本发明属于酶工程技术领域，具体地说，涉及一种快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。
背景技术：
苯丙氨酸是一种人体必需氨基酸，在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢。同时，苯丙氨酸是生产新型保健型甜味剂阿斯巴甜的主要原料。苯丙氨酸不能被苯丙酮尿症患者正常代谢，而导致中枢神经系统的永久性损伤。只要在新生儿期获得诊断和给予及时的低苯丙氨酸饮食，可避免患儿的智力损害。食疗法是治疗苯丙酮尿症一种公认的，长期坚持具有显著效果的方法，即控制患儿食物中苯丙氨酸摄入量以达到机体代谢平衡的一种方法。
目前脱除蛋白中苯丙氨酸的方法主要有酶解吸附法。目前研究中酶解过程中存在着酶解时间过长、酶解过程造成后续工艺复杂等问题不适于大规模生产。Cabrera-Padilla等利用新型酶膜反应器脱除蛋白中苯丙氨酸，在酶解过程中小分子物质经超滤处理，使反应物和产物在体系中有效分离，可提高反应效率，降低酶竞争抑制性，但在此情况下，利用糜蛋白酶和羧肽酶-A酶解乳清蛋白，酶解时间仍长达18h；周志伟等采用一种经纯化的粗制微生物蛋白酶作用于酪蛋白，酶解时间控制在12h；Lopes等在蛋白提取过程中将pH控制在9-12，在后续过程中需脱盐处理，不利于实际工业生产。可见，建立一种快速释放苯丙氨酸的方法，选用合适的前处理方式，选择效率高的酶种类，严格控制酶解过程中的反应条件，对蛋白中苯丙氨酸的快速游离至关重要的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法，将大米蛋白用水配制成一定浓度的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理，然后利用中性蛋白酶和链霉蛋白酶分步酶解大米蛋白，以快速释放大米蛋白中的苯丙氨酸。
所述方法具体包括以下步骤：
S1、将大米蛋白用水配制成一定浓度的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理后，加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；
S2、向酶解液I中加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；
S3、使酶解液II中的蛋白酶失活，离心所得上清液中含有释放出的游离苯丙氨酸。
前述方法中，所述大米蛋白溶液的质量百分浓度为1-2％，优选1％。
前述方法中，进行超声波细胞粉碎处理的条件如下：功率200-400W，超声4-6s，间隔3-5s，共计4-6min。
前述的方法，S1具体操作如下：将大米蛋白用水配制成一定浓度的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理后，按每克大米蛋白3200-6400U的加入量加入中性蛋白酶，于40-60℃反应1-5h，得到酶解液I。
优选中性蛋白酶的加入量为4000-5600U/g大米蛋白，更优选4800-5600U/g大米蛋白，最优选5600U/g大米蛋白；优选反应温度为45-55℃，更优选45-50℃，最优选50℃；优选反应时间为2-4h，更优选2-3h，最优选2h。
前述的方法，S2具体操作如下：向酶解液I中按每克大米蛋白50-146U的加入量加入链霉蛋白酶，于30-50℃反应1-5h，得到酶解液II。
优选链霉蛋白酶的加入量为74-122U/g大米蛋白，更优选98U/g大米蛋白；优选反应温度为35-45℃，更优选35-40℃，最优选37℃；优选反应时间为2-4h，更优选2h。
前述的方法，S3具体操作如下：将酶解液II于90-95℃恒温水浴中放置10-20min，使蛋白酶失活，然后4000-4500r/min离心20-30min取上清液。
优选地，本发明快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法包括以下步骤：
S1、将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理后，按每克大米蛋白5600U的加入量加入中性蛋白酶，于50℃反应2h，得到酶解液I；进行超声波细胞粉碎处理的条件为：功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min；
S2、向酶解液I中按每克大米蛋白98U的加入量加入链霉蛋白酶，于37℃反应2h，得到酶解液II；
S3、将酶解液II于90℃恒温水浴中放置10min，使蛋白酶失活，然后4200r/min离心20min取上清液。
前述的方法，进一步包括对所得上清液进行干燥的步骤。优选采用冷冻干燥。
本发明所述大米蛋白中蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。
本发明所用中性蛋白酶来源于枯草芽抱杆菌，由枯草芽抱杆菌经发酵产生，例如经液体深层发酵，浓缩提取精制而制得；属于单一酶类，无特异性酶切位点。所述中性蛋白酶可按现有技术方法制备，也可购买商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为6×104U/g。
本发明所用链霉蛋白酶来源于灰色链霉菌。所链霉蛋白酶可按现有技术方法制备，也可购买商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：P8360，酶活为7.00×103U/g。
本发明对中性蛋白酶酶活的定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。
本发明对链霉蛋白酶酶活定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。
