和本申请一起提交的电子递交序列表(“sequencelisting.txt，5,136字节，2011年7月20日创建”)的内容以其整体通过引用并入本文。
本发明涉及经分离微生物以及其菌株和突变体、生物质、微生物油、组合物和培养物；生产微生物油、生物质和突变体的方法；和使用经分离微生物、生物质、培养物和微生物油的方法。
背景技术
基于碳链的长度和饱和特征，将脂肪酸分类。基于链中存在的碳数目，脂肪酸被称为短链、中等长度链或长链脂肪酸；当碳原子之间不存在双键时称为饱和脂肪酸，当存在双键时被称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，当存在多于一个双键时，是多不饱和的。
基于脂肪酸的甲基端的第一个双键的位置，将多不饱和脂肪酸(pufa)分类：ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处含有第一个双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处含有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“dha”)是具有22个碳的链长度和6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(lc-pufa)，通常命名为“22:6n-3”。其他ω-3lc-pufa包括二十碳五烯酸(“epa”)，命名为“20:5n-3”、ω-3二十二碳五烯酸(“dpan-3”)，命名为“22:5n-3”。dha和epa已被称作“基本”脂肪酸。ω-6lc-pufa包括花生四烯酸(“ara”)，命名为“20:4n-6”和ω-6二十二碳五烯酸(“dpan-6”)，命名为“22:5n-6”。
由于位于细胞膜中，ω-3脂肪酸是影响细胞生理功能的重要的生物学分子，它能调节生物活性化合物的产生与基因表达，并起到生物合成底物的作用。roche,h.m.,proc.nutr.soc.58:397-401(1999)。例如，dha在人类大脑皮层中构成约15％至20％的脂质，在视网膜中构成30％至60％的脂质，在睾丸与精子中富集，并且是母乳中的一个重要组分。bergé,j.p.和barnathan,g..adv.biochem.eng.biotechnol.96:49-125(2005)。dha在脑中构成至多97％的ω-3脂肪酸，且在视网膜中构成至多93％的ω-3脂肪酸。此外，dha是胎儿与婴儿发育以及维持成人认知功能所必需的。(参考文献同上。)因为在人体中无法从头合成ω-3脂肪酸，因此这些脂肪酸必须从营养来源获取。
亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有ερα、dha、dpa或ara，但却含有亚麻酸(c18:3n-3)，其是使机体能够制造epa的一种结构单元。然而有证据显示代谢转换的速率缓慢且多变，特别在健康不佳的那些个体中。根据具体的种及其饮食，鱼油在脂肪酸组成的类型与水平方面存在显著的差异。例如，与野生鱼类相比，水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。此外，鱼油具有含环境污染物的风险，并且可能与稳定性问题和鱼的腥臭或味道有关。
破囊壶菌是破囊壶菌目(thraustochytriales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(schizochytrium)与破囊壶菌属(thraustochytrium)的成员，并且已经确认为包括dha与epa在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。参见第5130242号美国专利。与相应的鱼油或微藻油相比，由这些海生异营性微生物所生产的油通常具有较简单(simpler)的多元不饱和脂肪酸谱(profiles)。lewis,t.e.,mar.biotechnol.1:580-587(1999)。已报导破囊壶菌种的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占很高的百分比。第5130242号美国专利；huang,j.等的j.am.oil.chem.soc.78:605-610(2001)；huang,j.等的mar.biotechnol.5:450-457(2003)。然而，分离的破囊壶菌在所生产的lc-pufa的种类和量方面不同，这使得一些先前所述的菌株在培养中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或会表现低的生产力。因此，一直存在对展现出高生产力和所期望的lc-pufa分布的微生物的分离的需求。
技术实现要素：
本发明涉及以atcc登录号pta-10212保藏的种的经分离的微生物。
本发明涉及具有以atcc登录号pta-10212保藏的种的特征的经分离的微生物。
本发明涉及包含下述18srrna的经分离的微生物，所述18srrna包含seqidno:1多核苷酸序列或与seqidno:1具有至少94％同一性的多核苷酸序列。
本发明涉及包含18srrna多核苷酸序列的经分离的微生物，所述18srrna多核苷酸序列与以atcc登录号pta-10212保藏的微生物的18srrna多核苷酸序列具有至少94％同一性。
本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计超过约10％的二十碳五烯酸。
本发明涉及具有以atcc登录号pta-10208保藏的种的特征的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计超过约10％二十碳五烯酸。
本发明涉及生产甘油三酯组分的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的二十碳五烯酸含量为以重量计至少约12％。
在一些实施方式中，本发明的经分离的微生物是突变菌株。
本发明涉及以atcc登录号pta-10212、pta-10213、pta-10214、pta-10215、pta-10208、pta-10209、pta-10210或pta-10211保藏的经分离的微生物。
本发明涉及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的生物质。
本发明涉及分离的生物质，其中以重量计生物质干细胞重量的至少约20％是脂肪酸，其中以重量计脂肪酸的超过约10％是二十碳五烯酸，且其中脂肪酸包含以重量计各低于约5％的花生四烯酸和二十二碳五烯酸n-6。在一些实施方式中，以重量计脂肪酸的至少约25％是二十二碳六烯酸。
在一些实施方式中，本发明涉及包含甘油三酯的分离的生物质，其中以重量计甘油三酯的至少约12％是二十碳五烯酸。
在一些实施方式中，本发明涉及本发明的分离的生物质的任何一种，其中脂肪酸还包含以重量计各低于约5％的油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸和芥酸。
本发明涉及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的分离的培养物。
本发明涉及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物或生物质的任一种或其混合物的食用产品、化妆品或药物组合物。
本发明涉及下述微生物油，所述微生物油包含以重量计至少约20％的二十碳五烯酸和以重量计各低于约5％的花生四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸和十八碳四烯酸的。在一些实施方式中，微生物油还包含以重量计至少约25％的二十二碳六烯酸。
发明涉及下述微生物油，所述微生物油包含以重量计至少约10％的甘油三酯组分，其中甘油三酯组分中以重量计至少约12％的脂肪酸是二十碳五烯酸，其中甘油三酯组分中以重量计至少约25％的脂肪酸是二十二碳六烯酸，和其中甘油三酯组分中以重量计低于约5％的脂肪酸是花生四烯酸。
本发明涉及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物油的任一种的食用产品、化妆品或药物组合物。在一些实施方式中，食用产品是婴幼儿配方。在一些实施方式中，婴幼儿配方适于早产儿。在一些实施方式中，食用产品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方式中，食用产品是非人类动物或人类产品的添加剂。在一些实施方式中，食用产品是营养补充剂。在一些实施方式中，食用产品是动物饲料。在一些实施方式中，动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，动物饲料是家养动物饲料、动物园动物饲料、耕畜饲料、家畜饲料或其组合。
本发明涉及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括：在培养物中培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物以生产包含ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述方法还包括提取油。
本发明涉及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括从本发明的生物质的任一种中提取包含ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，使用有机溶剂提取方法(例如己烷提取)来提取微生物油。在一些实施方式中，使用无溶剂提取方法来提取微生物油。
本发明涉及由本发明的方法生产的微生物油。
本发明涉及用于生产本发明的生物质的方法，其包括：在培养物中培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物以生产生物质。
本发明涉及由本发明的方法生产的生物质。
本发明涉及用于生产本发明的突变菌株的方法，其包括：对本发明的微生物的任一种进行诱变处理并分离突变菌株。
本发明涉及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用于制造治疗炎症或其相关病况(condition)的药物的用途。
本发明涉及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用于治疗炎症或其相关病况的用途。
本发明涉及用于治疗炎症或其相关病况的本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物。
本发明涉及用于治疗需要的个体的炎症或其相关病况的方法，其包括给个体施用本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物和药学上可接受的载体。
本发明涉及经分离的微生物以及其菌株和突变体，以及其生物质、微生物油、组合物和培养物。本发明涉及从本发明的微生物生产微生物油、生物质和突变体的方法和使用微生物、生物质和微生物油的方法。本文描述的微生物是高生产力的并产生独特的脂肪酸谱，所述脂肪酸谱部分特征为高水平的ω-3脂肪酸，特别是高水平的epa。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种微生物油，其包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，其中二十碳五烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约19％至约55％，且二十二碳六烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约35％至约71％。
2.根据项1所述的油，其中所述二十碳五烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约19％至约43％，且所述二十二碳六烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约35％至约47％。
3.根据项1所述的油，其中所述二十碳五烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约27％至约54％，且所述二十二碳六烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约36％至约63％。
4.根据项1所述的油，其中所述二十碳五烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约26％至约38％，且所述二十二碳六烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约52％至约64％。
5.根据项1所述的油，其中所述二十碳五烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约28％至约36％，且所述二十二碳六烯酸的量为以重量计占二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约54％至约62％。
