一种克罗诺杆菌的杀菌方法及应用与流程

文档序号：12306963阅读：2338来源：国知局

本发明涉及一种克罗诺杆菌的杀菌方法及应用，属于食品安全技术领域。

背景技术：

克罗诺杆菌(Cronobacter)原名阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，为革兰氏阴性菌，是一种有鞭毛，无芽孢，能运动，兼性厌氧的短杆菌。该菌在6～45℃范围内均能生长，在37～43℃下生长良好。少数菌株能在高于47℃或低于0℃条件下缓慢生长。克罗诺杆菌对营养要求不高，能在多种培养基上生长，其中包括营养琼脂、伊红美蓝(eosin methylene blue，EMB)琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和脱氧胆酸琼脂等。所有克罗诺杆菌均能在TSA上在36℃快速生长，培养24h后可形成直径为1～1.5mm的菌落，培养48h后形成直径为2～3mm的菌落并生成黄色素。克罗诺杆菌普遍具有耐酸不耐碱的特性。

目前，我国已将克罗诺杆菌列入食源性致病菌的检测范围内，该菌能分离自广泛的食品材料(包括肉、奶酪、蔬菜、谷物、药草、调料和婴幼儿配方粉等)、环境(包括工厂和家庭)、以及昆虫。在2010-2011年各地疾控中心的检测报告显示，广西梧州市的175份食品样品中阪崎克罗诺杆菌的检出率为5.26％，江苏宿迁的891份样品中该菌的检出率为2.6％，湖南长沙的286份食品样品中该菌的检出率达6.3％。这些数据表明克罗诺杆菌在我国食品中污染的程度及其范围的广泛。

研究表明，克罗诺杆菌的污染来源主要有三种途径：一是来自医院临床，1980年Farmer等人在患者的体液及分泌物中分离到的阪崎克罗诺杆菌，7个月后在此医院的29例病人的呼吸道中被发现；二是婴儿配方奶粉，虽然克罗诺杆菌在环境中有很多栖身之地，但与人类患病直接相关的主要是婴儿配方奶粉。Lversen等检测了婴儿配方奶粉及402份其他食品材料中的阪崎克罗诺杆菌和其他肠杆菌科细菌，结果发现阪崎克罗诺杆菌在配方食品、干婴儿食品奶粉和干酪食品中的检出率分别为：2.4％、10.2％、4.1％、3.3％，而其他肠杆菌科细菌和沙门氏菌均未检出；三是自然环境，克罗诺杆菌广泛分布于环境中，Sakazak等人早在1974年便从土壤、下水道、植物根茎、动物排泄物中分离出阪崎克罗诺杆菌。因此要预防该菌的污染，不仅要对加工过程严密监控，还要对生产环境进行严格灭菌消毒。

克罗诺杆菌是婴儿配方乳粉(powdered infant formula，PIF)中的A类致病菌，能够通过污染PIF造成新生儿感染，导致严重的菌血症、坏死性小肠结肠炎和脑膜炎等疾病，致死率高达40％—80％。中国是PIF的生产和消费大国，一直面临着克罗诺杆菌污染这一困扰PIF产业发展的难题。

婴儿配方奶粉(PIF)作为克罗诺杆菌的主要污染来源和传播途径，它的污染途径主要有两条，一是在PIF的生产、干燥和包装过程中，由于原辅料的添加所造成的污染。二是由于加工环境的污染，即操作不当或使用了受污染的仪器设备，或是在奶粉冲调过程中造成的污染。克罗诺杆菌具有很强的环境耐受性，使其能够在PIF的加工厂的环境和产品中持续存在。

虽然PIF是克罗诺杆菌的主要污染源和污染渠道，但只要在其生产加工及食用环节处理得当，仍然可以放心食用。研究表明，对PIF进行高温或低温处理可降低克罗诺杆菌的存活。另外，食品添加剂的添加可降低菌株对温度的耐受性，同时起到杀菌的作用。对生产仪器设备，尤其对易形成生物膜的各个管路内壁，要进行及时有效的清洗和消毒，降低该菌存活的风险。奶粉在冲调过程中，要提前对冲调餐具进行清洗和消毒，冲调水的温度要高于80℃，剩余的冲调好的奶粉尽量不要再次食用，避免克罗诺杆菌的二次污染。为了使克罗诺杆菌的污染降到最低，还必须对加工的原辅料和生产环境进行持续的监测。为了彻底有效的对克罗诺杆菌进行预防和控制，现有技术中急需一种有效抑制克罗诺杆菌的方法。