本发明通过对酶解条件进行多因素优化，最终建立了一套能够快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。该方法操作简单、条件温和、易于工业化快速释放大米蛋白中苯丙氨酸，为不同方法脱除苯丙氨酸，并进一步分离苯丙氨酸提供良好的技术支持。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中游离苯丙氨酸占总苯丙氨酸含量的80％以上。
附图说明
图1为本发明实验例1中性蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；
图2为本发明实验例2中性蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；
图3为本发明实验例3中性蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响；
图4为本发明实验例4链霉蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；
图5为本发明实验例5链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；
图6为本发明实验例6链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中所用的中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为6×104U/g；所用的链霉蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：P8360，酶活为7.00×103U/g。所用的大米蛋白，其蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量4.72％。以下实施例中采用荧光法测定游离苯丙氨酸含量。
实施例1快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法
所述方法包括以下步骤：
(1)将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)后，按每克大米蛋白5600U的加入量加入中性蛋白酶，于50℃反应2h，得到酶解液I；
(2)向酶解液I中按每克大米蛋白98U的加入量加入链霉蛋白酶，于37℃反应2h，得到酶解液II；
(3)将酶解液II于90℃恒温水浴中放置10min，使蛋白酶失活，然后4200r/min离心20min，收集得到的上清液中含有大量释放出的游离苯丙氨酸。采用荧光法测定上清液中游离苯丙氨酸含量，大米蛋白中游离苯丙氨酸量占总苯丙氨酸含量的80.12％。然后将该溶液进行冷冻干燥保存。
实施例2快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法
所述方法包括以下步骤：
(1)将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为2％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率400W，超声6s，间隔3s，共计4min)后，按每克大米蛋白6400U的加入量加入中性蛋白酶，于40℃反应1h，得到酶解液I；
(2)向酶解液I中按每克大米蛋白146U的加入量加入链霉蛋白酶，于30℃反应1h，得到酶解液II；
(3)将酶解液II于95℃恒温水浴中放置20min，使蛋白酶失活，然后4500r/min离心25min，收集得到的上清液中含有大量释放出的游离苯丙氨酸。采用荧光法测定上清液中游离苯丙氨酸含量，大米蛋白中游离苯丙氨酸量占总苯丙氨酸含量的66.52％。然后将该溶液进行冷冻干燥保存。
实施例3快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法
所述方法包括以下步骤：
(1)将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1.5％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率200W，超声4s，间隔5s，共计5min)后，按每克大米蛋白3200U的加入量加入中性蛋白酶，于60℃反应5h，得到酶解液I；
(2)向酶解液I中按每克大米蛋白50U的加入量加入链霉蛋白酶，于50℃反应5h，得到酶解液II；
(3)将酶解液II于93℃恒温水浴中放置15min，使蛋白酶失活，然后4000r/min离心30min，收集得到的上清液中含有大量释放出的游离苯丙氨酸。采用荧光法测定上清液中游离苯丙氨酸含量，大米蛋白中游离苯丙氨酸量占总苯丙氨酸含量的65.76％。然后将该溶液进行冷冻干燥保存。
实施例4快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法
与实施例1的区别仅在于步骤(1)中将浓度为1％的大米蛋白溶液加热至80℃水浴震荡15min，代替超声波细胞粉碎处理。
采用上述方法释放大米蛋白中的苯丙氨酸，最终游离苯丙氨酸含量占总苯丙氨酸含量的52.70％。
实施例5快速释放大米蛋白中苯丙氨酸的方法
与实施例1的区别仅在于步骤(2)中以糜蛋白酶代替链霉蛋白酶。
采用上述方法释放大米蛋白中的苯丙氨酸，最终游离苯丙氨酸含量占总苯丙氨酸含量的61.35％。
酶解条件的多因素优化：
实验例1中性蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中进行酶解1h/2h/3h/4h/5h；
第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液；