6.根据项1-5任一项所述的油，其中所述油包含每克油从约120mg至约220mg的二十碳五烯酸和每克油从约240mg至约450mg的二十二碳六烯酸。
7.根据项1-5任一项所述的油，其中所述油包含每克油从约130mg至约195mg的二十碳五烯酸和每克油从约320mg至约480mg的二十二碳六烯酸。
8.根据项1-5任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸还包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约0％至约10％量的二十二碳五烯酸。
9.根据项8所述的油，其中所述油包含每克油约150mg至约300mg的二十碳五烯酸；每克油从约200mg至约400mg的二十二碳六烯酸；和每克油从约0至约55mg的二十二碳五烯酸。
10.根据项1-9任一项所述的油，其中所述油由裂殖壶菌属种生产。
11.根据项任一项所述的油1-10，其中所述油包含以重量计各少于约5％的花生四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸和十八碳四烯酸。
12.根据项1-11任一项所述的油，其中所述油包含以重量计至少约10％的甘油三酯组分，其中所述甘油三酯组分中以重量计至少约12％的脂肪酸是二十碳五烯酸，其中所述甘油三酯组分中以重量计至少约25％的脂肪酸是二十二碳六烯酸和其中所述甘油三酯组分中以重量计少于约5％的脂肪酸是花生四烯酸。
13.一种包含ω-3多不饱和脂肪酸的微生物油，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，和以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约0％至约2％量的二十二碳五烯酸；其中以重量计二十碳五烯酸的量为二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约10％至约25％，以重量计二十二碳六烯酸的量为二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量的从约75％至约90％。
14.根据项13所述的油，其中所述油包含每克油为从约55mg至约150mg的二十碳五烯酸；每克油为从约410mg至约540mg的二十二碳六烯酸和每克油为从约0至约12mg的二十二碳五烯酸。
15.根据项1-6和8-13任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约400mg。
16.根据项1-6和8-13任一项所述的油，其中所述二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量为每克油约400mg。
17.根据项1-14任一项所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油从约400mg至约750mg。
18.根据项任一项1-14所述的油，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约500mg。
19.根据项任一项1-14所述的油，其中所述二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸总量为每克油约500mg。
20.根据项1-19任一项所述的油，其中所述油具有以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的选自1:1至1:1.5、1:1至1:2、1:1.5至1:2、1:1至1:2.5、1:2至1:2.5和1:4至1:7的epa:dha比率。
21.一种口服剂型，其包含根据项1-20任一项所述的油。
发明详述
本发明涉及经分离的微生物及由其所衍生的菌株。由本发明的经分离的微生物所“衍生”的菌株可以是天然衍生的或人工衍生的，比如突变体、变体或重组菌株。本文中使用时，术语“分离的”并不一定反映分离物已被纯化的程度，而是指从天然形式或天然环境中分离(isolation)或隔离(separation)。分离物可包括但不限于分离的微生物、分离的生物质、分离的培养物、分离的微生物油及分离的序列(比如本文中所公开的分离的多核苷酸序列)。本文中使用时，术语“微生物”包括但不限于术语“微藻”、“破囊壶菌”及与本文中所述的任一种保藏微生物相关的分类学分类。与本发明的任一种微生物(包括本文中所述的保藏微生物)相关时所用的术语“破囊壶菌目”(“thraustochytriales”)、“破囊壶菌”(“thraustochytrid”)、“裂殖壶菌属”(“schizochytrium”)及“破囊壶菌属”(“thraustochytrium”)基于囊括可获得的系谱信息的当前分类学分类，并且在本申请递交日后修订分类学分类的情况下不意图其限制作用。
在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10212保藏的种的经分离的微生物。与atcc登录号pta-10212相关的分离的微生物在本文中也称为破囊壶菌属种(thraustochytriumsp.)atccpta-10212。与atcc登录号pta-10212相关的经分离的微生物是在布达佩斯条约(budapesttreaty)下于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(manassas)大学大道(universityboulevard)10801号的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的专利保藏库(patentdepository)。在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10212保藏的经分离的菌株。在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10212保藏的经分离的菌株。
在一些实施方式中，本发明涉及具有以atcc登录号pta-10212保藏的种的特征的经分离的微生物或由其所衍生的菌株。以atcc登录号pta-10212保藏的种的特征可以包括其生长性质与表型性质(表型性质的例子包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(比如干重和脂质谱)、其基因序列及其组合，其中所述特征使这些种区别于先前鉴定过的种。在一些实施方式中，本发明涉及具有以atcc登录号pta-10212保藏的种的特征的经分离的微生物，其中所述特征包括：包含seqidno:1的多核苷酸序列或与seqidno:1的同一性为至少94％、95％、96％、97％、98％或99％的多核苷酸序列的18srrna，以atcc登录号pta-10212保藏的种的形态学性质与繁殖性质，以及以atcc登录号pta-10212保藏的种的脂肪酸谱。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以atcc登录号pta-10212保藏的微生物基本相同的生长特征。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以atcc登录号pta-10212保藏的微生物基本相同的生长性质。在一些实施方式中，本发明涉及经分离的微生物，其包含具有seqidno:1的多核苷酸序列或与seqidno:1的同一性为至少94％、95％、96％、97％、98％或99％的多核苷酸序列的18srrna。在一些实施方式中，本发明涉及经分离的微生物，其包含与以atcc登录号pta-10212保藏的微生物的18srrna多核苷酸序列的同一性为至少94％的18srrna多核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10212保藏的微生物的突变菌株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是以atcc登录号pta-10213、pta-10214或pta-10215保藏的菌株。与atcc登录号pta-10213、pta-10214及pta-10215相关的微生物是在布达佩斯条约(budapesttreaty)下于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(manassas)大学大道(universityboulevard)10801号的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的专利保藏库(patentdepository)。
在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的种的经分离的微生物。与atcc登录号pta-10208相关的分离的微生物在本文中也称为裂殖壶菌属种(schizochytriumsp)atccpta-10208。与atcc登录号pta-10208相关的微生物是在布达佩斯条约(budapesttreaty)下于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(manassas)大学大道(universityboulevard)10801号的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的专利保藏库(patentdepository)。在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的经分离的菌株。
在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计超过约10％、超过约11％、超过约12％、超过约13％、超过约14％、超过约15％、超过约16％、超过约17％、超过约18％、超过约19％或超过约20％的epa。在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％或约20％至约30％的epa。
在一些实施方式中，本发明涉及具有以atcc登录号pta-10208保藏的种的特征的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计超过约10％的二十碳五烯酸。以atcc登录号pta-10208保藏的微生物的特征包括其生长性质与表型性质(表型性质的例子包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(比如干重和脂质谱)、其基因序列及其组合，其中所述特征使这些种区别于先前鉴定过的种。在一些实施方式中，本发明涉及具有以atcc登录号pta-10212保藏的种的特征的经分离的微生物，其中所述特征包括：包含seqidno:2的多核苷酸序列的18srrna，以atcc登录号pta-10208保藏的种的形态学性质与繁殖性质，以及以atcc登录号pta-10208保藏的种的脂肪酸谱。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以atcc登录号pta-10208保藏的那些微生物基本相同的物理和化学性质。
在一些实施方式中，本发明涉及以atcc登录号pta-10208保藏的微生物的突变菌株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是以atcc登录号pta-10209、pta-10210或pta-10211保藏的菌株。与atcc登录号pta-10209、pta-10210和pta-10211相关的微生物是在布达佩斯条约(budapesttreaty)下于2009年9月25日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(manassas)大学大道(universityboulevard)10801号的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的专利保藏库(patentdepository)。
在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的epa含量为以重量计至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的epa含量为以重量计约12％至约55％、约12％至约50％、约12％至约45％、约12％至约40％、约12％至约35％、约12％至约30％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％或约20％至约30％。
