本发明属于果汁加工技术领域，具体而言，本发明涉及鲜果果汁、其加工方法及其中使用的酯酶。
背景技术：
鲜果原产南美州，又称西番莲，因其果肉可散发出香蕉、菠萝、草莓、荔枝、柠檬、芒果、酸梅等十几种水果的浓郁香味而得名。鲜果含有丰富蛋白质、脂肪，还有糖、维生素和磷、钙、铁、钾等多种化合物及17种氨基酸，营养丰富。鲜果的果肉可以加工成果汁饮料，尤其可以与其他果汁(如含糖量高的果汁)调配成复合果汁饮料。然而，主要由于鲜果果皮和种子的干扰，尤其是其种子含油量达25％，在提取鲜果果汁的时候，通常要小心地去掉种子或采取压榨、搅打等工艺，而不使用利刃切碎，以防止因种子破碎而造成油脂进入果汁，影响风味，而且油脂会上浮，不但影响饮料的视觉效果，而且容易氧化，产生异味。
例如，中国专利申请第93106822号公开了一种浓缩天然西番莲汁，其加工方法包括选果、漂洗、去皮、去核、果肉分解淀粉、榨汁、等过程。
中国专利申请第93109135号公开了一种西番莲全果果肉果汁，在其加工中包括鲜果清洗、浸泡、果皮与果肉及种子分离，果皮经煮沸后去除外果皮，再加入果肉，一同打浆并胶磨成果实颗粒。
中国专利申请第200410022600号公开了一种以西番莲为原料制作天然果汁增香
剂的工艺，包括将西番莲鲜果挑选、清洗、压榨、打浆、过滤、膜浓缩、冷冻干燥、包装等工序。
中国专利申请第200610019166号公开了一种鲜果果汁饮料的制造方法，包括果浆与果皮分离后打浆，其中将果浆用刷式擦皮机和装有氯丁橡胶叶的打浆机加工，由此来防止种子破碎。
中国专利申请第201210354143号公开了一种鲜果果肉果汁饮料的制备方法，包括将果实剖开，挖出果肉，进行籽肉分离，然后将分离出的果肉打碎成粒状，搅拌后煮沸。
在现有技术的工艺中，也会加入果胶酶来分解果肉中的胶质以提高出汁率，例如，中国专利申请第201310386824号公开了一种鲜果饮料的制备方法，包括将鲜果的果皮和带籽果肉分开，带籽果肉加入温水中搅拌均匀后去籽，果皮切块后放入该温水中打浆，然后加入果胶酶酶解。
然而，经过长期研究和一些运气，本发明人出人意料地发现，通过加入一定量的酯酶，尤其是本发明人改造的酯酶，对用利刃切碎鲜果(必然有较多的种子破碎)整果发酵处理，能够消除种子中油脂的影响，既不会发生分层，也不会在保质期内变质产生异味，而且果汁色彩更为鲜艳，并且在保留鲜果原有香味的基础上，还增加了细微的花生香，进一步增加了鲜果果汁的香味层次，口味上除了原鲜果果汁的酸甜味之外，还增加了细微的单宁口感，进一步增加了鲜果果汁的口味层次。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供新的鲜果果汁的制备工艺。另外，本发明还提供了用该工艺生产的鲜果果汁以及该工艺中所使用的酯酶等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了鲜果果汁的制备方法，其包括：
(1)将洗净的鲜果粉碎；
(2)向步骤(1)获得的粉碎料加水和酯酶发酵；
(3)对步骤(2)获得的发酵物升温；
(4)对步骤(3)获得的发酵物降温(优选降低至室温)，然后过滤；和，
(5)任选向步骤(4)获得的滤液加水、糖和/或其他饮料。
在本发明中，粉碎会使得鲜果的种子破碎，其中的油脂会混入最终的鲜果果汁，然而本发明人创新地通过加入酯酶等手段来克服这样的缺陷。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(1)中，粉碎至最大颗粒直径不超过0.5cm。通常为了节约粉碎的成本，没有
必要粉碎得特别彻底，当最大颗粒直径不超过0.5cm时即可终止粉碎，所以粉碎产物中可以存在直径超过0.3cm、甚至0.4cm的最大颗粒。
现有技术的打浆时甚至需要在叶轮上包覆氯丁橡胶等来减少种子的破碎，与此显著不同的是，本发明可以采用利刃来粉碎(如，切碎)，无需受制于防止种子的破碎。所以，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(1)中，粉碎是用利刃粉碎，如使用带有刀刃的粉碎或切割工具来粉碎。在本发明的具体实施方式中，利刃是刀。刀具的可行便于使用现有常规的成本低的粉碎或切割工具，也便于自动化。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤(2)中的水与步骤(1)中的鲜果(即步骤
