一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法与流程

本发明涉及一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。

背景技术：

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)或称苯丙氨酸羟化酶缺乏症(phenylalanine hydroxylase deficiency)是一种常染色体隐性遗传疾病。它是由于体内无法正常代谢苯丙氨酸而导致中枢神经系统的永久性损伤。只要在新生儿期获得诊断和给予及时的低苯丙氨酸饮食，可避免患儿的智力损害。食疗法是治疗苯丙酮尿症一种公认的，长期坚持具有显著效果的方法，即控制患儿食物中苯丙氨酸摄入量以达到机体代谢平衡的一种方法。

目前低苯丙氨酸产品主要有酶解吸附法、配方法、基因法。但究其根本是将苯丙氨酸进行高效脱除，苯丙氨酸的脱除现主要有酶解与吸附结合、酶解与超滤结合两种，Cabrera-Padilla等采用酶解与超滤结合的方法，首先用糜蛋白酶和羧肽酶-A酶解乳清蛋白，酶解时间18h，酶解后水解物经截流量为10KD的滤膜进行超滤，苯丙氨酸含量降至0.19％；可以看出，采用酶解与超滤结合的方法可以将苯丙氨酸有效脱除，但低于10KD的物质多为小分子肽、氨基酸等活性物质，这造成了营养浪费，在实际生产中不宜推广。周志伟等采用酶解与吸附结合的方法，一种经纯化的粗制微生物蛋白酶作用于酪蛋白，蛋白水解物通过选择性吸附，其苯丙氨酸含量由4.8％降至0.5％；由此可见，采用超滤脱除苯丙氨酸的方法高于吸附脱除，但在低苯丙氨酸蛋白的制备中，应尽可能多的保留天然蛋白中的营养素。采用酶解与吸附结合的方法可较大程度的保留天然蛋白中的营养物质，且工业生产中易于实现。

因此，利用酶解与吸附结合的方法脱除苯丙氨酸的研究至关重要，现存在的苯丙氨酸脱除方法耗时长，步骤繁琐，产生的经济效益低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，该方法简单、条件温和、快速有效的脱除大米蛋白中苯丙氨酸，制备针对苯丙酮尿症患者的特膳饮食作基料。本发明所述的方法快速高效、操作简单、条件温和。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。

本发明技术方案如下：

一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

将大米蛋白充分溶解，制得大米蛋白溶解液，加入糜蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；再加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附树脂吸附，收集洗脱液(即吸附后的溶液)，即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。

上述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，其中，

所述大米蛋白的蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。

所述大米蛋白溶解液的质量浓度为1-2％，优选质量浓度为1％。

所述糜蛋白酶的加入量为4800-14400U/g蛋白，优选为4800-9600U/g蛋白，进一步优选为7200U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：40-60℃，优选为45-55℃，更优选50-55℃；酶解时间：4-12h，优选6-10h，进一步优选为6-8h。所述酶解优选在恒温水浴振荡器中进行。优选地，所述糜蛋白酶的酶活≥1.20×10⁶U/g。

所述链霉蛋白酶的加入量50-146U/g蛋白，优选为74-122U/g蛋白，进一步优选为98U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：30-50℃，优选为35-45℃，更优选35-40℃；酶解时间：1-5h，优选2-4h，进一步优选为3h。所述酶解优选在恒温水浴振荡器中进行。优选地，所述链霉蛋白酶的酶活≥7.00×10³U/g。

所述使糜蛋白酶和链霉蛋白酶灭活的方法包括：将所述酶解液II升温至90-95℃，保持10-20min。

所述离心的条件为：转速4000-4500rpm，时间20-30min。

所述吸附速度为10-50r/min，优选为20-40r/min，进一步优选为20-30r/min。

具体地，所述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

将蛋白质含量≥75％、脂肪含量≤1％、苯丙氨酸含量≥4.72％的大米蛋白充分溶解，制得质量浓度为1-2％的大米蛋白溶解液，按照4800-9600U/g蛋白的用量加入糜蛋白酶进行酶解6-8h，酶解温度50-55℃，得到酶解液I；再按照74-122U/g蛋白的用量加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，酶解温度35-45℃，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附树脂吸附，吸附速度为20-40r/min，收集洗脱液(即吸附后的溶液)，即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。

