本发明涉及无盐或低盐的酱油样调味液及其制造方法。
背景技术：
日本的传统酱油是在蒸煮过的大豆和炒过的小麦的混合物中接种曲菌(麹菌)而制成酱油曲，将其与高浓度的食盐水一起进行投料，制成醪(諸味)，用几个月～1年这样的长时间进行发酵、熟化而制造的。高浓度的食盐水主要是为了抑制腐败菌的增殖而使用的，但是近年来，由于食盐的过量摄取与高血压症、肾病等的关联性逐渐被指出，因此，对于酱油要求低盐化(低钠化)的呼声提高。
关于无盐或低盐酱油的制造法，报道了为了防止微生物污染，如以往那样用高浓度的食盐水投入酱油曲，在发酵、熟化后通过离子交换膜等的膜处理而将食盐脱盐的间接制造法(例如参照专利文献1)。然而，通过该间接制造法得到的调味液因长时间脱盐而导致的成本的上升和苦味、涩味这样的对风味的不良影响成为问题。
另一方面，还报道了将ph、温度的控制、高氮投料、醇投料等组合而在无盐或低盐下进行投料的直接制造法(例如参照专利文献2～4)。然而，就仅低ph条件下的无盐投料而言，无法完全防止由微生物导致的腐败这一点是问题，就高氮投料而言，存在过滤性的劣化的问题，就高温投料而言，存在酵母发酵不良、温酿臭/苦味的赋予等问题。此外，就醇投料而言，虽然可抑制微生物的繁殖，但存在添加的醇会给酵母发酵、风味带来影响的问题。
此外，还报道了一种低盐调味液，其是通过在将碳水化合物原料、蛋白质原料或它们的混合物以低于2％(w/v)的盐浓度进行消化时，将初期醪的ph调节为4～6，进而添加具有醇产生能力的酵母，同时进行醪的消化和醇发酵而得到的(参照专利文献5)。然而，在该方法中，也不能说发酵初期阶段的醪中的微生物增殖抑制是充分的，具有经常导致污染的缺点。
此外，还报道了一种调味液，其将酱油曲和70～80℃的热水混合，制备品温为50～57℃的醪，在保持品温的同时间歇地或连续地进行搅拌，由此，以食盐浓度为0～5％(w/v)防止醪的腐败，并且缩短分解时间(参照专利文献6)。
然而，该方法中，虽然能够制造低食盐浓度的醪，但是在乳酸发酵、酵母发酵以后的工序中必须加盐，因此，难以得到低盐的酱油样调味液。
这样，无盐或低盐的酱油样调味液虽然一直以来报道有许多，但若鉴于实用性则尚不充分，期望在制造时没有微生物污染、且风味优良的无盐或低盐的酱油样调味液。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公昭45-020887号公报
专利文献2：日本特公昭62-062143号公报
专利文献3：日本特开平5-219915号公报
专利文献4：日本特开2009-165377号公报
专利文献5：日本专利第3065695号公报
专利文献6：日本专利第3827300号公报
技术实现要素：
发明所要解决的问题
本发明是为了解决上述问题而进行的，其目的在于提供没有由危害微生物导致的污染、并且风味和功能性优良的无盐或低盐的酱油样调味液及其制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，向在以大豆或小麦作为主要原料的谷物原料中接种曲菌而制备的固体曲中加入无盐或低盐的投料水而制备醪，将醪杀菌后，在能够抑制危害微生物的混入的容器中，一边防止污染一边进行酵母发酵，由此，可得到没有由危害微生物导致的污染、风味和功能性优良的无盐或低盐的酱油样调味液，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
(1)一种酱油样调味液，其中，食盐浓度低于4％(w/v)，相对于总氮浓度1.0％(w/v)，异戊醇浓度为20ppm(w/v)以上，2-苯基乙醇浓度为6ppm(w/v)以上，异丁醇浓度为9ppm(w/v)以上，且hemf浓度为10ppm(w/v)以上。
(2)根据上述(1)所述的酱油样调味液，其中，钠离子浓度为50ppm(w/v)以下。
(3)上述(1)或(2)中任一项所述的酱油样调味液的制造方法，其特征在于，包含下述的工序：