在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物的突变体、变体或重组体，其中甘油三酯组分的epa含量为以重量计至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物的突变体、变体或重组体，其中甘油三酯组分的epa含量为以重量计约12％至约55％、约12％至约50％、约12％至约45％、约12％至约40％、约12％至约35％、约12％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％或约20％至约30％。可以通过公知的程序来产生突变菌株。常用的程序包括辐射、高温处理及用诱突变剂处理。变体菌株可以是本文中所述物种的其它天然存在的分离株和/或亚分离株。可以通过分子生物学中用于表达外源基因或改变内源基因的功能或表达的任何公知的方法来产生重组菌株。在一些实施方式中，突变体、变体或重组菌株比野生型菌株生产更高量的ω-3脂肪酸(特别是epa)。在一些实施方式中，突变体、变体或重组菌株生产较低量的一种或多种脂肪酸，比如较低量的dha、ara、dpan-6或其组合。在一些实施方式中，突变体、变体或重组菌株比野生型菌株每升培养物产生更大的细胞干重。这种突变体、变体或重组菌株是由本发明的分离的微生物所衍生的菌株的例子。
在一些实施方式中，本发明的分离的微生物(包括其突变体、变体或重组体)在由该微生物所分离的一种或多种组分中包含脂肪酸谱。由该微生物所分离的一种或多种组分包括总脂肪酸组分、甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)及其组合。特定组分的脂肪酸谱可包括与本文中所公开的特定组分相关联的任一种脂肪酸谱。
本发明涉及生产突变体的方法，其包括对本发明的任一种微生物进行诱变处理并分离突变菌株。
本发明涉及下述培养物，其包含本发明的一种或多种分离的微生物。用于接种、生长和回收微生物区系(比如微藻与破囊壶菌)的各种发酵参数在本领域中是已知的。见美国专利no.5130242，所述参考文献以其整体通过引用并入本文。液态或固态培养基可以含有天然海水或人造海水。异营性生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸钠和甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有机氮源、麸胺酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵及硝酸铵。
用于培养以atcc登录号pta-10212保藏的微生物的典型培养基在表1中示出：
表1：pta-10212器皿培养基
高压灭菌后(金属)
高压灭菌后(维生素)
高压灭菌后(碳)
甘油g/l30.05-150,10-100或20-50
氮原料：
成分浓度
msg·1h2og/l170-150,10-100或15-50
典型的培养条件包括下述条件：
在一些实施方式中，以atcc登录号pta-10212保藏的微生物或其突变体、变体或重组体异养地在作为碳源的甘油上生长，而不在作为碳源的葡萄糖上生长。
用于培养以atcc登录号pta-10208保藏的微生物的典型的培养基在表2中示出：
表2：pta-10208器皿培养基
高压灭菌后(金属)
高压灭菌后(维生素)
硫胺mg/l9.750.1-100,1-50或5-25
ca1/2-泛酸盐mg/l3.330.1-100,0.1-50或1-10
生物素mg/l3.580.1-100,0.1-50或1-10
高压灭菌后(碳)
葡萄糖g/l30.05-150,10-100或20-50
氮原料：
成分浓度
nh4ohml/l23.60-150,10-100或15-50
典型的培养条件包括下述条件：
在一些实施方式中，培养基包含以饱和水平的百分比表示的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的溶解氧。在一些实施方式中，培养基包含以饱和水平的百分比表示的约0.1％至约2％、约0.1％至约5％、约0.1％至约10％、约0.1％至约20％、约0.1％至约30％、约0.1％至约50％、约0.1％至约100％、约5％至约10％、约5％至约20％、约5％至约30％、约5％至约50％、约5％至约100％、约7％至约10％、约7％至约20％、约7％至约30％、约7％至约50％、约7％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约50％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约50％或约20％至约100％的溶解氧。
本发明涉及本发明的微生物的分离的生物质。本发明的分离的生物质是通过分离生物质的任何常规方法获得的收获的细胞生物质，所述常规方法比如在美国专利no.5,130,242和美国申请公布no.2002/0001833中描述，所述参考文献每一篇以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方式中，在约15℃至约30℃下在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约9.5的培养基中培养约6天至约8天后，从每升培养物分离的生物质干细胞重量为至少约10g、至少约15g、至少约20g、至少约25g、至少约30g、至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g或至少约200g。在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5、约ph7、约ph7.5、约ph8.0、约ph8.5、约ph9或约ph9.5的培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃下培养约6天、约7天或约8天后，从每升培养物分离的生物质干细胞重量为至少约10g、至少约15g、至少约20g、至少约25g、至少约30g、至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g或至少约200g。在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约ph9.5的培养基中，在约15℃至约30℃下培养约6天至约8天后，从每升培养物分离的生物质干细胞重量为约10g至约200g。在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5、约ph7、约ph7.5、约ph8.0、约ph8.5、约ph9或约ph9.5的培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃下培养约6天、约7天或约8天后从每升培养物分离的生物质干细胞重量为约10g至约200g、约10g至约100g、约10g至约50g、约15g至约200g、约15g至约100g、约15g至约50g、约20g至约200g、约20g至约100g、约20g至约50g、约50g至约200g或约50g至约100g。在一些实施方式中，分离的培养物不含有聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约ph8.5或约ph6.5至约ph9.5的培养基中，在约15℃至约30℃下培养约6天、约7天或约8天后，分离的培养物具有至少约0.2g/l/天、至少约0.3g/l/天、至少约0.4g/l/天、至少约0.5g/l/天、至少约1g/l/天、至少约1.2g/l/天、至少约1.5g/l/天、至少约1.7g/l/天、至少约2g/l/天、至少约3g/l/天、至少约3.5g/l/天、至少约4g/l/天、至少约4.5g/l/天、至少约5g/l/天、至少约6g/l/天或至少约8g/l/天的ω-3脂肪酸生产力。在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约ph9.5的培养基中在约15℃至约30℃下培养约6天、约7天或约8天后，分离的培养物具有约0.2g/l/天至约20g/l/天、约0.4g/l/天至约20g/l/天、约0.4g/l/天至约2g/l/天、约1g/l/天至约2g/l/天、约1g/l/天至约20g/l/天、约2g/l/天至约15g/l/天、约2g/l/天至约10g/l/天、约3g/l/天至约10g/l/天、约4g/l/天至约9g/l/天、约4g/l/天至约8g/l/天、约4g/l/天至约7g/l/天或约4g/l/天至约6g/l/天的ω-3脂肪酸生产力。
在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约ph8.5或约ph6.5至约ph9.5的培养基中，在约15℃至约30℃下培养约6天、约7天或约8天后，分离的培养物具有至少约0.2g/l/天、至少约0.3g/l/天、至少约0.4g/l/天、至少约0.5g/l/天、至少约0.6g/l/天、至少约0.7g/l/天、至少约0.8g/l/天、至少约0.9g/l/天、至少约1g/l/天、至少约1.2g/l/天、至少约1.5g/l/天、至少约1.7g/l/天、至少约2g/l/天、至少约3g/l/天、至少约4g/l/天或至少约5g/l/天的epa生产力。在一些实施方式中，在包含碳源、氮源和营养素以及约950ppm至约8500ppm氯离子的约ph6.5至约ph8.5或约ph6.5至约ph9.5的培养基中在约15℃至约30℃下培养约6天、约7天或约8天后，epa生产力为约0.2g/l/天至约5g/l/天、约0.2g/l/天至约4g/l/天、约0.2g/l/天至约3g/l/天、约0.2g/l/天至约2g/l/天、约0.2g/l/天至约1g/l/天、约0.2g/l/天至约0.8g/l/天、约0.2g/l/天至约0.7g/l/天、约1g/l/天至约5g/l/天、约1g/l/天至约4g/l/天、约1g/l/天至约3g/l/天或约1g/l/天至约2g/l/天。在一些实施方式中，上述任一epa生产力与上述任一ω-3脂肪酸生产力相关联。在一些实施方式中，培养物还包含约0g/l/天至约5g/l/天、约0g/l/天至约4g/l/天、约0g/l/天至约3g/l/天、约0g/l/天至约2g/l/天、约0g/l/天至约1g/l/天、约0.2g/l/天至约5g/l/天、约0.2g/l/天至约4g/l/天、约0.2g/l/天至约3g/l/天、约0.2g/l/天至约2g/l/天、约0.2g/l/天至约1g/l/天、约1g/l/天至约5g/l/天、约2g/l/天至约5g/l/天、约2g/l/天至约4g/l/天或约2g/l/天至约3g/l/天的dha生产力。在一些实施方式中，dha生产力为低于约5g/l/天、低于约4g/l/天、低于约3g/l/天、低于约2g/l/天、低于约1g/l/天、低于约0.5g/l/天、低于约0.2g/l/天或约0g/l/天。
在一些实施方式中，发酵体积(培养物体积)为至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10,000升、至少约20,000升、至少约50,000升、至少约100,000升、至少约150,000升、至少约200,000升或至少约250,000升。在一些实施方式中，发酵体积为约2升至约300,000升、约2升、约10升、约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10,000升、约20,000升、约50,000升、约100,000升、约150,000升、约200,000升、约250,000升或约300,000升。
在一些实施方式中，本发明涉及包含本发明的脂肪酸谱的分离的生物质。在一些实施方式中，至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的生物质干细胞重量是脂肪酸。在一些实施方式中，大于约20％、大于约25％、大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％、大于约50％、大于约55％或大于约60％的生物质干细胞重量是脂肪酸。在一些实施方式中，以重量计约20％至约55％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约30％至约55％、约30％至约70％、约30％至约80％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约55％至约70％、约55％至约80％、约60％至约70％或约60％至约80％的生物质干细胞重量是脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含作为epa的以重量计超过约10％、至少约12％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约45％的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含作为epa的以重量计约10％至约55％、约12％至约55％、约15％至约55％、约20％至约55％、约20％至约40％或约20％至约30％的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含甘油三酯组分，其中以重量计至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％的甘油三酯组分是epa。在一些实施方式中，生物质包含甘油三酯组分，其中甘油三酯组分的epa含量为以重量计从至少约12％至约55％、约12％至约50％、约12％至约45％、至少约12％至约40％、至少约12％至约35％或至少约12％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、至少约20％至约40％、至少约20％至约35％或约20％至约30％。