近年来，天然提取物以其天然性、便利性和容易获得的优点吸引着研究人员关注，其中天然提取物的抑菌作用也备受关注。因此，采用天然提取物预防和控制克罗诺杆菌的污染将成为未来的发展趋势。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种克罗诺杆菌的杀菌方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种克罗诺杆菌的杀菌方法，该方法是以茶多酚为有效活性成分消灭克罗诺杆菌。

所述方法，以下任意一种方式进行处理：

方式一：将茶多酚溶解于生理盐水或水中，利用茶多酚溶液处理克罗诺杆菌污染物，消灭克罗诺杆菌；

方式二：将茶多酚与其他杀菌或抑菌成分混匀溶解于生理盐水或水中，获得混合溶液，利用混合溶液处理克罗诺杆菌污染物，消灭克罗诺杆菌；

方式三：将茶多酚溶解于基质溶液中，调节pH值，消灭克罗诺杆菌；

方式四：将茶多酚和其他杀菌或抑菌成分溶解于基质溶液中，调节pH值，消灭克罗诺杆菌。

优选地，方式一所述茶多酚，质量浓度为0.3％～3％。

优选地，方式二所述茶多酚，质量浓度为0.3％～3％。

优选地，方式三所述茶多酚，质量浓度为0.3％～3％；所述pH值，为3-5。

优选地，方式三所述基质溶液，为酸性食品。

更优选地，所述酸性食品，为酸性饮料、酸性乳饮料或酸奶。

优选地，所述其他杀菌或抑菌成分，是维生素C、苹果酸、柠檬酸中的一种或几种。

更优选地，所述方法，以下任意一种具体方式进行处理：

方式一：将茶多酚溶解于生理盐水或水中，配制成质量浓度为0.3％～3％的茶多酚溶液，利用茶多酚溶液处理克罗诺杆菌污染物，处理时间不少于1h，消灭克罗诺杆菌；

方式二：将茶多酚与其他杀菌或抑菌成分混匀溶解于生理盐水或水中，获得混合溶液，利用混合溶液处理克罗诺杆菌污染物，处理时间不少于1h，消灭克罗诺杆菌；所述茶多酚质量浓度为0.3％～3％；所述其他杀菌或抑菌成分，是维生素C、苹果酸、柠檬酸中的一种或几种；

方式三：将茶多酚溶解于基质溶液中，调节pH值至3-5，处理时间不少于7h，消灭克罗诺杆菌；

方式四：将茶多酚和其他杀菌或抑菌成分溶解于基质溶液中，调节pH值至3-5，处理时间不少于7h，消灭克罗诺杆菌；所述茶多酚质量浓度为0.3％～3％。

以上所述任一方法在预防、控制和消除食品或食品加工过程中克罗诺杆菌污染及在处理克罗诺杆菌污染物或污染环境中的应用。

本发明有益效果：

1)本发明首次发现了酸化的茶多酚对克罗诺杆菌具有很好的杀菌作用，为使用天然提取物防治克罗诺杆菌提供了新思路，为研发新型食品添加剂防止婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的污染提供了理论基础。同时，对建立新的清洁模式和评估方法、改善现有的操作规范，以及更好的控制和消除克罗诺杆菌的污染，指导乳制品的生产和保障乳制品的安全都具有重要意义。

2)本发明初步探究了茶多酚对克罗诺杆菌的杀菌机理，发现茶多酚会破坏细菌细胞结构，对克罗杆菌有不可逆的杀菌作用，具有非常好的杀菌效果，避免了克罗诺杆菌的复活及再次污染。同时茶多酚为天然提取物，利用茶多酚杀菌无危害。

3)利用本发明方法可以用于控制和消除食品或食品加工过程中克罗诺杆菌的污染，尤其适用于控制和消除婴幼儿配方奶粉生产过程中的克罗诺杆菌的污染。利用本发明方法对生产仪器设备及环境，尤其对易形成生物膜的各个管路内壁，能够进行有效的清洗和消毒，降低克罗诺杆菌存活的风险。

