一种提高花生中α‑生育酚含量的方法与流程

本发明涉及提高植物中α-生育酚含量领域，具体涉及一种提高花生中α-生育酚含量的方法。

背景技术：

维生素e（vitamine）又称生育酚（tocopherol），是一种天然存在的脂溶性维生素，包括生育酚和生育三烯酚两类。根据甲基的位置和个数又分为α-、β-、δ-、γ-生育酚及α-、β-、δ-、γ-生育三烯酚共8种。其中，α-生育酚的生物活性最高（kimberlykline,karlaa.lawson,weipingyu,etal.vitamineandcancer[j].vitaminandcancer,2007,76:435-461.），优先被人体吸收利用（zinggjm.vitamine:anoverviewofmajorresearchdirections[j].molecularaspectsofmedicine,2007,28(5-6):400-422.）。花生与大豆、油菜、向日葵并列为世界四大油料作物，是我国最大的油料作物和最重要的经济作物。据报道，花生及花生制品是维生素e的极好来源，尤其花生油和花生酱。维生素e是良好的抗氧化剂，能阻断油脂自由基链式氧化反应，起到防止和减缓脂质过氧化自由基对体内生物膜破坏的作用，延长花生种子寿命，更能提高花生制品的稳定性。维生素e是人体必需营养素，具有较好的抗衰老、改善脂质代谢、软化心血管等生理功能。与其他维生素相比，维生素e独特地具有维持生殖器官机能的作用。随着对维生素e认识的逐步加深及其安全性的认可，维生素e已被广泛用于医药保健、食品抗氧化剂、化妆品等领域。

然而，在植物中提取出来的天然维生素e仍不足以满足营养学及医学方面的需求，如何提高植物中维生素e（尤其活性最高的α-生育酚）含量已成为科研工作者的热点。通过基因工程调控维生素e合成相关酶的基因进行培育改良是目前提高植物中维生素e含量的主要方式及有效方式。维生素e在植物体的生物合成途径为：先由莽草酸途径得到尿黑酸（hga），由非甲羟戊酸途径得到异戊烯基二磷酸（prdp），再由hga异戊二烯化通过一系列酶催化合成而得（yangw,cahoonre,huntersc,etal.vitaminebiosynthesis:functionalcharacterizationofthemonocothomogentisateeranylgeranyltransferase[j].plantj,2011,65(2):206-217.）。利用基因工程，可通过上调相关酶的基因，如4-羟苯丙酮酸双加氧酶（tsegayeay,shintaniadk,dellapennad.overexpressionoftheenzymeshydroxyphenylpyruvatedioxygenaseinarabidopsisanditsrelationshiptotocopherolbiosynthesis[j].plantphysiolbiochem,2002,40:913-920.），提高前体物质hga的合成水平，从而提高植物维生素e的总量。亦可通过调控维生素e组分关键酶的基因表达，如生育酚甲基转移酶（huntersc,cahooneb.enhancingvitamineinoilseeds:unravelingtocopherolandtocotrienolbiosynthesis[j].lipids,2007,42(2):97-108.），提高α-生育酚的比例，从而提高维生素e的活性。中国专利申请号为201410744726.6“一种花生维生素e合成关键基因及应用”采用改良的race技术，克隆分离花生hppd基因的cdna序列，构建超表达载体p35s::ahhppd，结果显示转化模式中烟草α-生育酚含量增加了2-3倍。中国专利申请号为201510141218.3“花生维生素e合成相关基因apg1、apg2在提高植物α-生育酚含量和耐盐性中的应用”将花生维生素e合成相关基因apg1、apg2于花生中超量表达后培育，结果显示α-生育酚含量分别提高1.74、1.34倍。虽然基因工程手段能有效地提高植物中α-生育酚含量，但是存在程序繁杂、成本昂贵、品种差异性等不少问题。此外，基因工程改良至今仍受争议而未能普及应用。

