本发明涉及益生菌领域，尤其涉及一种耐酸耐胆盐的益生菌颗粒的制备方法。
背景技术：
益生菌是一类能对人体健康起到促进作用的细菌，常见的益生菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等。例如，乳酸杆菌主要定植于人体小肠内，双歧杆菌主要定植于人体大肠内，若使用复配的菌种，则能对人体起到综合调节作用。这些益生菌代谢产生的有机酸、多糖、细菌素和特殊酶系等对人体有调节肠胃菌群平衡、提高免疫力、延缓衰老、改善便秘、腹泻和过敏症状等功效。
现代人类生活水平上升，环境的污染、药物的滥用等对人体的微生态平衡和免疫力造成许多负面影响，处于亚健康的人群也日益增多。而针对性的食用含益生菌的食品可以调节人体内环境的平衡，提高自身免疫力。
目前，益生菌制剂在食品及保健品领域多以粉剂、片剂、硬胶囊、颗粒剂等形式存在，通过包材及环境条件的控制，才能进一步在产品活菌数稳定性方向达到要求，并且在口服过程中易受消化道、胃液、胆盐等胁迫干扰，容易在进入小肠之前失去活性，丧失其应有的益生效果，造成实际在宿主肠道释放起效量未能达到要求，所以需要在产品剂型及制备工艺方向进行研究，探讨能够抵御宿主胃液、胆盐胁迫，进行肠道控释的益生菌类产品形式。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种对酸和胆盐具有良好耐受性、通过胃到达肠道可以很大程度上的保持活性、从而保证益生菌的益生功效的耐酸耐胆盐的益生菌颗粒的制备方法。
本发明提供一种前述耐酸耐胆盐的益生菌颗粒的制备方法，包括以下步骤：
s1、将益生菌菌泥与保护剂以1:4至4:1的比例混合均匀，缓慢搅拌10-40min形成乳化液；
s2、将乳化液与胶体液以1:2至8:1的比例加入配置好的胶体液，搅拌使其混合均匀，缓慢搅拌5-10min，形成混合液；
s3、将混合液缓慢注入其质量的0.25至1倍的质量浓度为0.2％-5％的氯化钙溶液中进行交联反应，待全部混合液注入后进行高速剪切搅拌2-10min，然后静置5-20min，得到混合菌浆；
s4、将混合菌浆通过冷冻干燥得到含水量低于5％的固体，使用粉碎整粒机将其进行粉碎整粒得到20-50目的益生菌颗粒；
其中，所述保护剂中包括海藻糖、甘油和变性淀粉，所述胶体液中包括海藻酸钠。
应当说明的是，胶体液中的海藻酸钠与氯化钙发生交联反应可形成大分子聚合物，该聚合物在低ph环境(如胃液)中发生凝聚作用，保护益生菌颗粒不失活，而在较高ph环境(如肠液)中发生崩解，释放其中的益生菌颗粒。保护剂则可有效保护益生菌在较高ph环境(如肠液)中不被胆盐灭活，以最终促进益生菌在肠道定植。
应当说明的是，步骤s1中，益生菌菌泥与保护剂的混合比例、保护剂的成分、以及混合搅拌时间，将会影响到本发明制备方法所得到的益生菌颗粒的菌量得率、耐酸耐胆盐性能，具体详见实施例。
应当说明的是，步骤s2中，乳化液与胶体液的混合比例，将会影响到益生菌颗粒在海藻酸钠和氯化钙交联形成的大分子聚合物中的包埋效果，当胶体液含量过小时，将导致包埋效果不好，当胶体液含量过大时，将导致菌量得率较低、以及包埋材料的浪费。
应当说明的是，步骤s3中，混合液与氯化钙溶液的混合比例以及氯化钙溶液的浓度，将会影响到交联反应后包埋材料的聚合物理化性质、反应速度和强度，当氯化钙溶液比例较高时，将导致反应速度过快，当氯化钙溶液浓度较高时，将导致交联反应速度过快，所得混合菌浆反应结果不均一。
中国专利申请号为200610010518.9的发明专利，公开了一种肠道益生菌包埋保护方法，然而经过大量实验证明，冻干后的微生物菌剂pa，混入乳化溶液b1后会再溶解，变成均匀的混合物，并不会形成双层包埋结构，再混入海藻酸钠溶液后，会再混合均匀成一个混合液；另外，最后以自然干燥的方式获得的活性益生菌制剂，也难以批量化应用，实现产业化。
中国专利申请号为201610881048.7的发明专利，公开了一种益生菌微胶囊及其制备方法，然而，使用植物油乳化方式，工业化生产也带来诸多不便，实际上也难以产业化。
进一步的，步骤s1中所述保护剂溶液包括海藻糖20-50％，甘油2-10％，蔗糖2-10％，变性淀粉2-10％，维生素0.1-2％，氨基酸1-8％，脱脂乳粉2-20％。
具体的，所述胶体液包括5％的海藻酸钠。
具体的，所述维生素包括维生素b、维生素c、维生素d、维生素e中的一种或多种。
具体的，所述脱脂乳粉包括牛脱脂乳粉、羊脱脂乳粉、马脱脂乳粉中的一种或多种。
具体的，所述氨基酸包括蛋氨酸、酪氨酸、精氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸中的一种或多种。
