSR引物QYXG3或QYXG7对西瓜杂交品种荃抗绿霸及其父母本的基因组DNA进行扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对荃抗绿霸样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。本发明的检测方法在5 h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有简单易行、准确快速、费用低、便于推广等特点。适用于对荃抗绿霸西瓜杂交种及其亲本真实性和品种纯度的检验。
【专利说明】一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于种子质量检验【技术领域】，涉及杂交西瓜种子纯度检验的方法，特别是 一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法。
【背景技术】
[0002] 荃抗绿霸是由安徽荃银高科种业股份有限公司培育的高产优质杂交西瓜新品种 (晋审西瓜2011006、甘认瓜2011005、皖品鉴登字第1001007)，具有优秀的田间农艺性状。 该品种在杂交制种过程中，母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄 不彻底或漏去雄，都将会极大地影响制种纯度。因此鉴定杂交西瓜种子纯度至关重要。
[0003] 传统的西瓜杂交种子纯度鉴定工作仍然以田间种植鉴定为主，通过成株外观形状 比较鉴定，该方法鉴定一般需要1至2个月，时间长、费用高、难度大且准确性差，需要鉴定 人员具有丰富的经验，因此田间表型鉴定越来越不适宜现代农业的发展需要。室内纯度检 验通常采用DNA鉴定技术，这是一种直接在DNA水平上进行基因组差异分析的技术，不受环 境和人为因素影响；其中SSR技术是以PCR为基础发展起来的，具有信息含量高、准确率高、 稳定性好、易于分析等特点，是西瓜杂种纯度鉴定的理想技术。高质量西瓜基因组序列图谱 的完成为西瓜分子育种提供了基础条件，同时DNA快速提取法，具有快速、简便、可操作性 强、实用性强的特点，非常适合西瓜杂交种品种纯度的鉴定。本研宄利用荃抗绿霸与双亲在 一些SSR位点上的差异，寻找合适的引物，用于西瓜杂交种室内纯度检测，为荃抗绿霸纯度 鉴定提供一个准确、稳定、快捷、实用的检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能够对杂交西瓜荃抗绿霸种子纯度进行准确、稳定、 简单快捷、省时省力的检测方法。
[0005] 一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006] 1)提取西瓜杂交品种垄抗绿霸样品基因组DNA ;
[0007] 2)以西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组的DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR 扩增；
[0008] 所述的SSR引物序列为：
[0009] QYXG3F : 5 ' -CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3 '，
[0010] QYXG3R :5, -AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3,；
[0011] QYXG7F : 5 ' -CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3 '，
[0012] QYXG7R :5, -GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3,；
[0013] 3)将步骤2)的扩增产物经8 %的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220V 稳压电泳直至溴酚蓝指示剂迀移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电 泳；银染法染色，拍照记录待测西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA的特征谱带；
[0014] 4)提取西瓜杂交品种荃抗绿霸父母本样品的基因组DNA，然后重复上述步骤 2)-3)的方法，获得父母本样品DNA的特征谱带；
[0015] 5)以父母本样品DNA的特征谱带作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才 为真正的"荃抗绿霸"杂交种，缺少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种；再采用下式 计算受检样品的种子纯度：
[0016] 受检样品的种子纯度（％) =(供检样品株数一非杂交种株数）/供检样品株 数 XlOOo
[0017] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1)是 采用快速提取法提取待测样品DNA。
[0018] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1)具 体方法为：剪取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品种子发芽3-4天后Icm左右的幼芽，装入2ml离 心管，加入0. 4M的NaOH溶液，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴Imin左右后加入pH 8. 0 的Tris-HCl缓冲液，充分混匀，得西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA提取液即为待测西瓜杂 交品种荃抗绿霸基因组DNA，4°C下保存备用。
[0019] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：
[0020] 步骤2)包括以下步骤：在PCR反应板内加入西瓜杂交品种垄抗绿霸样品基因组 DNA、含Mg2+的buffer、dNTPs、SSR引物、Taq酶和CldH2O ;先进行94°C下的预变性5min ;接 着以94°C下变性30sec、55°C退火30sec、72°C下延伸30sec为一个循环，进行35个循环反 应；最后在72°C下延伸5min，反应完成后，加入Loading buffer终止反应，得西瓜杂交品种 荃抗绿霸的扩增产物，4°C下保存备用。