近年来，国内外掀起一股“芽类食品”热潮。芽类食品即指将经过适当发芽的谷物种子作为原料制成的食品。不少研究表明，发芽能提高谷物蛋白的利用率，降低脂肪含量，改善功能因子，提高种子的营养价值。王琳珍将大豆避光发芽5天，发现α-生育酚从2.29mg/100gdw提高到7.64mg/100gdw，为本底值3.34倍。（王琳珍.萌芽强化黄豆芽特殊营养品质的研究[d].华南理工大学,2016.）吴凤凤将三个品种糙米避光发芽5天，发现维生素e比发芽前提高了46%~51%。（吴凤凤.发芽对糙米主要营养成分、生理功效和加工特性的影响[d].江南大学,2013.）然而，目前利用发芽方式提高花生中α-生育酚的文章及专利鲜见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简单、方便、成本低、大众化的能提高花生中α-生育酚含量的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现。

一种提高花生中α-生育酚含量的方法，包括以下步骤：

（1）前处理：将花生种子加入消毒液中浸泡消毒，再用水反复冲洗直至ph值为中性，然后加入水，进行避光浸泡；

（2）发芽处理：将步骤（1）前处理后的花生种子置于避光条件下发芽，得花生芽。

优选的，步骤（1）所述花生种子为粤油13号、豫花15号和鲁花11号花生种子中的一种以上。

优选的，步骤（1）所述消毒液是浓度为0.5~1.5wt%的次氯酸钠溶液；所述浸泡消毒的时间为5~15min。

优选的，步骤（1）中避光浸泡所用的水为花生种子质量的2~4倍；所述避光浸泡的温度为20~30℃，时间为4~12h。

优选的，步骤（2）所述发芽的温度为26~32℃。

优选的，步骤（2）所述发芽的湿度为70~100%；所述发芽期间每隔1~3小时喷淋蒸馏水一次，每次喷淋持续1~2分钟。。

进一步优选的，步骤（2）所述发芽的时间为7天。

优选的，所述发芽的时间为7天。

优选的，将步骤（2）所述的花生芽真空冷冻干燥，使花生芽水分含量为2~3wt%，再高速粉碎后过40~60目筛，真空包装置于25℃干燥箱中保存。

优选的，步骤（2）所述花生芽的α-生育酚含量高达178.63μg/gdw~267.52μg/gdw，与未发芽花生种子中的α-生育酚含量相比，提高了4.87~5.98倍。

优选的，一种提高花生中α-生育酚含量方法，该方法具体步骤为：

（1）前处理：挑选外观饱满、大小一致、无霉变的优质新鲜花生种子，用蒸馏水清洗去除表面杂质，沥干后于0.5~1.5%次氯酸钠溶液浸泡5~15min进行消毒，用蒸馏水反复冲洗直至ph值为中性，加入花生质量2~4倍蒸馏水，置于20~30℃避光条件下浸泡4~12h；

（2）发芽处理：于26~32℃、70~100%湿度下避光发芽7天，每隔1~3小时喷淋蒸馏水一次，喷淋持续1~2分钟；

（3）样品处理及测定：将花生芽真空冷冻干燥，使其水分含量为2~3%，高速粉碎后过40~60目筛，真空包装置于25℃干燥箱保存。在实验色谱条件下进行高效液相色谱法测定，利用α-生育酚标准品作为对照，根据峰面积计算花生芽中的α-生育酚含量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

1、方法简便、成本低、大众化，可推广应用；

2、效果显著。经过本方法发芽处理7天的花生α-生育酚含量高达178.63μg/gdw以上，与未发芽花生种子中α-生育酚含量相比，提高至少4.87倍。

3、品种通用性。本发明已实施用于粤油13号、豫花15号、鲁花11号，皆能有效提高花生中α-生育酚含量。

附图说明

图1为40μg/mlα-生育酚标准品的液相色谱图；

图2为实施例1中粤油13号花生的液相色谱图；

图3为实施例1中粤油13号花生发芽2、4、6天的液相色谱对比图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）前处理：挑选外观饱满、大小一致、无霉变的优质新鲜粤油13号花生种子，用蒸馏水清洗去除表面杂质，沥干后置于浓度为1wt%的次氯酸钠溶液中浸泡10min进行消毒，用蒸馏水反复冲洗直至ph值为中性，加入花生质量3倍蒸馏水，置于25℃避光条件下浸泡6h；