(1)获得的粉碎产物)的重量比可以为0.8～2∶0.5～1.5，优选为1～1.5∶0.8～1.2，更优选为1.1～1.3∶0.9～1.1。最优选为1.2∶1。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤(2)中的酯酶具有的氨基酸序列：
(1)如seqidno：2所示；
(2)对氨基酸序列seqidno：2增加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留酯酶活性的氨基酸序列。
根据本发明的如seqidno：2所示的氨基酸序列，通过《分子克隆实验指南》等手册，本领域技术人员通过合成改变的基因序列并克隆入表达载体和/或宿主细胞中表达，可以纯化获得对氨基酸序列seqidno：2增加、缺失和/或取代一个或几个(优选五个及以下，更优选三个及以下)氨基酸残基而获得的保留酯酶活性的氨基酸序列。在本发明的具体实施方式中，酯酶的氨基酸序列如seqidno：2所示。
另外，本发明也提供了编码该酯酶的核酸(基因)。该核酸通过常规的dna重组技术，可以导入表达载体(如，质粒)和/或宿主细胞(如，酵母)，表达获得该酯酶。在本发明的具体实施方式中，编码酯酶的核酸(基因)的核苷酸序列如seqidno：1所示。
发酵的温度和时间可以根据所使用的酯酶来确定。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(2)中，发酵的温度为25～55℃，优选为30～40℃，更优选为32～37℃，如35℃。也优选在本发明第一方面的方法中，步骤(2)中，发酵的时间为5～72小时，优选为12～48小时，更优选为20～32小时，如24小时。
步骤(2)获得的发酵产物需要灭菌，可以在固液分离后灭菌，也可以先灭菌再固液分离。由于滤渣可以直接或者加糖后作为糕饼状食品而加以利用，因此为了减少灭菌的复杂程度，本发明采用先灭菌再固液分离的方式。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)中，升温达到的温度是80～95℃，优选是82～90℃，如85℃。也优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)中，保持升温达到的温度1～10分钟，优选2～7分钟，如5分钟。
本发明人研究发现，鲜果中的香味物质会在高温下挥发散失，因此优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)的升温和/或步骤(4)的降温在密闭容器中进行。
另外本发明人研究发现，如果发酵物相对于密闭容器过多或过少，都会影响最终的鲜果果汁质量，所以进一步优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)的发酵物和/或步骤(4)的发酵物的体积与密闭容器的容积比为1∶1.05～1.8，优选为1∶1.1～1.5，更优选为1∶1.2～1.3，最优选为1∶1.25。
另外，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)中，降温可以是自然降温(冷却)，也可以是加速(如用冰箱等冷源，或者水冷)冷却。
本发明人研究发现，鲜果果汁(包括现有技术的纯鲜果果汁)的主要优势在于香味，口味偏酸，并不吸引所有人群，尤其是儿童，所以优选本发明第一方面的方法中，步骤(5)中，向步骤(4)获得的滤液加水、糖和/或其他饮料，尤其是加糖和/或其他饮料。而且，本发明人研究发现，加糖等抑制了酸味，对追求口感层次感的有品味人群不适合，但是却能吸引儿童等人群，因此可以根据相应饮料的目标人群而确定任选的项目是选择还是不选择。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的果汁。该果汁能够长期保存而不变质，除了原有鲜果风味，在香味和口味上可以进一步增加层次感，特别适合追求层次感的有品味人群，通常针对这部分人群的产品定位较高，附加值也较高。
在第三方面，本发明提供了酯酶在制备鲜果果汁中的应用。这是在制备鲜果果汁中首次应用了酯酶。
优选在本发明第三方面的应用中，酯酶是本发明第一方面优选的酯酶，即酯酶具有的氨基酸序列：
(1)如seqidno：2所示；
(2)对氨基酸序列seqidno：2增加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留酯酶活性的氨基酸序列。