工序1：在以大豆或小麦作为主要原料的谷物原料中接种曲菌而制备固体曲，加入水或食盐水，对食盐浓度低于4％(w/v)的醪进行加温分解的工序；
工序2：对工序1的醪进行杀菌的工序；
工序3：在工序2的杀菌醪中接种酵母，在能够抑制危害微生物的混入的容器中进行酵母发酵的工序。
发明效果
根据本发明，能够提供没有由危害微生物导致的污染、味道和香气优良的无盐或低盐的酱油样调味液。
此外，通过本发明得到的无盐调味液由于钠离子浓度极低，并且风味也优良，因此能够作为适于高血压症、肾病等的患者用的酱油样调味液来提供。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明中，首先在由谷物原料制备的固体曲中混合水或食盐水，制备食盐浓度低于4％(w/v)的酱油醪，在25～57℃下进行0～48小时加温分解。
优选如日本专利第3827300号记载的那样，期望将70～80℃的热水或食盐水与固体曲混合，在将醪温度保持于50～57℃的状态下，在罐内间歇地或连续地进行搅拌，进行15～30小时酶分解。
在此，谷物原料例如是指以完整大豆、脱脂大豆、大豆蛋白、小麦谷蛋白、豌豆、蚕豆、小豆等为代表的蛋白质原料和以小麦、大麦、黑麦、麦糠、大米、米糠、玉米、淀粉糟等为代表的淀粉质原料。它们可以单独使用或组合使用。
在此使用的固体曲是通过在利用常规方法进行原料处理后的蛋白质原料或在其中混合淀粉质原料而得到的混合物中接种以酱油曲霉(aspergillussojae)、米曲霉(aspergillusoryzae)为代表的曲菌，进行2～3天固体培养(制曲)而得到的。
在蛋白质原料中混合淀粉质原料时，配合比例没有特别限定，但在想要得到例如接近通常的酱油的调味液的情况下，优选以重量比计设定为1：0.25～4。
投料中使用的水或食盐水只要是曲充分浸泡的程度即可，一般而言，优选相对于曲重量设定为1～4容量倍(v/w)。此外，在加温分解时，为了提高防霉性和分解效率、提高风味，也可以添加后述的食用的酸、酶剂、活性炭。
进而，为了抑制酵母发酵时的起泡，可以以使终浓度达到0.01～0.5％(w/v)的方式添加乳剂型的有机硅消泡剂。
在加温分解时，为了促进醪的分解，可以以使终浓度达到0.001～1％(w/v)的方式添加酶剂。作为酶剂，例如可列举蛋白酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶等。
接着，进行进行了加温分解的食盐浓度低于4％(w/v)的酱油醪的加热杀菌。在此，加热杀菌方法没有特别限定，可以使用uht、htst、蒸馏罐、加压罐、蒸汽喷射、蒸汽注入、高压釜、板式加热器、刮面式、焦耳式热交换、管式杀菌等杀菌方法中的任意一者，优选使用加压罐、管式杀菌机较佳。例如，可以通过将醪放入加压罐中，一边均匀地搅拌一边进行加压加温等而进行杀菌。若杀菌温度过低、或者杀菌时间过短，则杂菌的杀菌变得不充分，因此不优选。相反，若杀菌温度过高、或者杀菌时间过长，则调味液的风味劣化，因此不优选。最佳条件根据选择的杀菌方法而有所不同，例如优选80℃下为2分钟以上且180分钟以下、121℃下为5秒以上且15分钟以下、130℃下为1秒以上且30秒以下。
为了提高防霉性、调整味道，所制备的醪也可以进行ph调节。从防霉性和酵母的发酵性的观点出发，调节后的ph期望达到3.0～7.0、优选达到4.0～5.5。作为ph调节的时机，可以是加温分解时、醪的加热杀菌前、醪的加热杀菌后中的任一时机。作为ph调节剂的食用的酸例如可列举乳酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、己二酸等，从风味的观点出发，优选乳酸。
为了顺利地进行酵母发酵，也可以在醪中添加0～20％(w/v)的糖质。例如可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、甘油等酵母能够同化的糖质，若考虑同化效率，则期望使用葡萄糖。此外，若利用核糖、木糖等戊糖，则即使是无盐或低盐，也能够如日本特开2001-120293号公报记载的那样使酱油中包含的重要的香气成分即hemf增加。它们可以单独使用，也可以组合使用。此外，也可以使用包含这些糖的食品原材料、例如砂糖、葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、三温糖、糖蜜等。