4)本发明方法应用范围广泛，方法简单，容易操作，实用性非常强。

附图说明

图1为克罗诺杆菌对不同天然提取物耐受性的实验结果；

(A，克罗诺杆菌ES45；B，克罗诺杆菌ES46；C，克罗诺杆菌ES37；D，克罗诺杆菌ES39)。

图2为克罗诺杆菌对酸化后的不同天然提取物耐受性的实验结果；

(A，克罗诺杆菌ES45；B，克罗诺杆菌ES46；C，克罗诺杆菌ES37；D，克罗诺杆菌ES39)。

图3为4株不同克罗诺杆菌对未酸化和酸化后的茶多酚耐受性差异性的实验结果；

(A，未酸化茶多酚；B，酸化后的茶多酚)。

图4为4株不同克罗诺杆菌在不同基质中生长的电镜图；

(A，LB肉汤；B，含有0.5％茶多酚的生理盐水)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中菌悬液均指克罗诺杆菌的菌悬液，实施例中所选用的样品在处理前均经检测未感染克罗诺杆菌。

以下实施例以分离自PIF及其加工环境中的克罗诺杆菌为研究对象，选取4株主要ST型的克罗诺杆菌的代表菌株，分别为ES37(ST8)、ES39(ST1)、ES45(ST4)、ES46(ST64)。

(1)调整菌液浓度

取2mL在LB液体培养基中活化好的待测菌液放入2mL离心管中，在8000g/min下离心10min，小心吸掉上清液，之后加入1mL0.85％的生理盐水，震荡均匀后再次在8000g/min下离心10min，同样除去上清液，如此反复洗涤两次，最终将菌泥溶于1mL生理盐水中，制成细胞悬液。取1mL菌悬液加入到9mL无菌生理盐水中，震荡后再从此试管中取1mL加入到另一9mL无菌生理盐水中，以此类推进行梯度稀释，并从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，观察每个梯度的菌落生长情况，从而调整初始菌液浓度为8.0LogCFU/mL。

实施例1：

1.茶多酚溶液的杀菌作用

分别将0.3g、0.5g、1g、2g、3g茶多酚溶解于100mL生理盐水中，加入初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液，使其初始浓度为7.0LogCFU/mL，放入37℃恒温培养箱中培养，经过7h后取出，振荡摇匀，经过生理盐水梯度稀释后，从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。以生理盐水、茶多酚相应pH的生理盐水分别为对照组进行试验，结果如下：在加入了茶多酚的生理盐水中，经过7h处理后，均未检测到克罗诺杆菌，但在生理盐水以及茶多酚相应 pH的生理盐水中，克罗诺杆菌都有存活，说明茶多酚具有杀菌作用。

2.不同浓度下茶多酚溶液的杀菌效果比较

分别将0.1g、0.2g、0.3g、0.5g、1g、3g、5g茶多酚溶解于100mL生理盐水中，加入1mL初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液，使其初始浓度为7.0LogCFU/mL，放入37℃恒温培养箱中培养，经过7h后取出，振荡摇匀，经过生理盐水梯度稀释后，从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。以生理盐水为空白对照组。具体结果如表1所示。

表1 不同浓度下茶多酚溶液的杀菌效果比较

注：“+”表示存活，“-”表示死亡

由表3数据可知，茶多酚浓度在0.3％-3％之间的茶多酚溶液杀菌效果最好。

实施例2：克罗诺杆菌对不同天然提取物耐受性的研究

将茶多酚添加至液态奶中，由于液态奶对pH具有一定的缓冲作用，基质溶液中的pH无法达到茶多酚实现杀菌条件下的pH，因此本实施例研究了将茶多酚添加到可以起到缓冲作用的液态奶中进行试验，探索茶多酚在基质溶液中的杀菌条件及效果。

(1)配置溶液

取某品牌的婴儿配方奶粉，按照生产商建议的冲调方式进行冲调，即称取15g奶粉溶于100mL无菌水中，制成奶粉溶液，分装到多个三角瓶中，之后分别称取0.5g苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚加入到100mL奶粉溶液中，震荡均匀，使之充分溶解，并用pH计测定不同处理液的初始pH值。其中，所测得的婴儿配方奶粉的初始pH为6.82，但加入0.5％的苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚后其pH分别降为3.55，3.62，4.55，6.46。把终浓度为0.5％的各天然提取物溶液以及奶粉溶液分装到不同的试管中，每管9mL，以奶粉溶液作为空白对照组，分装待用。