第四步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
中性蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果影响的结果见图1。由图1可以看出：1-2h内，游离苯丙氨酸量显著增高，2-5h内，游离苯丙氨酸量基本保持不变，这可能是由于在2h左右，酶制剂与底物已充分接触，反应完全，苯丙氨酸在该反应条件下已充分游离，因此选择2h作为链酶蛋白酶的最佳酶解时间。
实验例2中性蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量3200/4000/4800/5600/6400U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液；
第四步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
中性蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果影响的结果见图2。由图2可以看出：中性蛋白酶加入量3200U/g蛋白、4000U/g蛋白、4800U/g蛋白、5600U/g蛋白、6400U/g蛋白，在加酶量3200-5600U/g蛋白之间，苯丙氨酸游离量显著升高，这可能是由于加酶量在底物蛋白充分接触，5600-6400U/g蛋白之间，苯丙氨酸的游离量逐渐降低，这可能是因为加酶量过大，酶进行自我分解，导致苯丙氨酸游离效果下降。
实验例3中性蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在40/45/50/55/60℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液；
第四步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
中性蛋白酶不同酶解温度对苯丙氨酸游离效果影响的结果见图3。由图3可以看出：中性蛋白酶推荐最适温度是50℃。在45-50℃之间，游离苯丙氨酸量显著升高，温度在50℃以上，游离苯丙氨酸量先趋于平缓后呈下降趋势，这可能是由于中性蛋白酶活性在50℃左右达到最高，但考虑到资源成本的节约，选定50℃作为最适酶解温度。
实验例4链霉蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量100U/g蛋白)混合均匀，在37℃的恒温水浴振荡器中进行酶解1/2/3/4/5h；
第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；
第五步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
链霉蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果影响的结果见图4。由图4可以看出：在链霉蛋白酶酶解1-2h内，游离苯丙氨酸量逐渐升高，2-3h内，游离苯丙氨酸量逐渐下降，3h后游离苯丙氨酸量基本保持不变，这可能是由于在3h左右，链霉蛋白酶与底物充分接触，苯丙氨酸在该反应条件下已充分游离，在中性蛋白酶酶解后，链霉蛋白酶对大米蛋白水解液进行特异性剪切。因此，选择2h作为链霉蛋白酶的最佳酶解时间。
实验例5链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量50/74/98/122/146U/g蛋白)混合均匀，在37℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；
第五步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果影响的结果见图5。由图5可以看出：在链霉蛋白酶加入量在50-98U/g蛋白范围内，游离苯丙氨酸量显著升高，但如果加入量高于98U/g蛋白，游离苯丙氨酸量剧烈下降。这可能是由于链霉蛋白酶可作用的酶切位点已充分反应，苯丙氨酸已从大米蛋白中充分解离出来，加酶量过多会使在反应中自我分解，导致苯丙氨酸不能充分游离。因此，选择98U/g蛋白作为链霉蛋白酶的最佳加入量。
实验例6链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响
第一步：将大米蛋白用水配制成质量百分浓度为1％的大米蛋白溶液，经超声波细胞粉碎处理(功率300W，超声5s，间隔4s，共计6min)；
第二步：第一步反应后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中进行酶解2h；
第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均匀，在恒温水浴振荡器中进行酶解2h，酶解温度控制在30/35/40/45/50℃；
第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；
第五步：上清液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。
链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图6。由图6可以看出：在30-50℃范围内，游离苯丙氨酸量先升高后趋于平缓，温度在40℃以上，游离苯丙氨酸量显著下降，这是因为温度过高，酶活逐渐下降，反应效率低，考虑到经济效益。因此，选择35℃作为链霉蛋白酶最佳酶解温度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。