（2）发芽处理：将步骤（1）处理后的花生置于27℃、95%湿度下避光发芽7天，每隔1小时喷淋蒸馏水一次，每次喷淋持续1分钟；

（3）样品处理及测定：将步骤（2）所得花生芽真空冷冻干燥，使其水分含量为2.74wt%，高速粉碎后过40目筛，真空包装置于25℃干燥箱保存。准确称取2g花生芽粉，加入10ml正己烷，旋涡振荡后超声（40khz，150w）30min，在8000rpm下离心15min，提取过程重复三次，合并上清液在40℃下旋蒸，用2ml色谱级正己烷复溶。高效液相色谱测定条件：色谱柱为反相c18柱（150mm×3.9mm，4μm，watersnova-pakc18）；流动相为纯甲醇；流速为0.9ml/min进行等度洗脱；检测器为紫外检测器，检测波长为294nm；柱温为40℃；进样量为10μl。在此实验色谱条件下进行高效液相色谱法测定，利用α-生育酚标准品作为对照，根据峰面积计算花生芽中的α-生育酚含量（α-生育酚标准品的液相色谱图见图1，粤油13号样品的液相色谱图见图2）。检测发现，未发芽花生仁的α-生育酚含量为45.03μg/gdw，发芽7天后花生芽的α-生育酚含量为269.23μg/gdw，提高为本底值5.98倍。图3为粤油13号花生发芽2、4、6天的液相色谱对比图，可见α-生育酚对应色谱峰的峰面积显著升高，即花生芽中α-生育酚含量逐渐提高。

实施例2

（1）前处理：挑选外观饱满、大小一致、无霉变的优质新鲜豫花15号花生种子，用蒸馏水清洗去除表面杂质，沥干后置于浓度为1.5wt%的次氯酸钠溶液中浸泡5min进行消毒，用蒸馏水反复冲洗直至ph值为中性，加入花生质量2倍蒸馏水，置于23℃避光条件下浸泡12h；

（2）发芽处理：将步骤（1）处理后的花生置于32℃、100%湿度下避光发芽7天，每隔2小时喷淋蒸馏水一次，每次喷淋持续2分钟；

（3）样品处理及测定：将步骤（2）所得花生芽真空冷冻干燥，使其水分含量为2.52wt%，高速粉碎后过40目筛，真空包装置于25℃干燥箱保存。花生中α-生育酚含量的测定方法同实施例1。检测发现，未发芽花生仁的α-生育酚含量为36.68μg/gdw，发芽7天后花生芽的α-生育酚含量为178.63μg/gdw，提高为本底值4.87倍。

实施例3

（1）前处理：挑选外观饱满、大小一致、无霉变的优质新鲜鲁花11号花生种子，用蒸馏水清洗去除表面杂质，沥干后置于浓度为0.5wt%的次氯酸钠溶液中浸泡15min进行消毒，用蒸馏水反复冲洗直至ph值为中性，加入花生质量4倍蒸馏水，置于27℃避光条件下浸泡4h；

（2）发芽处理：将步骤（1）处理后的花生置于29℃、90%湿度下避光发芽7天，每隔3小时喷淋蒸馏水一次，每次喷淋持续2分钟；

（3）样品处理及测定：将步骤（2）所得花生芽真空冷冻干燥，使其水分含量为2.48wt%，高速粉碎后过60目筛，真空包装置于25℃干燥箱保存。花生中α-生育酚含量的测定方法同实施例1。检测发现，未发芽花生仁的α-生育酚含量为50.28μg/gdw，发芽7天后花生芽的α-生育酚含量为272.52μg/gdw，提高为本底值5.42倍。