此外，在酵母发酵之前，也可以为了促进醪的分解、提高压榨性，以使终浓度达到0.001～1％(w/v)的方式添加酶剂。作为酶剂，例如可列举蛋白酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶等。
此外，在酵母发酵之前，为了除去苦味而提高风味，也可以在醪中添加活性炭。活性炭优选为粉末，更优选使用平均粒径为10～100μm的活性炭。活性炭的添加量相对于醪原料优选为0.1～5％(w/w)。活性炭的种类可以根据用途而适当选择，例如可以将具有苦味除去、恶臭除去、味道的调整、颜色的调整或这些功能的活性炭组合使用。
本发明中使用的酵母没有特别限制，例如使用酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)等酵母。本发明的醪由于为无盐或低盐，因此，除了这些以外，还可以使用耐盐性弱的葡萄酒酵母、啤酒酵母、烧酒酵母等。关于酵母的添加浓度，优选以每1g醪中达到1×105个以上、优选1×106～1×107个的方式添加。
将醪放入能够抑制危害微生物的混入的容器中，进行酵母发酵。在此，能够抑制危害微生物的混入的容器只要是具有能够将容器内部与外部空气阻断的结构的容器即可，在实验中可以使用聚丙烯制的完成灭菌的广口瓶、玻璃制的培养瓶等，在工业上可以使用具有能够向容器内供给除菌后的空气的功能的缸式发酵槽、加压式的发酵罐等。此外，空气的除菌可以使用能够将0.3μm以上的灰尘进行99.97％以上的集尘的过滤器、例如hepa过滤器等。
酵母发酵在酵母能够生长的温度、具体而言在15～45℃、优选20～30℃下进行1～90天、优选3～28天。
本发明的酱油样调味液的醇可以根据发酵工序中添加的糖浓度、所使用的酵母的种类、发酵条件而将产生量调整为0～20％(w/v)，此外，也可以在发酵结束时添加醇，但作为酱油样调味液，为了使其具有像酱油那样的风味，优选设定为低于8％(w/v)、更优选设定为2～7％(w/v)较佳。
醇浓度可以通过例如基于气相色谱法、酶法的测定试剂盒等公知的方法进行测定。
发酵结束后的醪可以通过进行利用压榨、低温灭菌(火入れ)、澄清、过滤等常规方法的制作而得到风味和功能性优良的食盐浓度低于4％(w/v)的酱油样调味液。食盐浓度可以通过例如电位差滴定法、莫尔法等方法进行测定。
本发明的酱油样调味液与公知的无盐或低盐的酱油样调味液不同，其特征在于，香气成分浓度满足以下的条件，更加具有本来的酱油那样的风味。
(1)相对于总氮浓度1.0％(w/v)，异戊醇浓度为20ppm(w/v)以上
(2)相对于总氮浓度1.0％(w/v)，2-苯基乙醇浓度为6ppm(w/v)以上
(3)相对于总氮浓度1.0％(w/v)，异丁醇浓度为9ppm(w/v)以上
(4)相对于总氮浓度1.0％(w/v)，hemf浓度为10ppm(w/v)以上。
异戊醇、2-苯基乙醇作为清酒的基调香而已知，已知是与异丁醇一起使酱油的风味提高的酵母发酵来源的香气成分。这些香气成分浓度可以使用例如gc-ms、gc-fid等进行测定。
hemf是酱油中包含的重要的香气成分，但迄今为止已知在低盐下的酿造工序中，其浓度降低(j.agric.foodchem.vol44、3273-3275、1996)。本发明的酱油样调味液的特征在于，达到与一般的酱油同等的hemf浓度，具有像酱油那样的风味。
此外，在上述的投料工序中，在投料水中完全不使用食盐而得到的本发明的无盐酱油样调味液中，钠离子浓度达到50ppm(w/v)以下。在这一点上与公知的无盐酱油样调味液不同，其特征在于，钠浓度更加低。钠离子浓度可以通过例如原子吸光分析法、icp发光分析法等方法进行测定。