(2)不同天然提取物溶液处理

吸取1mL初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液分别加入到无菌的9mL婴儿配方奶粉和含有0.5％苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚的婴儿配方奶粉中，使其初始浓度为7.0LogCFU/mL。将加入菌液的不同处理液放入37℃恒温培养箱中培养，经过1h、3h、5h、7h后取出，振荡摇匀，经过生理盐水梯度稀释后，从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。

结果与讨论如下：

通过梯度稀释平板计数的方法对4株不同ST型的克罗诺杆菌进行不同天然提取物耐受性的研究，即将各菌液分别放入含有0.5％茶多酚、VC、苹果酸和柠檬酸的婴儿配方奶粉中处理，并检测其pH值，在不同的时间点取出进行平板计数，试验结果如图1所示。从图中可知，所有菌株在pH 6.82的婴儿配方奶粉中均呈现迅速增长的趋势。在含有0.5％茶多酚(pH 6.46)和0.5％VC(pH 4.55)的奶粉中也表现出增长的趋势，在含有0.5％苹果酸(pH 3.55)的奶粉中菌数变化没有太大波动。而只有在含有0.5％柠檬酸(pH 3.62)的奶粉中4株菌株都呈现出下降的趋势，说明柠檬酸具有一定的抑菌作用，VC和苹果酸的抑菌效果并不明显，而茶多酚的的抑菌效果相对较差。此外，由差异性分析可知，各组不同处理中，在不同的时间点，菌体的存活数都存在显著性差异(p<0.05)。对于4株菌总体来说，每种天然提取物的抑菌能力大小为：柠檬酸(pH 3.62)>苹果酸(pH 3.55)>VC(pH 4.55)>茶多酚(pH 6.46)。由于加入各种天然提取物后造成各处理组溶液的pH值各不相同，为了消除不同酸度的影响，有必要统一各个不同处理组的pH值。

本试验研究了4株不同ST型的克罗诺杆菌对不同天然提取物的耐受性，以婴儿配方奶粉为基质，在其中加入了0.5％茶多酚(pH 6.46)、VC(pH 4.55)、苹果酸(pH 3.55)、柠檬酸(pH 3.62)，以未添加任何物质的奶粉溶液(pH 6.82)为空白对照。由试验结果可知，柠檬酸具有一定的抑菌作用，而茶多酚、VC和苹果酸的抑菌效果并不明显。对于四株菌，总体来说，每种天然提取物的抑菌能力大小为：柠檬酸(pH 3.62)>苹果酸(pH 3.55)>VC(pH 4.55)>茶多酚(pH 6.46)。从结果中可以看出，虽然加入0.5％苹果酸后使得溶液的pH降到3.55，比添加了柠檬酸后的pH更低一些，但柠檬酸的作用效果要强于苹果酸。而柠檬酸、苹果酸和VC都属于有机酸类，根据相关报导可知，有机酸的抑菌效果主要取决于其解离形式，只有未解离态的有机酸才有理想的抗菌效果，而浓度很大的解离态有机酸也没有显著的抗菌效果。因为非解离态的有机酸是亲脂性的，可以经过被动扩散的方式进入细胞质，进入细胞质后，由于细胞内pH接近于7，比有机酸的解离度要高，会造成有机酸因解离而使胞内的pH下降，随着细胞内H+浓度增加，细菌要依赖ATP酶将过多的H+泵出细胞，而这一过程是耗能的，会导致细菌衰竭而死。此外，大量的阴离子在胞内积聚，造成细胞内的渗透压发生改变，使细胞中毒，如核酸合成和糖酵解的停止，酶转导紊乱，酶解反应受阻等。

实施例3：不同ST型克罗诺杆菌对酸化后的天然提取物耐受性的研究

(1)配置溶液

取某品牌的婴儿配方奶粉，按照生产商建议的冲调方式进行冲调，即称取15g奶粉溶于100mL无菌水中，制成奶粉溶液，之后分别称取0.5g苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚加入到100mL奶粉溶液中，震荡均匀，使之充分溶解，并用pH计测定不同处理液的初始pH，其中，所测得的婴儿配方奶粉的初始pH为6.82，但加入0.5％的苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚后其pH分别降为3.55，3.62，4.55，6.46。把终浓度为0.5％的各天然提取物溶液分装到不同的试管中，每管9mL，并以奶粉溶液作为空白对照组，分装待用。