在一些实施方式中，以重量计生物质干细胞重量的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％或至少约60％为dha。在一些实施方式中，以重量计生物质干细胞重量的约20％至约60％、约25％至约60％、约25％至约50％、约25％至约45％、约30％至约50％或约35％至约50％为dha。在一些实施方式中，生物质包含作为dha的以重量计约10％或更少的、约9％或更少的、约8％或更少的、约7％或更少的、约6％或更少的、约5％或更少的、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的或约1％或更少的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含作为dha的以重量计约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％或约3％至约10％的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质基本上不含dha。在一些实施方式中，生物质包含作为ara的以重量计约0.1％至低于约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至低于约5％、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约0.5％至约1.5％或约1％至约1.5％的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含作为ara的以重量计低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1.5％或更少的、约1％或更少的、约0.5％或更少的、约0.4％或更少的、约0.3％或更少的、约0.2％或更少的或约0.1％或更少的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质基本上不含ara。在一些实施方式中，生物质包含作为dpan-6的以重量计约0.4％至约2％、约0.4％至约3％、约0.4％至约4％、约0.4％至约5％、约0.4％至低于约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约0.5％至低于约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％或约1％至低于约5％的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质包含作为dpan-6的以重量计约5％或更少的、低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1％或更少的、约0.75％或更少的、约0.6％或更少的或约0.5％或更少的脂肪酸。在一些实施方式中，生物质基本上不含dpan-6。在一些实施方式中，生物质包含具有以重量计约5％或更少的、低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的或约2％或更少的油酸(18:1n-9)、亚油酸(18:2n-6)、亚麻酸(18:3n-3)、二十碳烯酸(20:1n-9)、芥酸(22:1n-9)或其组合的脂肪酸。
本发明的分离的生物质的特征与分离的生物质的内源特性或天然特性相关而不是与外源引入的材料相关。在一些实施方式中，分离的生物质不含有聚乙烯吡咯烷酮或不是从含有聚乙烯吡咯烷酮的培养物中分离的。
本发明涉及生产生物质的方法。在一些实施方式中，用于生产本发明的生物质的方法包括在培养物中培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物以生产生物质。本发明涉及通过所述方法生产的生物质。
本发明涉及包含本发明的脂肪酸谱的微生物油。本发明的微生物油是以重量计包含至少约35％的甘油三酯组分的“粗制油”或“精制油”。“粗制油”是从微生物的生物质中提取而没有进行进一步处理的油。“精制油”是用精制、漂白和/或除臭的标准处理方法通过处理粗制油获得的油。见例如，美国专利no.5,130,242，所述参考文献以其整体通过引用并入本文。微生物油还包括本文所描述的“最终油”，其是已经用植物油稀释的精制油。在一些实施方式中，最终油是已经用高油酸的葵花籽油稀释的精制油。当在本文中使用时，术语“微生物”包括但不限于术语“微藻”、“破囊壶菌”以及与本文中所述的任一种保藏微生物相关的分类学分类。与本发明所述保藏微生物的任一种微生物油相关时所用的术语“破囊壶菌目”(thraustochytriales)、“破囊壶菌”(“thraustochytrid”)、“裂殖壶菌属”(schizochytrium)及“破囊壶菌属”(thraustochytrium)是以包括了可获得的系谱信息的目前的分类学分类为基础的，并且在本申请的申请日之后修订分类学分类的情况下不意图其限制作用。
在一些实施方式中，本文所述描述的脂肪酸可以是脂肪酸酯。在一些实施方式中，脂肪酸酯包括ω-3脂肪酸酯、ω-6脂肪酸酯和其组合。在一些实施方式中，脂肪酸酯是dha酯、epa酯或其组合。在一些实施方式中，对本文所述描述的油或其组分进行酯化，以产生包含脂肪酸酯的油或其组分。术语“酯”是指用另一个取代基替换脂肪酸分子的羧酸基中的氢。典型的酯类是本领域技术人员已知的，其相关论述提供于higuchi,t.与v.stella在pro-drugsasnoveldeliverysystems第14卷a.c.s.symposiumseries,bioreversiblecarriersindrugdesign,ed.edwardb.roche,americanpharmaceuticalassociation,pergamonpress,1987和protectivegroupsinorganicchemistry,mcomieed.,plenumpress,newyork,1973中。酯的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、特-丁基、苄基、硝苄基、甲氧基苄基、二苯甲基和三氯乙基。在一些实施方式中，酯是羧酸保护性酯基、具有芳烷基(如苄基、苯乙基)的酯、具有低级烯基(如烯丙基、2-丁稀基)的酯、具有低级烷氧基-低级烷基(如甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基)的酯、具有低级烷酰氧基-低级烷基(如乙酰氧基甲基、三甲基乙酰氧基甲基、1-三甲基乙酰氧基乙基)的酯、具有低级烷氧羰基-低级烷基(如甲氧羰基甲基、异丙氧羰基甲基)的酯、具有羧基-低级烷基(如羧基甲基)的酯、具有低级烷氧基羰氧基-低级烷基(如1-(乙氧基羰氧基)乙基、1-(环己氧基羰氧基)乙基)的酯、具有胺甲酰氧基-低级烷基(如胺甲酰氧基甲基)的酯等。在一些实施方式中，所添加的取代基是直链或环状烃基，如c1-c6烷基、c1-c6环烷基、c1-c6烯基或c1-c6芳基酯。在一些实施方式中，酯是烷基酯，例如甲基酯、乙基酯或丙基酯。在一些实施方式中，在脂肪酸处于纯化或半纯化状态时，将酯取代基添加到游离脂肪酸分子中。或者，在甘油三酯转换为酯时形成脂肪酸酯。
本发明涉及生产微生物油的方法。在一些实施方式中，该方法包括在培养物中生长本发明的任意经分离的微生物或其混合物，以生产包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施方式中，该方法还包括萃取该微生物油。在一些实施方式中，该方法包括从本发明的任一种生物质或其混合物中萃取含有ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施方式中，该方法包括异营性生长分离的微生物，其中培养物包含本文中所述的碳源。该微生物油可以从新采集的生物质萃取得到，或者可以从储存在防止变质的条件下的之前采集的生物质萃取得到。可以使用已知方法来培养本发明的微生物、来从培养物中分离生物质、从生物质中萃取微生物油、以及分析从生物质所萃取的油的脂肪酸谱。参见例如第5130242号美国专利，其通过引用全部并入本文。本发明涉及通过本发明的任一种方法所生产的微生物油。
在一些实施方式中，通过酶萃取法萃取微生物油。在一些实施方式中，通过机械萃取法萃取微生物油。在一些实施方式中，机械萃取法包括下列一步或多步：(1)通过均化器处理经巴氏杀菌的发酵液，从而辅助细胞的裂解和油从细胞中的释放；(2)均化后向发酵液中添加异丙醇，以破坏油和水的乳液；(3)将混合物离心，以回收油相；及(4)添加抗氧化剂并在真空中干燥。在一些实施方式中，将粗制油纯化。在一些实施方式中，粗制油的纯化包括下列一步或多步：(1)将粗制油泵入精制槽中并加热该油，接着在混合下添加酸溶液；(2)在酸处理后，向油中添加苛性碱溶液；(3)再次加热粗制油然后离心，以将重相与精制油分离；(4)通过使用例如酸、
在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约0％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％或至少约5％的甾醇酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约0％至约1.5％、约0％至约2％、约0％至约5％、约1％至约1.5％、约0.2％至约1.5％、约0.2％至约2％或约0.2％至约5％的甾醇酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约5％或更少的、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1％或更少的、约0.5％或更少的、约0.3％或更少的、约0.2％或更少的、约0.5％或更少的、约0.4％或更少的、约0.3％或更少的或约0.2％或更少的甾醇酯组分。
在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％的甘油三酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约35％至约98％、约35％至约90％、约35％至约80％、约35％至约70％、约35％至约70％、约35％至约65％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约55％、约40％至约50％、约65％至约95％、约75％至约95％、约75％至约98％、约80％至约95％、约80％至约98％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％、约95％、约97％或约98％的甘油三酯组分。
在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％的甘油二酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约15％至约40％、约15％至约35％或约15％至约30％的甘油二酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％的1,2-甘油二酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约0.2％至约45％、约0.2％至约30％、约0.2％至约20％、约0.2％至约10％、约0.2％至约5％、约0.2％至约1％、约0.2％至约0.8％、约0.4％至约45％、约0.4％至约30％、约0.4％至约20％、约0.4％至约10％、约0.4％至约5％、约0.4％至约1％、约0.4％至约0.8％、约0.5％至约1％、约0.5％至约0.8％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％或约15％至约25％的甘油二酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约2.5％或至少约3％的1,3-甘油二酯组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％或至少约5％的甾醇组分。
在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约0.3％至约5％、约0.3％至约2％、约0.3％至约1.5％、约0.5％至约1.5％、约1％至约1.5％、约0.5％至约2％、约0.5％至约5％、约1％至约2％或约1％至约5％的甾醇组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约5％或更少的、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1.5％或更少的或约1％或更少的甾醇组分。
在一些实施方式中，微生物油包含以重量计至少约2％、至少约5％或至少约8％的磷脂组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计约2％至约25％、约2％至约20％、约2％至约15％、约2％至约10％、约5％至约25％、约5％至约20％、约5％至约20％、约5％至约10％或约7％至约9％的磷脂组分。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计低于约20％、低于约15％、低于约10％、低于约9％或低于约8％的磷脂组分。在一些实施方式中，微生物油基本上不含磷脂。在一些实施方式中，微生物油包含以重量计油的低于约2％、低于约1.5％、低于约1％或低于约0.5％的不皂化物。在微生物油中存在的脂质种类，比如甘油三酯组分可通过快速层析分离并通过薄层色谱(tlc)分析，或通过本领域中已知的其他方法分离和分析。