以下，通过实施例对本发明进一步进行具体说明。但是，本发明的技术范围不受这些例子的任何限定。
实施例
1.无盐调味液的制造
(酱油曲的制作)
以脱脂加工大豆50％(w/w)和烘焙破碎小麦50％(w/w)的配合比例制作酱油曲。另外，脱脂加工大豆使用洒水130％(w/w)并蒸煮过的大豆。在该原料中接种酱油曲霉(aspergillussojae)的种曲，通过常规方法进行42小时制曲而得到酱油曲。
(醪的制备)
相对于上述酱油曲100重量份，混合200重量份的加温至70℃的热水(不包含食盐)，在旋转轴上配置有搅拌翼的带保温夹套的分解罐内连续地以100rpm进行搅拌，在55℃下进行24小时加温分解，得到无盐的醪。
(醪的杀菌处理)
将上述无盐醪300g如表1那样利用乳酸进行调节，以使ph达到4.0～5.0，将实施例1-1～1-4的4个分区的醪放入玻璃制的培养瓶中，在121℃下进行5分钟的高压釜杀菌。接着，在各分区的醪中，如表1所示的那样，以使终浓度达到5％(w/v)的方式添加完成灭菌的50％(w/v)葡萄糖。
[表1]
(酵母发酵)
接着，在上述醪中以达到1×107个/g醪的方式添加预先培养得到的酱油酵母(zygosaccharomycesrouxii)，如表1那样，在品温20～30℃下进行14天酵母发酵。
(制作)
将酵母发酵后的醪进行压榨，进行低温灭菌、除渣，得到澄清的酱油样调味液。将所得到的酱油样调味液的一般活菌数和成分分析值示于表2中。
(一般活菌数的测定、成分分析)
一般活菌数的测定中，利用在标准琼脂培养基パールコア(荣研化学公司制)中以达到30μg/ml的方式加入有制霉菌素的培养基进行培养，计测生长的菌落。另外，通过该方法测定的一般活菌数中不包含酵母，主要表示污染菌。此外，总氮(tn)浓度、醇浓度及ph通过财团法人日本酱油研究所编辑酱油试验法(1985年3月1日发行)中记载的方法求出。此外，食盐浓度通过莫尔法求出，谷氨酸浓度使用氨基酸分析装置来求出。
[表2]
根据表2的比较例1-1～1-3的结果，即使将起始醪ph降低至4.0，在没有醪的杀菌工序的情况下，也会在酿造过程中发生腐败，没有得到所期望的酱油样调味液。另一方面，在如实施例1-1～1-4那样有杀菌工序的情况下，在醇浓度低的实施例1-4中，就连在酿造过程中也没有发生腐败，能够得到酱油样调味液。进而认为，从醇浓度的方面出发，也没有问题地进行了酵母发酵。此外还确认到，从酵母发酵、对风味的影响考虑，优选在20～30℃的发酵温度下进行。
2.无盐或低盐的酱油样调味液制造法的改良
(增加了酱油曲量的醪的制备)
与实施例1同样地，相对于酱油曲100重量份，混合140重量份的加温至70℃的热水，进而在实施例2-4及比较例2-1、2-2中以使终浓度达到表3的食盐浓度的方式混合食盐，进一步以相对于原料达到1.5％(w/w)的方式添加活性炭(くじゃくtk2：川北化学公司制造)，利用乳酸将ph调节为4.8后，在旋转轴上配置有搅拌翼的带保温夹套的分解罐内连续地以100rpm进行搅拌，在55℃下进行24小时加温分解，得到醪。该醪与实施例1的醪相比，酱油曲的比例增加。
(酱油样调味液的制造)
将上述醪用缸式发酵槽在121℃下进行5分钟的杀菌处理，以终浓度达到5％(w/v)的方式添加完成灭菌的50％(w/v)葡萄糖。接着，以达到1×107个/g醪的方式添加预先培养得到的酵母(zygosaccharomycesrouxii、saccharomycescerevisiae、kluyveromycesmarxianus)，进而，以使终浓度达到0.1％(w/w)的方式添加市售酶剂(内切蛋白酶、外切蛋白酶)，如表3中所示的那样，在品温25℃或30℃下进行14天酵母发酵。
[表3]
(制作及风味评价)
将酵母发酵后的醪进行压榨，进行低温灭菌、除渣，得到澄清的酱油样调味液。将所得到的调味液的成分分析值和风味评价的结果示于表4中。另外，风味的评价按照下述的基准。
◎：非常理想
○：理想
×：不理想
[表4]