(2)不同天然提取物溶液的酸化处理

由于不同处理液的pH有所不同，因此为了排除不同pH对克罗诺杆菌生长的影响，有必要对不同处理液进行酸化处理。用4M的HCl和NaOH调节各溶液的pH，使每组处理液的pH均为3.55，即处理液的最低pH，并以HCl酸化的婴儿配方奶粉组作为对照，最终分别吸取1mL初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液分别加入到酸化处理后，含有0.5％苹果酸、柠檬酸、VC、茶多酚及HCl酸化的婴儿配方奶粉中，以未添加任何物质的婴儿配方奶粉溶液作为空白对照，具体操作步骤同上，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。

实验结果与讨论如下：

将各组不同处理溶液的pH用4M的HCl均统一到3.55后，4株不同ST型的克罗诺杆菌对不同天然提取物的耐受性实验结果如图2所示。

从图2中可知，初始菌液浓度为7.0LogCFU/mL的4株菌在婴儿配方奶粉(pH 6.82)里增长迅速。而与之相反，在其他五个处理组中，菌体数量均呈现下降趋势，且各组处理在不同的时间点都存在显著性差异(p<0.05)。其中用HCl酸化后的茶多酚具有相对较强的抑菌作用，当处理7h时，4株菌都完全失活。而酸化的VC也表现出比未酸化之前更强的抑菌作用，酸化后的柠檬酸与未酸化之前的抑菌效果升高并不显著，可能由于其pH变化微小。用HCl酸化的婴儿配方奶粉也表现出一定的抑菌作用。总体来说，酸化后的各种天然提取物的抑菌作用都有所增强，其中茶多酚的抑菌作用最明显。

由于添加了不同的天然提取物之后，溶液的pH发生改变，因此用4M的HCl溶液统一调节pH为3.55，即不同处理组的最低pH值。由试验结果可知，用HCl酸化后的茶多酚具有相对较强的抑菌作用，有机酸主要是通过改变细胞内的pH值而起到抑菌作用的。而酸化的VC也表现出比未酸化之前更强的抑菌作用，酸化后的柠檬酸与未酸化之前的抑菌效果升高并不显著，可能由于其pH变化微小。用HCl酸化的婴儿配方奶粉也表现出一定的抑菌作用。总体来说，酸化后的各种天然提取物的抑菌作用都有所增强，说明无机酸HCl与有机酸之间存在一种协同作用，在低pH的条件下，有机酸多以非解离的形势存在，这就增强了其抗菌效果，而茶多酚在酸化后表现出明显的抗菌作用。

实施例4：不同ST型克罗诺杆菌对酸化后的茶多酚的复活实验

以上实施例中不同天然提取物及酸化后的天然提取物对克罗诺杆菌的耐受性的研究均是以婴儿配方奶粉作为基质的，此外，为了更清晰的观察天然提取物的耐受性，以生理盐水作为基质，加入0.5％茶多酚，加入1mL初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液，分别处理1h、3h、5h、7h后取出，经过0.85％的生理盐水梯度稀释后，涂布于TSA固体培养基上，置于37℃恒温培养箱培养过夜，观察菌株数量变化。

通过试验结果可知，在含有0.5％茶多酚且酸化后的婴儿配方奶粉处理7h后以及在含有0.5％茶多酚的0.85％生理盐水中处理1h后的克罗诺杆菌均不可检出，因此对其进行复活试验，进一步观察茶多酚的抑菌作用。

将在婴儿配方奶粉中酸化后的茶多酚处理7h后的克罗诺杆菌溶液及在生理盐水中处理1h后的克罗诺杆菌溶液，震荡均匀后加入立即加入到LB肉汤和婴儿配方奶粉中，放入37℃恒温培养箱中培养6h及12h后取出，振荡摇匀，从每个处理后的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况，根据实验结果来判定茶多酚的抑菌作用或杀菌作用。