[0021] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤2) 中，所述的西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA浓度为10-50ng/ μ 1、含Mg2+的buffer为 含Mg2+的10 X buffer、dNTPs浓度为2. 5mM、SSR引物浓度为2 μ M、Taq酶浓度为5U/μ 1 ; 所述的10_50ng/ μ 1西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg2+的10Xbuffer、2. 5mM dNTPs、2yM SSR 引物、5U/yl Taq 酶和 ddH20 的体积比为：2 : 1.5 : I : 2 : 0.2 : 3.3。
[0022] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1) 中，NaOH溶液与Tris-HCl溶液的体积比为1: 1。
[0023] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤3) 中，所述浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液由20ml ddH20、4ml 10XTBE、16ml20%Acr-Bis、 40μlTEMED、400 μll0%AP配制而成。
[0024] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤3)包 括以下步骤：
[0025] (1)装板封胶：握住平玻璃板的两侧边缘将其插到橡胶模框的下槽内，以同样的 方式将粘有玻璃隔条的玻璃板插到相应的槽内，两块玻璃板间便形成胶室；胶室底部用 5ml 1 %琼脂封底，将封好的玻璃板装配到电泳槽中，拧紧后待用；
[0026] (2)制胶：配置40ml浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液，倒入上述专用垂直电泳槽玻璃 板胶室内，插好梳子；
[0027] (3)点样：待聚丙烯酰胺溶液完全凝固后，拔除梳子，向电泳槽内倒入0. 5XTBE电 泳缓冲液，使液面高出凝胶Icm左右；将步骤2)中的PCR扩增产物对应点入聚丙烯酰胺凝 胶的点样孔内；
[0028] (4)电泳：设定电压220V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂 迀移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；
[0029] (5)银染显色：将胶片拆下放入1%。的AgNCV^液中，在摇床上匀速银染12min，倒 去染色液，CldH 2O清洗两次去除残液，加入显色液，直到出现清晰条带为止。
[0030] 本发明的有益效果是：本发明的快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法与常 规的田间种植鉴定方法对比，其优点表现在：
[0031] 1)提供特定的SSR引物来检测杂交西瓜荃抗绿霸种子纯度，
[0032] QYXG3F : 5 ' -CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3 '，
[0033] QYXG3R :5' -AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3' ；
[0034] QYXG7F : 5 ' -CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3 '，
[0035] QYXG7R : 5，-GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3，。
[0036] 2)精准性：该发明是以SSR技术为基础，具有很高的准确性，其检测的纯度经与田 间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。
[0037] 3)快速高效：常规的田间种植鉴定法要在结瓜后才能判断种子纯度和真实性，周 期长达1-2个月，本发明只需把荃抗绿霸种子发芽3-4天后，一步法快速提取基因组DNA，用 上述SSR引物进行分子标记检测，5h之内即可完成种子纯度的鉴定工作。
[0038] 4)实用简单：与常规田间种植鉴定法相比，其操作简单，程序化操作，不需特殊理 论基础。
【专利附图】
【附图说明】：
[0039] 图1是利用引物QYXG3扩增的荃抗绿霸及其父母本的特性谱带；
[0040] 图2是利用引物QYXG7扩增的荃抗绿霸及其父母本的特性谱带；
[0041] 图1和2中早表示母本，?表示父本，1-22表示Fl。
【具体实施方式】
[0042] 为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面通过基于PCR技术的SSR标记分析实 施例进一步说明本发明。
[0043] 实施例一
[0044] 不同纯度的荃抗绿霸（杂种Fl)样品3个，（样品1、样品2和样品3的纯度分别 为99. 5%、97. 3%和90% )，所有种子均由安徽荃银高科种业股份有限公司提供。
[0045] 1)样品DNA的快速提取：分别剪取3个样品种子发芽3-4天后Icm左右的幼芽， 装入2ml离心管，同时向离心管中放入2颗小钢珠，加入100 μ 1，0. 4Μ的NaOH溶液，用组织 捣碎仪打碎样品，沸水中煮Imin后加入100 μ 1，IOOmM Tris-HCl (PH 8. 0)缓冲液，充分混 匀，4°C下保存备用。
[0046] 2) PCR 扩增
[0047] ①反应体系
[0048] 反应体系由样品基因组DNA、含Mg2+的buffer、dNTPs、引物、Taq酶和CldH 2O构成。 其体积比为：2 :1. 5 :1 :2 :0. 2 :3. 3。
[0049] 在配置PCR反应混合液过程中，始终保持在冰上进行。在最后一步加入Taq酶后， 迅速混匀，快速分装到96孔PCR板内，盖上专用封口盖，在PCR仪上进行扩增反应。
[0050] ②反应条件
[0051] 先进行94°C下的预变性5min ;接着以94°C下变性30sec、55°C退火30sec、72°C下 延伸3〇sec为一个循环，进行35个循环反应；最后在72°C下延伸5min ;反应完成后，加入 Loading buffer终止反应，4°C下保存备用。
[0052] ③筛选纯度鉴定的引物
[0053] 从所用的引物中筛选出能够在杂种一代中同时产生父、母本特异标记条带，且带 型清晰、重复性好、可靠性强的2对引物，分别是QYXG3和QYXG7,作为西瓜杂交种荃抗绿霸 种子真实性和/或品种纯度鉴定的特征引物（附图1、2)。两对SSR引物序列分别为
[0054] QYXG3F : 5 ' -CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3 '，
[0055] QYXG3R :5' -AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3' ；
[0056] QYXG7F : 5 ' -CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3 '，