在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计至少约5％、至少约10％、超过约10％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约45％的epa。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、至少约12％至约55％、至少约12％至约50％、至少约12％至约45％、至少约12％至约40％、至少约12％至约35％或至少约12％至约30％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约15％至约25％、约15％至约20％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％或约20％至约30％的epa。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的dha。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约5％至约60％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约40％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约60％、约25％至约60％、约25％至约50％、约25％至约45％、约30％至约50％、约35％至约50％或约30％至约40％的dha。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约10％或更少的、约9％或更少的、约8％或更少的、约7％或更少的、约6％或更少的、约5％或更少的、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的或约1％或更少的dha。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含作为dha的以重量计约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％或约3％至约10％的脂肪酸。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分基本上不含dha。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约0.1％至约5％、约0.1％至低于约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至约5％、约0.2％至低于约5％、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约0.5％至约1.5％或约1％至约1.5％的ara。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约5％或更少的、低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1.5％或更少的、约1％或更少的、约0.5％或更少的、约0.4％或更少的、约0.3％或更少的、约0.2％或更少的或约0.1％或更少的ara。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分基本上不含ara。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约0.4％至约2％、约0.4％至约3％、约0.4％至约4％、约0.4％至约5％、约0.4％至低于约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约0.5％至低于约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％或约1％至低于约5％的dpan-6。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含以重量计约5％、低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的、约2％或更少的、约1％或更少的、约0.75％或更少的、约0.6％或更少的或约0.5％或更少的dpan-6。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分基本上不含dpan-6。在一些实施方式中，微生物油和/或选自甘油三酯组分、甘油二酯组分、甾醇组分、甾醇酯组分、游离脂肪酸组分、磷脂组分和其组合的其一种或多种组分，包含下述脂肪酸，所述脂肪酸具有以重量计约5％或更少的、低于约5％、约4％或更少的、约3％或更少的或约2％或更少的油酸(18:1n-9)、亚油酸(18:2n-6)、亚麻酸(18:3n-3)、二十碳烯酸(20:1n-9)、芥酸(22:1n-9)、十八碳四烯酸(18:4n-3)或其组合。
甘油三酯分子含有3个中心碳原子(c(sn-1)h2rl-(sn-2)h2r2-c(sn-3)h2r3)，使得可以形成不同的位置异构体。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％或至少约40％的甘油三酯在选自sn-1、sn-2及sn-3位置的任意两者的甘油三酯中二个位置上含有dha(双取代的dha)。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的约2％至约55％、约2％至约50％、约2％至约45％、约2％至约40％、约2％至约35％、约2％至约30％、约2％至约25％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约20％至约40％、约20％至约35％、或约20％至约25％的甘油三酯在选自sn-1、sn-2或sn-3位置的任意两者的甘油三酯中二个位置上含有epa。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％的甘油三酯在所有sn-1、sn-2及sn-3位置上皆含有dha(三取代dha)。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的约0.5％至约5％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约2％、约1％至约5％、约1％至约3％、或约1％至约2％的甘油三酯在所有sn-1、sn-2及sn-3位置上皆含有dha。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少约60％的甘油三酯在选自sn-1、sn-2或sn-3位置中的任意一个的甘油三酯中的一个位置上含有dha。在一些实施方式中，微生物油包含甘油三酯组分，其中基于hplc色谱上的峰的相对面积百分比，甘油三酯组分中的约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约15％至约80％、约15％至约75％、约15％至约70％、约15％至约65％、约15％至约60％、约35％至约80％、约35％至约75％、约35％至约65％、约35％至约60％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％或约40％至约55％的甘油三酯在选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任意一个的甘油三酯中的一个位置上含有dha。
在一些实施方式中，微生物油包含脂肪酸，其中脂肪酸还包含ω-3多不饱和脂肪酸，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约28％至约36％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约54％至约62％。
在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约19％至约55％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约35％至约71％。
在其他实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约19％至约43％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约35％至约47％。
在进一步的实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约27％至约54％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约36％至约63％。
还在进一步的实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约26％至约38％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约52％至约64％。
还在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约10％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约19％至约55％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约35％至约71％。
还在进一步的实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约10％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约19％至约43％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约35％至约47％。
还在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约10％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约27％至约54％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约36％至约63％。
在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约10％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约26％至约38％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约52％至约64％。
在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约10％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约28％至约36％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约54％至约62％。
还在另一实施方式中，微生物油包含ω-3多不饱和脂肪酸，所述ω-3多不饱和脂肪酸包含以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的约≥90％量的dha和epa以及以重量计占ω-3多不饱和脂肪酸总量的从约0％至约2％量的dpan-3，其中以重量计epa的量为dha和epa总量的从约10％至约25％，以重量计dha的量为dha和epa总量的从约75％至约90％。
在一些实施方式中，微生物油中的ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约400mg。
在其他实施方式中，微生物油中的ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约500mg。
仍在进一步的实施方式中，微生物油中的ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油从约400mg至约750mg。
在一些实施方式中，微生物油包含每克油从约120mg至约220mg的epa和每克油从约240mg至约450mg的dha。
在一些实施方式中，微生物油包含每克油从约120mg至约220mg的epa和每克油从约240mg至约450mg的dha。
在其他实施方式中，微生物油包含每克油从约130mg至约195mg的epa和每克油从约320mg至约480mg的dha。
在进一步的实施方式中，微生物油包含每克油从约150mg至约300mg的epa；每克油约200mg至约400mg的dha；和每克油从约0至约55mg的dpan-3。