通过在醪制备时增加酱油曲量并进一步在酵母发酵时添加酶剂，能够制造最终总氮浓度、谷氨酸浓度高、风味良好的调味液。
此外，如实施例2-1、2-2的调味液那样，以无盐发酵的调味液整体上具有甘甜且强烈的香气，风味良好。进而，以低食盐浓度(3％：w/v)进行了酵母发酵的实施例2-4的低盐调味液更加具有像酱油那样的香气，风味也同样地良好。
此外，实施例2-2使用了清酒酵母s.cerevisiae，实施例2-3使用了耐热性酵母k.marxianus，但这些酵母与实施例2-1的酱油酵母(z.rouxii)相比具有发酵速度快、醇生产量也多的倾向，可以说在防霉性方面是优良的。但是，这些酵母为非耐盐性酵母，因此，如比较例2-1、比较例2-2那样，在高食盐浓度下变得生长不良，无法产生醇，因此，在以往的一般的酱油酿造中无法使用。在本发明的无盐或低盐发酵中，能够使用这些非耐盐性的微生物也是一大优点。
3.提高了酱油感的无盐调味液的制造
(戊糖添加型酱油样调味液的制造)
在与实施例2同样地制造的杀菌无盐醪中以达到表5的终浓度(w/v)的方式添加完成灭菌的50％(w/v)葡萄糖溶液及核糖或木糖。与实施例2-1同样地添加酱油酵母z.rouxii，进而以使终浓度达到0.1％(w/w)的方式添加市售酶剂(内切蛋白酶、外切蛋白酶)，在品温25℃下进行14天发酵。将酵母发酵后的醪进行压榨，进行低温灭菌、除渣，得到澄清的酱油样调味液。
[表5]
表6中示出所得到的酱油样调味液的成分分析值和风味评价的结果。通过添加核糖或木糖而进行发酵，虽然一般成分分析值几乎没有变化，但在风味评价中确认到像酱油那样的香气增加、品质提高。由此暗示了：为了进一步提高无盐酱油样调味液的酱油感，添加戊糖是有效的。
[表6]
4.与脱盐酱油、市售浓口酱油、市售无盐酱油的比较
(脱盐酱油的制备)
将蒸煮变性后的脱脂大豆和破碎后的烘焙小麦等量混合，在其中接种种曲，进行42小时通风制曲而得到酱油曲，将其投入到食盐水中，在25～30℃下，一边适当搅拌一边进行150天按照常规方法的醪管理，使其发酵熟化后，压榨过滤，得到食盐浓度为约18％(w/v)、总氮浓度为约1.7％(w/v)的生酱油。
将该生酱油在80℃下进行1小时低温灭菌后，进行澄清过滤。进一步将所得到的酱油利用电透析装置(astom公司制造)进行脱盐处理，得到食盐浓度为0.1％(w/v)、总氮浓度为约1.6％(w/v)、谷氨酸浓度为约0.9％(w/v)、ph4.7的脱盐酱油。
(香气成分分析)
异戊醇、2-苯基乙醇、异丁醇及hemf的各浓度通过j.agric.foodchem.vol.39,934,1991记载的定量分析法来实施。更具体而言，进行利用气相色谱法(安捷伦科技公司制造的6890n)的分析，通过使用标准物质的标准曲线法，确定各种香气成分含量。
表7中示出各实施例分区(实施例1-4、2-1、2-2、2-4、3-1、3-2)的调味液和脱盐酱油、市售浓口酱油(龟甲万株式会社制造)、市售的醇投料酱油样调味液(市售无盐酱油)的香气成分分析结果。可知本发明的酱油样调味液均是具有相对于总氮浓度1％(w/v)的异戊醇、2-苯基乙醇、异丁醇浓度比脱盐酱油和市售酱油高的倾向、分别具有20ppm(w/v)、6ppm(w/v)、9ppm(w/v)以上的浓度的风味良好的无盐或低盐的调味液。此外，关于hemf浓度，也确认到，就实施例2-1、2-2、2-4的调味液而言，得到了与脱盐酱油、市售浓口酱油同等的值，也兼具像酱油那样的风味。
此外确认到，就实施例3-1、3-2那样添加戊糖而制备的无盐调味液而言，hemf浓度进一步增加，并且确认到，通过在本发明的实施时使用戊糖，能够得到更像酱油的调味液。
[表7]
(金属离子浓度分析)
金属离子浓度是使用原子吸光光度计aa6300(岛津制作所公司制造)，通过利用空气-乙炔火焰的原子吸光分光分析来进行。标准曲线使用原子吸光分析用标准液(关东化学公司制造)来制作。