具体的，步骤s1中所述的益生菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、唾液乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌中的一种或多种。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：用海藻酸钠混合活性成分制备料液，然后滴入氯化钙溶液里凝胶成颗粒，分离颗粒后干燥，这就是常见的肠溶微包埋方法。由于通过滴制料液成粒得到的颗粒较大(通常大于2.5mm)，所以又发展出乳化法，比如把料液乳化到植物油中，然后加氯化钙溶液，将得到很小的颗粒，如粒径小于0.05mm。
肠溶颗粒益生菌，在产业化中一般作为添加剂使用，因此对粒径要求较高，比如0.2-0.5mm，否则没法混合复配到终端产品中去。所以，滴制法生产的大颗粒就无法使用；然而乳化法由于采用了植物油，工业化生产也带来诸多不便，实际上也难以产业化。因此，如何通过较为简单的生产工艺获得粒径较小的益生菌颗粒，成为益生菌行业的发展方向。
本发明中，将料液和海藻酸钠溶液混合，然后加入到氯化钙溶液里，此时混合液里会产生大块的凝胶块，通过对含有凝胶块的混合物高速剪切均匀，可形成均匀的小颗粒，冻干后再粉碎整粒可得到20-50目益生菌颗粒。由于高速剪切后的物料其实已经形成基本均匀的小颗粒凝胶，虽然在液体中可能有粘联，但冻干后再粉碎整粒、容易得到20-50目的颗粒；普通的料液冻干后粉碎整粒难以得到20-50目的小颗粒。
此外，本发明提供了一种最优的生产工艺、合理的保护剂配方，可以较为简单的工艺，获得较佳的耐酸耐胆盐的益生菌颗粒，可实现产业化。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
本实施例以嗜酸乳杆菌为例，提供一种耐酸耐胆盐的益生菌颗粒的制备方法，并检测不同保护剂对于益生菌颗粒耐酸、耐胆盐性能的影响，包括如下步骤：
s1、配置保护剂溶液，灭菌后冷却至常温待用，所用物质符合食品检验标准即可；配置质量浓度为5％的海藻酸钠胶体液，灭菌后冷却至常温待用；
s2、将嗜酸乳杆菌菌泥与保护剂溶液以1：1的比例混合均匀，缓慢搅拌30min，形成乳化液；
s3、以2:1的比例，将乳化液加入配置好的胶体液，搅拌使其混合均匀，缓慢搅拌5min，形成菌胶混合液；
s4、将菌胶混合液缓慢注入其质量的0.25倍的质量浓度为2％的氯化钙溶液中进行交联反应，待全部混合液注入后进行高速剪切搅拌5min，然后静置10min，得到混合菌浆；
s5、将混合菌浆通过冷冻干燥得到含水量低于5％的固体，使用粉碎整粒机将其进行粉碎整粒得到20-50目的益生菌颗粒。
对于保护剂，本实施例提供三种实验组配方，具体如表1所示：
表1不同保护剂的配方
相应的，采用配方1、配方2和配方3并拖过上述试验方法获得的益生菌颗粒，分别为颗粒1、颗粒2和颗粒3。
本实施例还提供一种对照组的益生菌颗粒，其制备方法包括如下步骤：
s1、配置保护剂溶液灭菌待用，保护剂溶液配方为：20％海藻糖、2％蔗糖、2％甘油、2％变性淀粉。
s2、将嗜酸乳杆菌菌泥与配置的保护剂溶液以1：1的比例混合均匀得到乳化液，将乳化液通过冷冻干燥得到含水量低于5％的固体，将固体菌块通过粉碎机进行粉碎得到对照组益生菌冻干粉。应当说明的是，对照组冻干粉由于未经过高速剪切后再冻干，其粒径难以达到20-50目的水平，存在大量颗粒大于50目的情况。
将前述颗粒1、颗粒2、颗粒3和对照组冻干粉，进行耐酸和耐胆盐性能分析，具体如下：
1)耐酸性能研究
配制人工胃液(ph＝3的稀盐酸溶液)，将四种益生菌颗粒或冻干粉置入，放入恒温摇床，37℃条件下180r/min振荡1h，每20min取样称量溶解质量计算颗率溶解率，并计算菌体存活率。
关于颗粒或冻干粉溶解率，结果如表2所示，可见颗粒1、颗粒2和颗粒3具有良好的耐酸能力，几乎不溶解，该颗粒能有效的保护菌体，对抗酸性能力显著提升。
表2不同益生菌颗粒在人工胃液中的溶解率对比结果表
关于菌体存活率，结果如表3所示，可见颗粒1、颗粒2和颗粒3即使经过人工胃液处理，也能有效保证其中益生菌的存活率。
表3不同益生菌颗粒在人工胃液中处理后菌体存活率对比结果表
2)肠溶性能研究
配制人工肠液,，将4种益生菌颗粒置入肠液，放入恒温摇床，37℃条件下180r/min振荡1h，每20min取样计算菌体存活率，结果如表4所示，可见颗粒1、颗粒2和颗粒3经过人工肠液处理，可以有效保证其中益生菌的存活率。
表4不同益生菌颗粒在人工肠液中处理后菌体存活率对比结果表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。