还在进一步的实施方式中，微生物油包含每克油从约50mg至约150mg的epa；每克油约410mg至约540mg的dha；和每克油约0至约12mg的dpan-3。
在一些实施方式中，微生物油具有以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的1:1至1:30或1:1至1:3的epa:dha比率。
在一些实施方式中，微生物油具有以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的1:1至1:2.5的epa:dha比率。
在另一实施方式中，微生物油具有以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的1:4至1:7的epa:dha比率。
在一些实施方式中，微生物油具有以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:2.5、至少1:3或至少1:4的epa:dha比率。可在这些值的任何值之间选择有用的范围，所述值例如，以重量计总ω-3多不饱和脂肪酸的1:1至1:1.5、1:1至1:2、1:1.5至1:2、1:1至1:2.5、1:2至1:2.5和1:4至1:7的epa:dha比率。
在进一步的实施方式中，微生物油由裂殖壶菌属种(schizochytriumsp)生产。
本发明涉及包含本发明的微生物、本发明的分离的生物质、本发明的微生物油或其组合的组合物。
基于该组合物的要求，还可以通过任何已知的技术将本发明的微生物、生物质或微生物油进行化学改性或物理改性或加工。
在用于组合物中之前，可以通过下述方法将微生物细胞或生物质干燥，这些方法包括但不限于冷冻干燥、风干、喷雾干燥、隧道干燥、真空干燥(冷冻真空干燥)及类似的方法。或者，可以不经过干燥直接将收获并清洗过的生物质用于组合物中。见例如美国专利no.5130242和6812009，所述每一篇参考文献以其整体通过引用并入本文。
本发明的微生物油可用作起始材料，来更有效地产生富集脂肪酸(如epa)的产品。例如，可对本发明的微生物油进行本领域中已知的各种纯化技术，比如蒸馏或尿素包合，来生产具有更高的epa浓度或另一种脂肪酸浓度的一种效能更高的产品。本发明的微生物油也可用于化学反应中，来生产从油中的脂肪酸所衍生的化合物，比如epa或另一种脂肪酸的酯与盐。
本发明的组合物可包含一种或多种赋形剂。本文中使用时，“赋形剂”是指用于本发明的组合物中以赋予该组合物所期望特性的组分或组分混合物，该组合物包括食品以及药物组合物、化妆组合物和工业组合物。当添加至药物组合物时，本发明的赋形剂可描述为“药学上可接受的”赋形剂，其含义是，赋形剂是在正确的医学判断范围内适于与人类及非人类动物的组织接触的化合物、材料、组合物、盐及/或剂型，且在与合理的益处/风险比相称的期望的接触期间无过度的毒性、刺激、过敏性反应或其它有问题的并发症。在一些实施方式中，术语“药学上可接受的”指经联邦或州政府的主管机关核准的、或在美国药典或其它公认的国际药典中列出可用于动物，更具体地可用于人类。可使用各种赋形剂。在一些实施方式中，赋形剂可以是但不限于碱剂、稳定剂、抗氧化剂、黏着剂、分离剂、涂布剂、外相组分、控释性组分、溶剂、表面活性剂、保湿剂、缓冲剂、填料、软化剂或其组合。除了本文中所讨论的赋形剂之外，赋形剂还可包括但不限于remington:thescienceandpracticeofpharmacy第21版(2005年)中所列的赋形剂。在本文中将赋形剂归为具体的类别(例如“溶剂”)意图在于阐释而不是限制赋形剂的作用。具体的赋形剂可以属于多个类别。
本发明的组合物包括但不限于食用产品、药物组合物、化妆品及工业组合物。
在一些实施方式中，组合物是食用产品。食用产品是供非人类的动物或人类食用的任何食品，并且包括固态与液态组合物二者。食用产品可以是动物或人类食品中的添加剂。食品包括但不限于一般食品；液体产品包括牛奶、饮料、治疗用饮品和营养饮品；功能性食品；补充剂；保健食品；婴儿配方，包括早产婴儿配方；供怀孕或哺乳妇女用的食品；成人食品；老人食品；以及动物食品。
在一些实施方式中，本发明的微生物、生物质或微生物油可直接用作下述的一种或多种或作为添加剂包含在下述的一种或多种中：油、酥油、涂酱、其它脂肪成分、饮料、酱料、乳制品或豆制品(比如奶、酸奶、奶酪和冰淇淋)、烘焙物、营养品，例如(以胶囊或片剂形式)作为营养补充剂、维生素补充剂、膳食补充剂、粉状饮品及粉状成品或半成品的食用产品。在一些实施方式中，营养补充剂是素食(vegetarian)胶囊形式，所述素食胶囊不是从动物来源中形成的且不含有来自动物来源的任何组分。
可包含本发明的微生物油的食品组合物的部分列表，包括但不限于豆制品(奶、冰淇淋、酸奶、饮品、奶油、涂酱、奶精)；汤与汤配料；面团、面糊及烘培食品产品，所述烘培食品产品包括例如精致糕点制品、早餐谷片、蛋糕、奶酪蛋糕、派、杯子蛋糕(cupcake)、曲奇、棒、面包、卷、比司克面包(biscuit)、松糕、糕饼、司康(scone)、脆面包丁、脆饼干、甜点、点心蛋糕、派、果诺力(granola)/点心棒和烤酥饼(toasterpastries)；糖果；硬质糖果甜点；巧克力和其它糖果甜点；口香糖；液态食用产品，例如牛奶、能量饮品、婴儿配方、碳酸饮品、茶、液体膳食、果汁、基于水果的饮品、基于蔬菜的饮品；多维生素糖浆、代用餐、药用食品及糖浆；粉状饮料配料；面食；加工型鱼产品；加工型肉产品；加工型家禽产品；肉汁酱与酱料；调味料(西红柿酱、美乃滋等)；基于植物油的涂酱；乳制品；酸奶；黄油；冷冻的乳制品；冰淇淋；冷冻甜点；冷冻酸奶；半固态食用产品，比如婴儿食品；布丁与明胶甜点；加工的或未加工的奶酪；松饼；食物棒，包括能量棒；华夫脆饼(waffle)配料；色拉酱；代用蛋配料；坚果与基于坚果的涂酱；加盐零食，比如马铃薯片和其它薄片或松脆物、玉米片、墨西哥玉米片、挤制零食、爆米花、卷条脆饼、炸马铃薯片和坚果；和特制零食，比如沾酱、干果零食、肉类零食、猪皮、健康食物棒和稻米/玉米糕。
在一些实施方式中，本发明的微生物油可用来补充婴儿配方。可单独用本发明的微生物油或与得自生产花生四烯酸(ara)的微生物的物理精制油组合，对婴儿配方进行补充。所述生产ara的微生物，例如高山被孢霉(mortierellaalpina)或舒马克氏抱霉(mortierellasect.schmuckeri)。或者与本发明的微生物油与富含ara的油组合，对婴儿配方进行补充，所述富含ara的油包括
在一些实施方式中，该组合物是动物饲料。“动物”包括属于动物界的非人类生物体，包括但不限于水生动物与陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食品”是指意图用于非人类动物的任何食品，所述非人类动物不限于鱼类；商业鱼；观赏鱼；仔鱼；双壳类；软体动物；介虫；贝类；虾；仔虾；卤虫；轮虫；海虾；滤食性动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家养动物；农场动物；动物园动物；户外动物(sportanimal)；种畜；竞赛动物；表演动物；后嗣动物(heirloomanimal)；稀有动物或濒临灭绝的动物；同伴动物；宠物，比如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类，比如猴类(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、短尾猴和长尾猴)、猿类、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科，比如狗和狼；猫科，比如猫、狮和虎；马科，比如马、驴和斑马；食用动物，比如奶牛、牛、猪和羊；蹄类动物，比如鹿和长颈鹿；啮齿类，比如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、家养动物饲料包括宠物饲料、动物园动物饲料、耕畜饲料、家畜饲料和其组合。
在一些实施方式中，该组合物是其肉或产物供人类消耗的任何动物的饲料或饲料补充剂，所述动物比如取其肉、蛋或乳供人类消耗的任何动物。当饲养此类动物时，营养素比如lc-pufa可被掺入所述动物的肉、乳、蛋或其它产物中，以增加所述营养素的含量。
在一些实施方式中，组合物是可被粉碎以形成被浮游动物、卤虫、轮虫和滤食性动物消耗的适当大小的颗粒的喷雾干燥材料。在一些实施方式中，通过组合物饲养的浮游动物、卤虫、轮虫进而饲养仔鱼、鱼、贝类、双壳类或介虫。
在一些实施方式中，组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括，但不限于，抗炎性组合物、用于治疗冠心病的药物、用于治疗动脉硬化的药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药物、兴奋剂、抗惊厥药、抗幽门螺旋杆菌药、用于治疗神经变性疾病的药、用于治疗退化性肝脏疾病的药物、抗生素、降胆甾醇组合物和降甘油三酯组合物。在一些实施方式中，组合物是医药食物。医药食物包括在在医师的监督下将被消耗或外用施用的组合物中的食物，并意图用于病况的膳食管理，所述病况的独特营养需求是以公认的科学原理为基础由医学评估而建立的。
在一些实施方式中，可将微生物油配制成剂型。该剂型可包括但不限于包含有效量的微生物油的片剂、胶囊、扁囊剂、丹剂、丸剂、粉剂和粒剂；和肠胃外剂型，其包括但不限于溶液、悬液、乳液和干粉。下述也是本领域中已知的：此类配方还可含有药物上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水载剂、水溶性载剂、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、助溶剂、防腐剂等等。施用形式可包括，但不限于含有微生物油和一种或多种合适的药物上可接受的载体的片剂、锭剂、胶囊、囊片和丸剂。对于口服施用，微生物油可与本领域中熟知的药物上可接受的载体组合。此类载体使得本发明的微生物油能被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂悬液等等，用于被待治疗的受试者口服摄取。在一些实施方式中，剂型是片剂、丸剂或囊片。可通过下述来获得用于口服使用的药物制剂：添加固态赋形剂，任选地研磨得到的混合物，并(如果需要的话添加合适的助剂之后)处理颗粒混合物，以获得片剂或锭剂核。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，比如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制剂比如但不限于，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚维酮(pvp)。如果需要的话，可添加崩解剂，比如但不限于，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐比如海藻酸钠。可口服使用的药物制剂，包括但不限于由明胶制成的推入式胶囊以及由明胶和增塑剂(比如甘油或山梨醇)制成的软的密封的胶囊。在一些实施方式中，剂型是素食(vegetarian)剂型，其中剂型不是从动物来源中形成的且不含有来自动物来源的任何组分。在一些实施方式中，素食剂型是素食胶囊。
在一些实施方式中，口服剂型是包含改性玉米淀粉、卡拉胶、甘油、山梨醇、纯净水、β-胡萝卜素和焦糖粉的素食凝胶胶囊。
在一些实施方式中，用下述油配制口服剂型，所述油包含每克油约100mg、约200mg、约300mg约400mg、约500mg、约550mg或约600mg的dha和epa含量。
在一些实施方式中，用下述油配制口服剂型，所述油包含每克油从约300mg至约700mg的dha和epa含量。
在进一步的实施方式中，用下述油配制口服剂型，所述油包含每克油从约360mg至约670mg的dha和epa含量。
在一些实施方式中，用下述油配制凝胶胶囊，所述油包含每克油约100mg、约200mg、约300mg约400mg、约500mg、约550mg或约600mg的dha和epa总含量。
在一些实施方式中，用下述油配制凝胶胶囊，所述油包含每克油从约300mg至约700mg的dha和epa含量。
在进一步的实施方式中，用下述油配制凝胶胶囊，所述油包含每克油从约360mg至约670mg的dha和epa含量。
还在进一步的实施方式中，dha和epa的总量为每克油至少约400mg。
仍还在进一步的实施方式中，ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约400mg。
仍还在进一步的实施方式中，dha和epa的总量为每克油约400mg。
在甚至进一步的实施方式中，dha和epa的总量为每克油至少约500mg。
在甚至进一步的实施方式中，ω-3多不饱和脂肪酸总量为每克油至少约500mg。
在另一实施方式中，dha和epa的总量为每克油约500mg。
在一些实施方式中，组合物是化妆品。化妆品，包括但不限于乳状剂、乳膏剂、洗剂、面膜、肥皂、洗发剂、洗涤物、面霜、调节剂、彩妆品(make-ups)、沐浴剂和分散液。化妆剂可以是药用的或非药用的。
在一些实施方式中，组合物是工业组合物。在一些实施方式中，组合物是一种或多种制造品的起始材料。制造品包括，但不限于，聚合物；摄影感光材料；洗涤剂；工业油或工业洗涤剂。例如，u.s.pat.no.7,259,006描述了使用含dha的脂肪和油生产二十二烷酸，以及使用二十二烷酸生产感光材料。