上述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，进一步地还包括将所述洗脱液(即吸附后的溶液，脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液)进行干燥的步骤；优选为冷冻干燥。

如无特殊指明，本发明所述的糜蛋白酶是指牛或猪胰中提取的一种蛋白分解酶，用于肽链的酶解，专门水解肽键，属于肽链内切酶，水解产率很高。所述糜蛋白酶可按现有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8660，酶活为1.20×10⁶U/g。

如无特殊指明，本发明所述链霉蛋白酶是自灰色链霉菌中分离的非特异性蛋白水解酶；所链霉蛋白酶可按现有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：P8360，酶活为7.00×10³U/g。

本发明对糜蛋白酶酶活的定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。

本发明对链霉蛋白酶酶活定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。

本发明还包括按上述方法制备的脱除苯丙氨酸的大米蛋白；优选地，所述大米蛋白中苯丙氨酸含量≤0.29％。本发明所述方法可特异性吸附苯丙氨酸，对其他氨基酸含量损失较小，也可有效保留天然蛋白中的其他营养成分。

如无特殊指明，本发明所述大米蛋白中苯丙氨酸均为总苯丙氨酸。

本发明通过大量客观实验对酶解条件和吸附条件进行多因素优化，最终确定了能够脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。本发明所述的方法快速高效、操作简单、条件温和。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。

附图说明

图1表示实验例1糜蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；

图2表示实验例2糜蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；

图3表示实验例3糜蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响；

图4表示表示实验例4链霉蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；

图5表示实验例5链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；

图6表示实验例6链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响；

图7表示实验例7吸附条件对苯丙氨酸脱除效果的影响。

图1-6中，纵坐标均指游离苯丙氨酸浓质量度；

图7中纵坐标Phe content指总苯丙氨酸浓质量度，Time指吸附时间；横坐标Speed指流速。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下述实施例中所采用的糜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8660，酶活为1.20×10⁶U/g；所采用的链霉蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：P8360，酶活为7.00×10³U/g。下述实施例、对比例及实验例中所采用的大米蛋白，其蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量4.72％。下述实施例中游离苯丙氨酸测定：荧光法；总苯丙氨酸测定采用氨基酸分析仪。

实施例1

脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均匀，在45℃的恒温水浴振荡器中进行酶解3h；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反应结束后，采用D101大孔吸附树脂吸附大米蛋白酶解液中的苯丙氨酸，吸附流速为40r/min，收集洗脱液(即吸附后的溶液)；

第六步：第五步反应结束后，溶液即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

采用上述方法脱除大米蛋白中苯丙氨酸，最终苯丙氨酸的含量为0.29％。

对比例1

脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，与实施例1的区别仅在于不包括加入链霉蛋白酶进行二次酶解的步骤。

采用上述方法脱除大米蛋白中的苯丙氨酸，最终苯丙氨酸的含量为0.86％。

对比例2

脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，与实施例1的区别仅在于采用活性炭代替D101大孔吸附树脂进行苯丙氨酸的吸附。

采用上述方法脱除大米蛋白中的苯丙氨酸，最终苯丙氨酸的含量为0.08％。

以下实验例1-6考察指标为游离苯丙氨酸含量，实验例7考察指标为总苯丙氨酸含量。

实验例1糜蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解(4h/6h/8h/10h/12h)；

第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

糜蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图1。由图1可以看出：在4-6h内，游离苯丙氨酸量显著增高，6-12h内，游离苯丙氨酸量基本保持不变，这可能是由于在6h左右，酶制剂与底物已充分接触，反应完全，苯丙氨酸在该反应条件下已充分游离，因此选择6h作为糜蛋白酶的最佳酶解时间。

实验例2糜蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量4800-14400U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