复活实验结果如下：

将4株克罗诺杆菌分别在含有0.5％茶多酚且酸化其pH值为3.55的婴儿配方奶粉中处理7h，以及在含有0.5％茶多酚的生理盐水中处理1h后，取菌液分别加入LB肉汤及婴儿配方奶粉中进行复活试验，结果见表2。从表中可知，在婴儿配方奶粉里加入0.5％茶多酚，并且调节其pH值为3.55，分别处理4株菌株7h后，在LB肉汤和婴儿配方奶粉里均不可再生。同样，在生理盐水里加入0.5％茶多酚，检测其pH值为3.47，分别处理4株菌株1h后，所有菌株都不可在LB肉汤和婴儿配方奶粉里复活。这说明酸化后的茶多酚具有杀菌作用，而不止是抑菌作用，它对菌体的破坏作用是不可修复的。

表2 4株不同克罗诺杆菌对酸化后茶多酚的复活实验结果

注：A组：PIF里加入酸化的0.5％茶多酚处理7h；

B组：生理盐水里加入0.5％茶多酚处理1h；

“—”代表无

实施例5：茶多酚对克罗诺杆菌杀菌作用机理的初探

为了更进一步了解茶多酚对克罗诺杆菌的杀菌作用，因此分别对用LB肉汤培养以及含有0.5％茶多酚的0.85％生理盐水中培养1h后的克罗诺杆菌进行了透视电镜观察。

4株不同ST型的克罗诺杆菌在LB肉汤中以及在加入0.5％茶多酚的生理盐水中处理1h后的电镜图如图4所示。从图(A)中可以看到，在LB肉汤中生长的克罗诺杆菌在电镜下呈现出四周圆滑的杆状，且细胞内部的内容物饱满，细胞质与细胞壁紧密贴合。在图(B)中可以看到，4株菌都表现出类似的特征，即菌体细胞壁遭到破坏，菌体形态发生不同程度的改变，导致细菌内部的细胞质溢出，最后致使菌体死亡。这更清晰的说明了茶多酚对克罗杆菌有不可逆的杀菌作用，它会破坏细菌细胞结构。

实施例6：

1.不同pH值酸化的茶多酚溶液的杀菌效果比较

称取15g奶粉溶于100mL无菌水中，制成奶粉溶液，之后分别称取0.5g茶多酚加入到100mL奶粉溶液中，震荡均匀，使之充分溶解，此时测定混合溶液的初始pH为6.46，用4M的HCl调节溶液的pH分别至3、3.5、4、5、6，分别加入一定量初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液，使其初始浓度为7.0LogCFU/mL。将加入菌液的不同处理液放入37℃恒温培养箱中培养，经过7h后取出，振荡摇匀，经过生理盐水梯度稀释后，从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。具体结果如表3所示。

表3 不同pH值下酸化的茶多酚溶液的杀菌效果比较

注：“+”表示存活，“-”表示死亡

由表3可知，pH值在3-5之间的茶多酚溶液杀菌效果最好。

2.不同浓度下茶多酚溶液的杀菌效果比较

称取15g实施例1中所用相同品牌的奶粉溶于100mL无菌水中，制成奶粉溶液，之后分别称取0.1g、0.2g、0.3g、0.5g、1g、2g、3g茶多酚加入到100mL奶粉溶液中，震荡均匀，使之充分溶解，调节溶液的pH至3.5，分别加入一定量初始浓度为8.0LogCFU/mL的菌悬液，使其初始浓度为7.0LogCFU/mL。将加入菌液的不同处理液放入37℃恒温培养箱中培养，经过7h后取出，振荡摇匀，经过生理盐水梯度稀释后，从每个稀释的试管中分别吸取100μL混合液均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃倒置培养过夜，最后观察克罗诺杆菌的生长情况。具体结果如表4所示。

表4 不同浓度下茶多酚溶液的杀菌效果比较

注：“+”表示存活，“-”表示死亡

由表4数据可知，茶多酚浓度在0.3％-3％之间的茶多酚溶液杀菌效果最好。

实施例7：

将3g茶多酚溶解于100mL生理盐水中，对工厂中已经确定受到克罗诺杆菌污染的设备、管道及环境处理60min，然后对设备、管道及环境进行采样，检测后发现原来受到克罗诺杆菌污染的设备、管道及环境中未有检测出克罗诺杆菌，杀菌效果明显。