在一些实施方式中，该组合物可用于治疗人类或非人类动物的病况。在一些实施方式中，该组合物可用于人类或非人类动物的营养品。
术语“治疗(treat)”与“治疗作用(treatment)”是指治疗性治疗与预防性或防止性措施，其中，目标是预防或减缓(减轻)一种不期望的生理病况、疾病或病症，或获得有益或期望的临床结果。就本发明的目的而言，有益的或期望的临床结果，包括但不限于减轻或消除与病况、疾病或病症相关联的症状或症候；减轻病况、疾病或病症的程度；稳定病况、疾病或病症(即，病况、疾病或病症不再恶化)；延迟病况、疾病或病症的发作或恶化；改善该病况、疾病或病症；缓解(不论部分的或全面的以及不论可检测的还是不可检测的)病况、疾病或病症；或增进或改善病况、疾病或病症。治疗作用包括引发临床上显著的反应，而无过多的副作用。治疗作用还包括，较之未接受治疗的预期存活时间而言延长的存活。
在一些实施方式中，该组合物用来治疗病况、疾病或病症，比如青春痘、急性炎症、年龄相关性黄斑部病变、过敏症、阿滋海默氏(alzheimer)症、关节炎、哮喘、动脉粥状硬化、自体免疫性疾病、血脂异常、乳房囊肿、恶病质、癌症、心脏再狭窄、心血管疾病、慢性炎症、冠心病、囊性纤维化、肝脏的退化性疾患、糖尿病、湿疹、胃肠疾患、心脏病、高甘油三酯水平、高血压、多动症、免疫性疾病、抑制肿瘤生长、炎症性病症、肠胃疾病、肾功能障碍、白血病、重郁症、多发性硬化症、神经退化性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、过氧化体疾病、子癫前期、早产、牛皮癣、肺部疾病、类风湿性关节炎、心脏病风险或血栓症。
在一些实施方式中，组合物用来增加第三孕期胎儿的妊娠期长度。
在一些实施方式中，组合物用来控制血压。
在一些实施方式中，组合物用来改善或维护认知功能。
在一些实施方式中，组合物用来改善或维护记忆力。
在一些实施方式中，组合物用来维护健康的心脏。
可通过与组合物或剂型相容的任何途径，将组合物或剂型施用至受试者的体内。如果物质是由受试者引入的体内的，或如果他人、机器或装置将物质引入受试者的体内，则该物质被认为是“施用的(administered)”。因此，“施用(administering)”包括，例如自我施用、由他人施用和间接施用。当在本文中使用时，涉及“施用(administration)”的术语“连续的”或“接连的”，是指施用频率为每日至少一次。然而，应注意到，施用频率可每日多于一次且仍为“连续的”或“接连的”，例如每日二次或甚至三次，只要未超过本文所指定的剂量水平即可。施用的手段与方法是本领域中已知的，并且技术人员可参考各种的药理学参考书以寻求指导。例如可查阅“modernpharmaceutics,”banker&rhodes,informahealthcare,usa,4thed.(2002)；和“goodman&gilman’sthepharmaceuticalbasisoftherapeutics,”mcgraw-hillcompanies,inc.,newyork,10thed.(2001)。
“受试者(subject)”、“个体(individual)”或“患者”是指不论人类还是非人类的任何受试者，期望对所述受试者进行诊断、预后、治疗或施用组合物或剂型。哺乳类动物受试者括但不限于人类；家养动物；农场动物；动物园动物；户外动物(sportanimal)；宠物，比如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类，比如猴类(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、短尾猴和长尾猴)、猿类、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科，比如狗和狼；猫科，比如猫、狮和虎；马科，比如马、驴和斑马；食用动物，比如奶牛、牛、猪和羊；蹄类动物，比如鹿和长颈鹿；啮齿类，比如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。术语受试者还包括模型动物，例如疾病模型动物。在一些实施方式中，术语受试者包括在经济上或其它方面有价值的动物，例如经济上重要的种畜、竞赛动物、展示用动物、后嗣动物、稀有或濒临绝种的动物或同伴动物。在某些实施方式中，受试者是人类受试者。在某些实施方式中，受试者是非人类受试者。
该组合物可依“营养量”、“治疗有效量”、“预防有效量”、“治疗性剂量”或“预防性剂量”施用。“营养量”是指为实现期望的营养结果在必要的剂量和时间周期下有效的量。营养结果可以是，例如受试者中期望的脂肪酸组分水平增加。“治疗有效量”或“治疗性剂量”是指在所需的剂量与时间段情况下有效达到所期望的治疗结果的量。治疗结果可以是，例如减轻症状、延长存活、改善活动性等。治疗结果不一定是“治愈”。“预防有效量”或“预防性剂量”是指在所需的剂量与时间段下有效达到所期望的预防结果的量。通常，由于预防性剂量在疾病之前或在较早期阶段用于个体中，预防有效量将低于用于治疗晚期疾病的治疗有效量。
在待施用于个体的微生物、生物质或微生物油的epa或其它脂肪酸组分的量的基础上，可以将各种剂量的组合物、剂型或药物组合物施用于个体。本文中术语“每日剂量”、“每日剂量水平”及“日剂量”指的是每日(每24小时期间)施用的epa或其它脂肪酸组分的总量。因此，例如，每日将2mg的epa施用于个体，指的是不论epa是以包含2mgepa的单个剂型施用，还是或者以各含0.5mgepa的四个剂型(总共为2mgepa)施用，个体每日收到总共2mg的epa。在一些实施方式中，每日的epa量是以单个剂型或以二个剂型施用。可单次服用或分多次服用本发明的剂型。例如，如果每日服用四片，每片含0.5mg的epa，则可每日一次服用所有四片，或每日分二次各服用2片，或每6小时服用1片。在一些实施方式中，每日剂量是约100mg至约15g的epa。在一些实施方式中，每日剂量是约0.5mg至约250mg、约100mg至约250mg、约100mg至约500mg、约100mg至约1g、约1g至约2.5g、约1g至约5g、约1g至约10g、约1g至约15g、约5g至约10g、约5g至约15g、约10g至约15g、约100mg至约10g、约100mg至约5g或约100mg至约2.5g的epa、dha或其组合物。在一些实施方式中，组合物是每剂型包含约0.5mg至约250mg、100mg至约250毫克、约0.5mg至约500mg、约100mg至约500mg、约0.5mg至约1g或约100mg至约1g的epa、dha或其组合物的一种剂型。
可使用各种方式，来实现本发明的组合物或剂型的施用。例如，在一些实施方式中，接连地每日进行施用，或者隔日进行施用(两日一次)。施用可一天或多天进行。
组合物与剂型的施用可以与用于治疗病况的其它方法组合。例如，本发明的方法可以与饮食疗法(如低碳水化合物饮食、高蛋白质饮食、高纤维饮食等)、运动疗法、减重疗法、戒烟疗法或其组合相结合。本发明的方法也可以与治疗病况的其它药物产品组合使用。本发明的组合物或剂型可以在其它疗法或药物产品之前或之后施用。
本发明涉及含有一个或多个本发明的组合物单位的试剂盒或包装。试剂盒或包装可包括包含本发明的微生物、生物质或微生物油或其组合的食物产品、药物组合物、化妆品或工业组合物单位。试剂盒或包装还可包括包含本发明的微生物、生物质或微生物油或其组合的添加剂，用于制备食物、化妆品、药物组合物或工业组合物。
在一些实施方式中，试剂盒或包装含有根据本发明的方法将被施用的一个或多个药物组合物单位。试剂盒或包装可含有一个剂量单位或多于一个剂量单位(即多个剂量单位)。如果在试剂盒或包装中存在多个剂量单位，任选地可对多个剂量单位安排用于连续施用。
任选地，本发明的试剂盒可含有与试剂盒的单位或剂型关联的说明书。此类说明书可以是管理药物产品的制造、使用或出售的政府机构规定的形式，其内容反映了其被政府机构批准而制造、使用或出售用于人类施用来治疗病况或病症。说明书可以是任何形式，所述形式在根据本发明的方法使用试剂盒中的单位或剂型时传达信息。例如，说明书可以是印刷品形式或预先录制的媒介设备。
在患者检查期间，医学专业人员可确定：本发明的方法之一的施用对患者而言是适当的，或者医师可确定：患者的病况可被本发明的方法之一的施用而改善。在制定任何治疗方案之前，医师可就例如与方案关联的各种风险和益处向患者提供建议。可给患者提供与方案关联的全部已知和可疑风险的充分公开。在一些实施方式中，医师可给患者提供关于方案的文献材料比如产品信息、教育材料等等。
本发明涉及就治疗的方法而言对消费者培训的方法，所述方法包括在销售点就消费者信息而言分配剂型。在一些实施方式中，分配可在有药剂师或医疗服务提供者的销售点处发生。
术语“消费者信息”可包括，但不限于，英语文本、非英语文本、可见图像、图解、电话录制、网站和从现场客户服务代表获得。在一些实施方式中，消费者信息提供了根据本发明的方法使用剂型的指导、适当的使用年龄、适应症、禁忌症、适当配量、警告、电话号码或网址。在一些实施方式中，方法还包括给相关人员提供专业信息，相关人员负责回答消费者的关于根据本发明的方法的所公开方案的使用问题。术语“专业信息”包括但不限于，关于当根据本发明的方法施用时的方案的信息，其设计用来使医学专业人员回答消费者问题。
“医学专业人员”包括，例如医师、医师助理、从业护士、药剂师和客户服务代表。
在一般性地描述本发明之后，可通过参考本文中所提供的实施例来获得进一步的理解。这些实施例仅用于阐释的目的，而并非意图限制。
实施例1
分离微生物
低潮期间，从沿着北美西海岸(加利福尼亚、俄勒冈州和华盛顿)和夏威夷的潮间带栖息地(包括湾和河口)收集样品。将水、沉积物、活的植物材料和腐败的植物/动物碎片放在50ml无菌管中。将每一样品的一部分连同水一起在分离培养基的固体琼脂平板上涂布。分离培养基由下述组成：500ml人造海水、500ml蒸馏水、1g葡萄糖、1g甘油、13g琼脂、1g谷氨酸盐、0.5g酵母提取物、0.5g酪蛋白水解物、1ml维生素溶液(100mg/l硫胺、0.5mg/l生物素、0.5mgb12)、1ml痕量矿物质溶液(pii金属，每升含6.0gfecl36h2o、6.84gh3bo3、0.86gmncl24h2o、0.06gzncl2、0.026cocl26h20、0.052gniso4h2o、0.002gcuso45h2o和0.005gna2moo42h2o)以及各500mg的青霉素g和链霉素硫酸盐。将琼脂平板在20-25℃下在黑暗中孵育。2-4天之后，在放大下检查琼脂平板并用无菌牙签挑取细胞集落并在新的培养基板上再划线。将细胞在新培养基上重复划线直到去除污染的生物体。两种经分离的微生物以atcc登记号pta-10212和pta-10208保藏。
以atcc登记号pta-10212保藏的经分离的微生物的分类学特征
以atcc登记号pta-10212保藏("pta-10212")的经分离的微生物的培养物显现出白色的、湿的、模糊的集落，而没有可见的分离的孢子群。
将pta-10212在固体和液体ffm、固体kmv、kmv淤泥(1％)、kmv发酵液和mh发酵液上生长，以进一步检查生长特征。观察到pta-10212在kmv和mh上快速生长。见，例如，porterd.,1989.phylumlabyrinthulomycota.inmargulis,l.,corliss,j.o.,melkonian,m.,chapman,d.j.(eds.)handbookofprotoctista,jonesandbartlett,boston,pp.388-398(kmv)；hondaetal.,mycol.res.102:439-448(1998)(mh)；和美国专利no.5,130,242(ffm)，所述参考文献以其整体通过引用并入本文。
pta-10212在固体ffm培养基上生长若干天之后，在kmv培养基和mh发酵液中生长72小时之后，得到下述观察结果。孢子囊在任何培养基中/任何培养基上不是丛生的并且非常小(5-10μm)。pta-10212没有展示出schizochytrium分裂型的丰富的四分体特征。在转移至新鲜固体培养基之后，约24小时时显现变形虫样的细胞。这些变形虫样的细胞几天后消失并且在液体或淤泥培养基中是不明显的。和yokoyama,r.etal.,mycoscience48(6):329-341(2007)所述的具有“烧瓶底部上小沙粒”外观的aurantiochytrium不同，当在液体培养基中生长时，pta-10212不沉在烧瓶底部，但悬浮在kmv和mh液体培养基二者中。孢子囊不像典型的schizochytrium或oligochytrium一样密集，所述schizochytrium或oligochytrium还具有pta-10212不具有的强健的细胞外质网络。当大多数种在若干小时期间经历由较大孢子囊分裂(division)而成的小孢子囊或同化细胞无性分裂时，pta-10212形成哑铃状伸长的同化细胞，所述细胞接着形成拉开分离的哑铃端的细峡部。得到的细胞显现为小的同化细胞。没有观察到变形虫样的细胞直接形成哑铃状同化细胞。观察到游泳的典型的双鞭毛游动孢子但相对稀少。通过营养性分裂而分裂的pta-10212不是大量繁殖的。没有观察到直接释放的游动孢子，但观察到游动孢子游泳。营养性细胞非常小(2μm至5μm)。