糜蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图2。如图2所示：糜蛋白酶加入量4800U/g蛋白、7200U/g蛋白、9600U/g蛋白、12000U/g蛋白、14400U/g蛋白，在加酶量4800-7200U/g蛋白之间，苯丙氨酸游离量显著升高，这可能是由于加酶量在底物蛋白充分接触，7200-14400U/g蛋白之间，苯丙氨酸的游离量逐渐降低，这可能是因为加酶量过大，酶进行自我分解，导致苯丙氨酸游离效果下降。

实验例3糜蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶7200U/g蛋白，在恒温水浴振荡器中进行酶解6h，酶解温度控制在45/50/55/60/65℃；

第三步：第二步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

糜蛋白酶不同酶解温度对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图3。如图3所示：糜蛋白酶推荐最适温度是55℃在45-50℃之间，游离苯丙氨酸量显著升高，在50℃之后，游离苯丙氨酸量先趋于平缓后呈下降趋势，这可能是由于糜蛋白酶活性在55℃左右达到最高，但由于考虑到资源成本的节约，选定55℃作为最适酶解温度。

实验例4链霉蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量100U/g蛋白)混合均匀，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解1/2/3/4/5h；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

链霉蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图4。由图4可以看出：在链霉蛋白酶酶解1-3h内，游离苯丙氨酸量逐渐升高，3h后游离苯丙氨酸量基本保持不变，这可能是由于在3h左右，链霉蛋白酶与底物充分接触，苯丙氨酸在该反应条件下已充分游离，在糜蛋白酶酶解后，链霉蛋白酶对大米蛋白水解液进行特异性剪切。因此，选择3h作为链霉蛋白酶的最佳酶解时间。

实验例5链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量50/74/98/122/146U/g蛋白)混合均匀，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解3h；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图5。由图5可以看出：在链霉蛋白酶加入量在50-98U/g蛋白范围内，游离苯丙氨酸量显著升高，但98U/g蛋白后，游离苯丙氨酸量剧烈下降。这可能是由于链霉蛋白酶可作用的酶切位点已充分反应，苯丙氨酸已从大米蛋白中充分解离出来，加酶量过多会使在反应中自我分解，导致苯丙氨酸不能充分游离。因此，选择98U/g蛋白作为链霉蛋白酶的最佳加入量。

实验例6链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶98U/g蛋白混合均匀，在恒温水浴振荡器中进行酶解3h，酶解温度控制在30/35/40/45/50℃；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反应结束后，溶液即为苯丙氨酸充分游离的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果影响的结果，见图6。由图6可以看出：在30-50℃范围内，游离苯丙氨酸量先升高后趋于平缓，在40℃后游离苯丙氨酸量显著下降，这是因为温度过高，酶活逐渐下降，反应效率低，考虑到经济效益。因此，选择35℃作为链霉蛋白酶最佳酶解温度。

实验例7吸附条件对苯丙氨酸脱除效果的影响

第一步：将大米蛋白前处理充分溶解；

第二步：第一步反应后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解6h；

第三步：第二步反应结束后，加入链霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均匀，在55℃的恒温水浴振荡器中进行酶解3h；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反应结束后，采用大孔吸附树脂吸附大米蛋白酶解液中的苯丙氨酸，吸附时间为1/2/3/4/5h，收集吸附后的溶液。

第六步：第五步反应结束后，溶液即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液，该溶液经冷冻干燥保存。

吸附条件对总苯丙氨酸脱除效果影响的结果，见图7。由图7可以看出：在10-50r/min，随着流速的增加，苯丙氨酸量增加，这意味着吸附效果逐渐降低，但流速过慢，会使吸附时间过长，因此，需要寻找一个平衡点既能有效降低苯丙氨酸量，又可节约时间成本。因此，选择流速30r/min。

实验例8

分别比较实施例1(D101大孔吸附树脂吸附)和对比例2(活性炭吸附)方法所制得的脱除苯丙氨酸后的大米蛋白中的氨基酸含量，结果见下表1。结果表明，采用活性炭吸附将其他氨基酸也一并吸附且吸附量较大，对整体氨基酸量带来不利影响。因此，对比例2方法不是最佳选择。

表1不同吸附剂对氨基酸含量的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。