[0057] QYXG7R : 5，-GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3，。
[0058] 其中SSR引物代号QYXG3其含义是："QYXG"代表荃银西瓜；"3"代表本实验室西 瓜SSR引物编号。
[0059] 3)聚丙烯酰胺凝胶电泳：
[0060] 装板封胶：握住平玻璃板的两侧边缘将其插到橡胶模框的下槽内，以同样的方式 将粘有玻璃隔条的玻璃板插到相应的槽内，两块玻璃板间便形成胶室。胶室底部用5ml 1 % 琼脂封底，将封好的玻璃板装配到电泳槽中，拧紧后待用。
[0061] 制胶：配置40ml浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液，倒入上述专用垂直电泳槽玻璃板 胶室内，插好梳子；
[0062] 点样：待聚丙烯酰胺溶液完全凝固后，拔除梳子，向电泳槽内倒入0. 5XTBE电泳 缓冲液，使液面高出凝胶Icm左右；将步骤2)中的PCR扩增产物对应点入聚丙烯酰胺凝胶 的点样孔内；
[0063] 电泳：设定电压220V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂迀 移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；
[0064] 银染显色：将胶片拆下放入1%。的AgNCV^液中，在摇床上匀速银染12min，倒去染 色液，CldH 2O清洗两次去除残液，加入显色液，直到出现清晰条带为止。
[0065] 4)拍照记录样品DNA的特征谱带；
[0066] 5)用上述方法获取西瓜杂交品种荃抗绿霸及其父母本DNA的特征谱带，以杂交种 的父母本作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才为真正的"荃抗绿霸"杂交种，缺 少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种，采用下式计算受检样品的种子纯度：
[0067] 受检样品的种子纯度（％) =(供检样品株数一非杂交种株数）/供检样品株 数 XlOOo
[0068] 通过计算，三批样品1、2、3所检验纯度分别为99. 5%、97. 3%和90%，与已知结果 完全一致。
[0069] 实施例二
[0070] 本发明利用引物QYXG3和QYXG7分别检验2014年杂交西瓜品种荃抗绿霸样品48 个，对其进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过受检种子纯度计算，对荃抗绿霸进 行检测。
[0071] 所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，包括以下步骤：
[0072] 1)剪取西瓜杂交品种荃抗绿霸种子发芽3-4天后Icm左右的幼芽，装入2ml离心 管，加入0. 4M的NaOH溶液，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴Imin左右后加入pH 8. 0的 Tris-HCl缓冲液，充分混匀，所得西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA提取液即为待测西瓜杂 交品种荃抗绿霸基因组DNA，4°C下保存备用；
[0073] NaOH溶液与Tris-HCl溶液的体积比为1:1。
[0074] 2)在PCR反应板内加入西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg2+的buffer、 dNTPs、SSR引物、Taq酶和CldH2O ;先进行94°C下的预变性5min ;接着以94°C下变性30sec、 55°C退火30sec、72°C下延伸30sec为一个循环，进行35个循环反应；最后在72°C下延伸 5min，反应完成后，加入Loading buffer终止反应，得西瓜杂交品种荃抗绿霸的扩增产物 4°C下保存备用；
[0075] 两对SSR引物序列分别为
[0076] QYXG3F : 5 ' -CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3 '，
[0077] QYXG3R :5, -AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3,；
[0078] QYXG7F : 5 ' -CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3 '，
[0079] QYXG7R : 5，-GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3，。
[0080] 所述的西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA浓度为10-50ng/ μ 1、含Mg2+ 的 buffer 为含 Mg2+的 10 X buffer、dNTPs 浓度为 2. 5mM、SSR 引物浓度为 2 μ M、Taq 酶 浓度为5U/yl ;所述的lOIOng/yl西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg2+ 的 10Xbuffer、2.5mM dNTPs、2yM SSR 引物、5U/yl Taq 酶和 CldH2O 的体积比为： 2 : I. 5 : 1 : 2 : 0· 2 : 3. 3〇
[0081] 3)包括以下步骤：
[0082] Α、装板封胶：握住平玻璃板的两侧边缘将其插到橡胶模框的下槽内，以同样的方 式将粘有玻璃隔条的玻璃板插到相应的槽内，两块玻璃板间便形成胶室；胶室底部用5ml 1 %琼脂封底，将封好的玻璃板装配到电泳槽中，拧紧后待用；
[0083] B、制胶：配置40ml浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液，倒入上述专用垂直电泳槽玻璃 板胶室内，插好梳子；
[0084] C、点样：待聚丙烯酰胺溶液完全凝固后，拔除梳子，向电泳槽内倒入0.5XTBE电 泳缓冲液，使液面高出凝胶Icm左右；将步骤2)中的西瓜杂交品种荃抗绿霸的扩增产物对 应点入聚丙烯酰胺凝胶的点样孔内；
[0085] D、电泳：设定电压220V，将电泳槽与电泳仪的电极连接通电，直至溴酚蓝指示剂 迀移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；
[0086] E、银染显色：将胶片拆下放入1%。的AgNCV^液中，在摇床上匀速银染12min，倒去 染色液，CldH2O清洗两次去除残液，加入显色液，直到出现清晰条带为止。
[0087] 所述浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液由20mlddH20、4mll0XTBE、16ml20% Acr-Bis、40μlTEMED、400 μll0%AP配制而成。
[0088] 4)拍照记录样品DNA的特征谱带，用上述方法获取西瓜杂交品种荃抗绿霸DNA的 特征谱带；