本发明具有下列优点和效果：可以对鲜果整果进行整体性处理，可以不必像现有技术那样分离出带种子的果肉、甚至分离种子后再进行取汁处理；可以使用利刃粉碎，设备常规而成本低，操作手段简便，也便于自动化；可以同时获得鲜果果汁饮料和糕饼状食品；鲜果果汁不容易受种子中的油质干扰质量，保质期长；鲜果果汁无论是香味还是口味，都更加有层次感，特别适合面向高端消费人群，增加产品的附加值。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正
和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的酿酒技术和基因重组技术手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料和设备均可从市场上购买。
实施例1酯酶的制备
根据我们委托设计的基因序列(参见seqidno：1，其编码的酯酶的氨基酸序列为seqidno：2)，通过商业途径委托广东暨大基因药物工程研究中心有限公司合成该酯酶基因并克隆入酵母细胞构建成分泌表达菌株。克隆过程可以参照《分子克隆实验指南》进行，简而言之，合成该基因的片段，拼接，以拼接产物为模板，在50μl反应体积中进行pcr扩增，其中正向引物如seqidno：3所示、反向引物如seqidno：4所示，收集约1.4kb的扩增产物，用ecori和.xbai双酶切，然后连接到同样双酶切的ppiczαa(invitrogen)上，将阳性构建体电转化入酵母gs115株(invitrogen)中，用zeocin筛选出阳性酵母菌，经pcr扩增并测序确认含有正确的如seqidno：1所示的基因序列后，寄回给我们。
将阳性酵母菌接种于25ml种子培养基，于30℃以220rpm震荡培养，直至od600达到3.5，其中种子培养基的配方为：2％(w/w)蛋白胨、1％(w/w)酵母提取物、1.34％(w/w)ynb(无氨基酵母氮源)、4*10-5％(w/w)生物素、和ph3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.2m磷酸氢二钠：0.1m柠檬酸(体积比)＝1∶3)。然后，将25ml种子培养产物接种入100ml发酵培养基中，于30℃以200rpm震荡培养，每12小时补加甲醇至0.5％(v/v)，培养96小时，其中发酵培养基的配方为：2％(w/w)蛋白胨、1％(w/w)酵母提取物、1.34％(v/v)ynb(无氨基酵母氮源)、4*
10-5％(w/w)生物素、0.5％(v/v)甲醇和ph3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。然后，于4℃以1500rpm离心发酵培养产物，保留上清液并上样于sephadexg-75层析柱，以ph3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集280nm紫外检测出的最大洗脱峰，然后冷冻干燥，于4℃保存，即制备出本发明的酯酶。经检测，酯酶表达量为3.7g/l。
实施例2果汁的制备
挑选成熟、不腐烂、无霉点的合格鲜果，洗净，直接将整果用刀切碎，切碎至最大颗粒直径不超过0.5cm时停止。将所有切碎产物(含流体和固体)一并装入带有搅拌叶轮的发酵罐中，加入该产物重量1.2倍的蒸馏水，并加入按照实施例1的方法制备的酯酶至产物和水总重量的0.05％，搅拌均匀后，于35℃以50rpm搅拌发酵24小时。然后，将发酵产物装入带有搅拌叶轮的灭菌罐中，装满至灭菌罐内容积的80％后，加盖密闭灭菌罐，加热并搅拌从而使发酵产物整体以约10℃/min的速度均匀升温，至85℃时，减小热源以在这个温度保温5分钟，然后移除热源，自然冷却至室温。然后打开灭菌罐的盖，在无菌条件下过滤获得的灭菌产物，保留滤液(滤饼酸甜可口，种子也软化了，滤渣(任选加糖后)可以制备成为糕饼状食品)，即鲜果果汁，罐装。
另外，作为对照，以诺维信公司的优质果胶酶(pectinexultrasp-l)代替本发明的酯酶，进行以上步骤，得到对照品。
实施例3果汁的检验
按照实施例2的方法制备的鲜果果汁及其对照品放置在42℃环境中7天，进行加速试验，发现，在视觉上，鲜果果汁均一、澄清、无分层，而对照品有分层现象，水相上有一层油脂，而且水相的浑浊肉眼可辨；在嗅觉上，鲜果果汁香气宜人，由专业品香师分辨出了应当具有的香蕉、菠萝、草莓、荔枝、柠檬和芒果香味之外，还发现具有轻微的花生香味，而对照品则有浓重的异味，故终止对对照品的闻香和品味测试；在味觉上，鲜果果汁除了原有酸甜味之外，还有轻微的单宁味，其中酸味和单宁味在加糖后被抑制。