表8中示出实施例2-1的无盐酱油样调味液、4.中制备的脱盐酱油、市售无盐酱油的各金属离子浓度。本发明的无盐酱油样调味液与其它酱油相比，钠离子浓度极低。脱盐酱油虽然钾离子浓度低，但根据电透析的效率，钠离子浓度为比较高的值。由这些结果暗示了：本发明的无盐酱油样调味液与以往的无盐或低盐酱油样调味液相比，钠离子浓度更加低，是食盐敏感性高血压的预防等功能性优良的调味液。
[表8]
(感官评价)
感官评价通过由经过训练且具有辨别能力的8名评审员进行的评分法来实施。即，关于实施例1-4、2-1、2-2、3-1、3-2的各无盐调味液、在实施例2-1的样品中以使终浓度达到8.5％(w/v)的方式添加有醇的样品、及市售无盐酱油，对于与4.中制备的脱盐酱油进行比较时的盐味强度、鲜味强度、苦味强度、酱油感的强度、嗜好性(喜好性)，将强度弱/嗜好性低评价为1，将强度稍弱/嗜好性稍低评价为2，将强度相同/嗜好性相同评价为3，将强度稍强/嗜好性稍高评价为4，将强度强/嗜好性高评价为5。
表9中示出各无盐调味液的感官评价试验的结果。另外，表中的评分是8名评审员的平均值。作为本发明品的实施例2-1、2-2的样品与脱盐酱油相比，观察到鲜味、嗜好性的提高。此外，就实施例3-1、3-2的样品而言，还一并确认到由hemf增加所带来的酱油感的提高。另一方面，添加有醇的样品、市售无盐酱油强烈地感觉到醇感，存在不被喜好的倾向。本发明品的总氮、谷氨酸浓度高、具有像酱油那样的香气并且醇浓度为通常的纯酿造酱油程度成为使嗜好性进一步提高的主要原因。
[表9]
同样地，利用实施例2-4(食盐3％)、在脱盐酱油中以使终浓度达到3％的方式添加有食盐的样品实施了低盐调味液的感官评价(n＝8)。将结果示于表10中。就食盐浓度为3％的实施例2-4的样品而言，得到了如下评价：通过少量的食盐的存在，盐味、鲜味、酱油感、嗜好性大幅提高，是与以达到相同浓度的方式添加有食盐的脱盐酱油相比平衡良好的调味液。
[表10]
由以上的结果确认，本发明的酱油样调味液尽管为无盐或低盐，但风味优良，与脱盐酱油、市售无盐酱油、在脱盐酱油中添加有食盐或醇的酱油等相比，嗜好性高。
(无盐调味液的试制)
(a)醋酸添加高温分解-醪液杀菌-酵母发酵
将脱脂加工大豆50％(w/w)和烘焙破碎小麦50％(w/w)的配合比例的酱油曲7.8kg、75℃的热水12l、醋酸100ml放入30l缸式发酵槽中，在55℃下进行24小时搅拌分解。将分解后的醪通过滤纸过滤进行固液分离，将滤液(醪液)在121℃下进行3分钟的热杀菌处理。在杀菌后的醪液中以达到1×106个/ml的方式添加葡萄糖1l、酱油酵母(zygosaccharomycesrouxii)，在品温30℃下进行7天酵母发酵。
(b)乳酸添加高温分解-醪液杀菌-酵母发酵
将与(a)相同的酱油曲7.8kg、75℃的热水12l、乳酸100ml放入30l缸式发酵槽中，在55℃下进行24小时搅拌分解。将分解后的醪通过滤纸过滤进行固液分离，将滤液(醪液)在121℃下进行3分钟的热杀菌处理。在杀菌后的醪液中以达到1×106个/ml的方式添加葡萄糖1l、酱油酵母(zygosaccharomycesrouxii)，在品温30℃下进行7天酵母发酵。
(c)乳酸添加高温分解-醪杀菌-酵母发酵
将与(a)相同的酱油曲7.8kg、75℃的热水12l、乳酸100ml放入30l缸式发酵槽中，在55℃下进行24小时搅拌分解。将分解后的醪在缸式发酵槽内一边搅拌一边在121℃下进行3分钟的热杀菌处理。在杀菌后的醪中以达到1×106个/ml的方式添加葡萄糖1l、酱油酵母(zygosaccharomycesrouxii)，在品温30℃下进行7天酵母发酵。
结果
下述表11中示出各调味液样品的分析值和风味评价。各样品均没有确认到分析值有大的差异，但就风味方面而言大大不同，就醋酸分解样品(1)而言，酸臭、味道的清淡显著，就醪液杀菌样品(1、2)而言，得到了具有氧化臭、劣化臭等异味的结果，(c)的样品得到了最像酱油、感觉到鲜味这样的评价。
[表11]
由以上的结果确认到，在不进行固液分离的情况下进行酵母发酵的本申请发明的调味液的风味与进行固液分离后进行酵母发酵的调味液大大不同。