[0089] 5)提取西瓜杂交品种荃抗绿霸父母本样品的基因组DNA，然后重复上述步骤 2)-4)的方法，获得父母本样品DNA的特征谱带；
[0090] 6)以父母本样品DNA的特征谱带作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才 为真正的"荃抗绿霸"杂交种，缺少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种；再采用下式 计算受检样品的种子纯度：
[0091] 受检样品的种子纯度（％) =(供检样品株数一非杂交种株数）/供检样品株 数 XlOOo
[0092] 其中利用引物QYXG3进行纯度检验的结果与利用引物QYXG7进行检验的结果完全 一致。分子标记检测的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致（见 附表1):
[0093] 附表1 :荃抗绿霸SSR标记快速检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表
[0094]
【权利要求】
1. 一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA ; 2) 以西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组的DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR扩增； 所述的SSR引物序列为： QYXG3F :5' -CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3'， QYXG3R ：5, -AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3,； QYXG7F :5' -CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3'， QYXG7R:5' -GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3' ； 3) 将步骤2)的扩增产物经8%的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220 V稳压 电泳直至溴酚蓝指示剂迀移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳； 银染法染色，拍照记录待测西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA的特征谱带； 4) 提取西瓜杂交品种荃抗绿霸父母本样品的基因组DNA，然后重复上述步骤2)-3)的 方法，获得父母本样品DNA的特征谱带； 5) 以父母本样品DNA的特征谱带作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才为真 正的"荃抗绿霸"杂交种，缺少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种；再采用下式计算 受检样品的种子纯度： 受检样品的种子纯度（％)=(供检样品株数一非杂交种株数）/供检样品株数X 100。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在 于：步骤1)是采用快速提取法提取待测样品DNA。
3. 根据权利要求2所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在 于：步骤1)具体方法为：剪取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品种子发芽3-4天后1 cm左右的幼 芽，装入2 ml离心管，加入0. 4 M的NaOH溶液，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1 min左 右后加入pH 8. 0的Tris-HCl缓冲液，充分混匀，得西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA提取液 即为待测西瓜杂交品种荃抗绿霸基因组DNA，4°C下保存备用。
4. 根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在 于： 步骤2)包括以下步骤：在PCR反应板内加入西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、 含Mg2+的buffer、dNTPs、SSR引物、Taq酶和ddH20 ;先进行94°C下的预变性5 min ;接着以 94°C下变性30 sec、55°C退火30 sec、72°C下延伸30 sec为一个循环，进行35个循环反应； 最后在72°C下延伸5 min，反应完成后，加入Loading buffer终止反应，得西瓜杂交品种荃 抗绿霸的扩增产物，4°C下保存备用。
5. 根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征 在于：步骤2)中，所述的西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA浓度为10-50 ng/y 1、 含 Mg2+的 buf f er 为含 Mg 2+的 10 X buf f er、dNTPs 浓度为 2. 5 mM、SSR 引物浓度为 2 y M、 Taq酶浓度为5 U/ y 1 ;所述的10-50 ng/ y 1西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含 Mg2+的 10Xbuffer、2.5 mM dNTPs、2 yM SSR 引物、5 U/yl Taq 酶和 ddH20 的体积比为： 2 : 1. 5 : 1 : 2 : 0? 2 : 3. 3〇
6. 根据权利要求3所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在 于：步骤1)中，NaOH溶液与Tris-HCl溶液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在 于：步骤3)中，所述浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液由20 ml ddH20、4 ml 10XTBE、16 ml 20% Acr-Bis、40 yl TEMED、400 yl 10%AP 配制而成。
【文档编号】C12Q1/68GK104480208SQ201410788486
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】王慧, 张从合, 陈金节, 严志, 周桂香, 黄艳玲, 钱奕道, 杨坤, 方玉, 王林 申请人:安徽荃银高科种业股份有限公司, 安徽荃银高科瓜菜种子有限公司