使用流过技术进一步检查pta-10212，其中通过将一小部分的琼脂-生长集落悬浮于一滴半浓度的海水中，来制备显微镜载玻片。用该技术，观察到初级孢子囊是球形的且直径为大约10μm。壁非常薄，并且当原生质体的二分裂开始时没有观察到残留物。重复的二分裂产生8-16个更小的(直径4-5μm)次级孢子囊。次级孢子囊保持静止若干小时，之后再次释放无定形原生质体。无定形原生质体通过收聚以及拖拉、最初产生典型的哑铃状中间阶段并最终导致直径为2.5-2.8μm的4-8个小球形体，来进行分裂。后者保持若干分钟至最多1-2小时，接着改变形状(伸长的)并成为2.3-2.5×3.7-3.9μm的双鞭毛游动孢子。游动孢子是大量的，并且当它们静止时可对其进行精确测量。游动孢子接着变圆并开始新的发育循环。游动孢子比sicyoidochytriumminutum大并且比ulkeniavisurgensis小。
基于其18srrna基因与已知种的18srrna基因的类似性，将pta-10212进一步表征。通过标准程序制备来自pta-10212的基因组dna。见，例如，sambrookj.和russelld.2001.分子克隆：实验手册(molecularcloning:alaboratorymanual)，第三版。coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork。简而言之：(1)离心来自对数培养中间段的500μl细胞。将细胞再次离心并利用小孔端(small-boretip)从细胞球团去除痕量液体；(2)用200μl裂解缓冲液(20mmtrisph8.0、125μg/ml蛋白酶k、50mmnacl、10mmedtaph8.0、0.5％sds)再悬浮球团；(3)将细胞在50℃下裂解1小时；(4)将裂解混合物吸进相锁定凝胶(plg-eppendorf)2ml管；(5)添加相等体积的p:c:i并混合1.5小时；(6)将管以12,000×g离心5分钟；(7)从plg管中的上述凝胶中去除水相并将相等体积的氯仿添加至水相并混合30分钟；(8)将管以14,000×g离心大约5分钟；(9)将远离氯仿的顶层(水相)吸出并放在新管中；(10)添加0.1体积的3mnaoac并混合(倒转若干次)；(11)添加2体积的100％etoh并与在该阶段形成基因组dna沉淀剂混合(倒转若干次)；(12)将管在微型离心机中4℃下以14,000×g离心大约15分钟；(13)将液体轻轻倒出，基因组dna留在管底部；(14)用0.5ml70％etoh洗涤球团；(15)将管在微型离心机中4℃下以14,000×g离心大约15分钟；(16)将etoh轻轻倒出并干燥基因组dna球团；并(17)将适当体积的h2o和rnase直接添加至基因组dna球团。用先前描述(hondaet.al.,j.euk.micro.46(6):637-647(1999)的引物进行18srrna基因的pcr扩增。用染色体dna模板的pcr条件如下：在50μl总体积中的0.2μmdntps、0.1μm的每一种引物、8％dmso、200ng染色体dna、2.5u
使用上述染色体模板，pcr扩增产生具有期望大小的不同的dna产物。根据制造商的指导，将pcr产物克隆进载体pjet1.2/blunt(fermentas)并使用提供的标准引物测定插入序列。
中等证据(moderatesupport)之下，系统发育分析将pta-10212放在包括thraustochytriumpachydermum和thraustochytriumaggregatum的谱系中。t.pachydermum的孢子囊具有非常厚的细胞壁。t.aggregatum形成清楚可见的不透明的孢子群的丛。pta-10212没有显示这些特征中的一个。已在其他分类群，比如ulkenia,t.gaertnerium,a.limiacinum和s.mangrovei中描述过存在许多变形虫样的细胞；然而，与这些分类群关联的描述不同于对隔离群观察到的特征。而且，pta-10212没有显示对于任何这些分类群的系统发育亲和性。
表3显示来自以atcc登记号pta-10212保藏的微生物的18srrna序列与nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)电子数据库中的dna序列的比较。使用两种不同的算法，测定百分比同一性。“算法#1”考虑来自非同源区域或部分序列的序列中存在的任何“缺口”(alignx-vectornti缺省设定)。“算法#2”不包括针对缺口计算的惩罚(alignx-vectornti"identity"矩阵设定)。
表3：18srrna序列的比较
(p)：表示部分序列
如表3中所示的，从同一性％的角度发现，尽管来自以atcc登记号pta-10212保藏的微生物的18srrna基因序列(seqidno:1)与在ncbi数据库中可得到的18srrna基因序列不相同，但相关。下述是公认的：生物体可具有密切相关的18srrna基因序列而属于不同的属或种。
基于上述特征，以atcc登记号pta-10212保藏的经分离的微生物被认为代表新的thraustochytrium种，并因此也被命名为thraustochytriumsp.atccpta-10212。
以atcc登记号pta-10208保藏的经分离的微生物的分类学特征
以atcc登记号pta-10208保藏("pta-10208")的微生物被鉴定为以atcc登记号pta-9695("pta-9695")保藏的微生物(描述于美国申请no.12/407,687和pct/us2009/001720，所述参考文献每一篇以其整体通过引用并入本文)的亚隔离群(分离自培养物并保存为新的分离的且有区别的培养物的单独细胞)。
pta-10208与pta-9695共享分类学特征。发现pta-9695有发出双鞭毛的游动孢子，所述游动孢子活跃地游动，远离成熟的孢子囊，其中在孢子释放之后壁残留物(在相差显微镜中)清楚可见。测量pta-9695孢子囊直径为12.5μm至25μm，且游动孢子大小为2.5μm至2.8μm×4.5μm至4.8μm。每个单独的pta-9695孢子囊有8至24个孢子。安定的pta-9695游动孢子变大并快速经历二分裂，导致四分体、八分体并最终成为孢子囊簇。孢子囊成熟之前，四分体形成在非常早的阶段开始。这些特征和schizochytrium属一致。从同一性％的角度发现，尽管pta-10208所共有的pta-969518srrna基因序列(seqidno:2)与honda,d.etal.,j.euk.micro.46(6):637-647(1999)中提供的t.aggregatum的18srrna基因序列不同，但密切相关。针对thraustochytriumaggregatum公开的18srrna序列是部分序列，在序列中间有大约71个dna的核苷酸缺口。pta-9695被认为代表新schizochytrium种。同样地，亚隔离群pta-10208被命名为schizochytriumsp.atccpta-10208。
实施例2
以atcc登记号pta-10212保藏的经分离的微生物的生长特征
如下所述的，在单独的发酵运行中，对atcc登记号pta-10212保藏的经分离的微生物检查生长特征。典型的培养基和培养条件在表1中示出。
在22.5℃、ph7.3下有20％溶解氧、1000ppmcl-的进料碳(甘油)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养138小时之后，pta-10212产生26.2g/l的干细胞重量。脂质产率为7.9g/l；ω-3产率为5.3g/l；epa产率为3.3g/l；和dha产率为1.8g/l。脂肪酸含量为按重量计30.3％；epa含量为41.4％的脂肪酸甲酯(fame)；和dha含量为26.2％的fame。在这些条件下，脂质生产力为1.38g/l/天，ω-3生产力为0.92g/l/天，有0.57g/l/天的epa生产力和0.31g/l/天的dha生产力。
在22.5℃、ph7.3下有20％溶解氧、有1000ppmcl-的进料碳(甘油)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养189小时之后，pta-10212产生38.4g/l的干细胞重量。脂质产率为18g/l；ω-3产率为12g/l；epa产率为5g/l；和dha产率为6.8g/l。脂肪酸含量按重量计为45％；epa含量为7.8％的fame；和dha含量为37.9％的fame。这些条件下，脂质生产力为2.3g/l/天，ω-3生产力为1.5g/l/天，有0.63g/l/天的epa生产力和0.86g/l/天的dha生产力。
在ph6.8-7.7、22.5℃下有20％溶解氧、1000ppmcl-的进料碳(甘油)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养189小时之后，pta-10212产生13g/l的干细胞重量。脂质产率为5.6g/l；ω-3产率为3.5g/l；epa产率为1.55g/l；和dha产率为1.9g/l。脂肪酸含量按重量计为38％；epa含量为29.5％的fame；和dha含量为36％的fame。在这些条件下，脂质生产力为0.67g/l/天，ω-3生产力为0.4g/l/天，有0.20g/l/天的epa生产力和0.24g/l/天的dha生产力。
在ph6.6-7.2、22.5-28.5℃下，有1000ppmcl-、20％溶解氧的进料碳(甘油)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养191小时之后，pta-10212产生36.7g/l–48.7g/l的干细胞重量。脂质产率为15.2g/l–25.3g/l；ω-3产率为9.3g/l–13.8g/l；epa产率为2.5g/l–3.3g/l；和dha产率为5.8g/l–11g/l。脂肪酸含量按重量计为42.4％-53％；epa含量为9.8％-22％的fame；和dha含量为38.1％-43.6％的fame。在这些条件下，脂质生产力为1.9g/l/天–3.2g/l/天，ω-3生产力为1.2g/l/天–1.7g/l/天，有0.31g/l/天–0.41g/l/天的epa生产力和0.72g/l/天–1.4g/l/天的dha生产力。
以atcc登记号pta-10208保藏的经分离的微生物的生长特征
如下面所述的，在单独的发酵运行中，对以atcc登记号pta-10208保藏的经分离的微生物检查生长特征。典型的培养基和培养条件在表2中示出。
在22.5℃、ph7.0下的有1000ppmcl-、氮进料期间为20％溶解氧和之后为10％溶解氧的进料碳(葡萄糖)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养200小时之后，pta-10208产生95g/l的干细胞重量。脂质产率为53.7g/l；ω-3产率为37g/l；epa产率为14.3g/l；和dha产率为21g/l。脂肪酸含量按重量计为57％；epa含量为27.7％的fame；和dha含量为39.1％的fame。在这些条件下，脂质生产力为6.4g/l/天，ω-3生产力为4.4g/l/天，有1.7g/l/天的epa生产力和2.5g/l/天的dha生产力。
在22.5℃、ph7.5下的有1000ppmcl-、氮进料期间为20％溶解氧和之后为10％溶解氧的进料碳(葡萄糖)和氮的培养中，在10l发酵罐体积中培养139小时之后，pta-10208产生56g/l的干细胞重量。脂质产率为53g/l；ω-3产率为34g/l；epa产率为11.5g/l；和dha产率为22g/l。脂肪酸含量按重量计为58％；epa含量为21.7％的fame；和dha含量为41.7％的fame。在这些条件下，脂质生产力为9.2g/l/天，ω-3生产力为5.9g/l/天，有2g/l/天的epa生产力和3.8g/l/天的dha生产力。
在22.5℃、ph7.0下的有1000ppmcl-、氮进料期间为20％溶解氧和之后为10％溶解氧的进料碳(葡萄糖)和氮的培养中，在2000l发酵罐体积中培养167小时之后，pta-10208产生93.8g/l的干细胞重量。脂质产率为47.2g/l；ω-3产率为33.1g/l；epa产率为10.5g/l；和dha产率为20.4g/l。脂肪酸含量按重量计为50.6％；epa含量为23％的fame；和dha含量为42.6％的fame。在这些条件下，脂质生产力为6.8g/l/天，ω-3生产力为4.7g/l/天，有1.5g/l/天的epa生产力和2.9g/l/天的dha生产力。
在22.5℃、ph7.0下的有1000ppmcl-、氮进料期间为20％溶解氧和之后为10％溶解氧的进料碳(葡萄糖)和氮的培养中，在2000l发酵罐体积中培养168小时之后，pta-10208产生105g/l的干细胞重量在。脂质产率为46.4g/l；ω-3产率为33g/l；epa产率为10.7g/l；和dha产率为20.3g/l。脂肪酸含量按重量计为43.9％；epa含量为24％的fame；和dha含量为43.7％的fame。在这些条件下，脂质生产力为6.6g/l/天，ω-3生产力为4.7g/l/天，有1.5g/l/天的epa生产力和2.9g/l/天的dha生产力。
在22.5℃、ph7.0下的有1000ppmcl-、氮进料期间为20％溶解氧和之后为10％溶解氧的进料碳(葡萄糖)和氮的培养中，在2000l发酵罐体积中培养168小时之后，pta-10208产生64.8g/l的干细胞重量。脂质产率为38.7g/l；ω-3产率为29.9g/l；epa产率为8.5g/l；和dha产率为16.7g/l。脂肪酸含量按重量计为59.6％；epa含量为23％的fame；和dha含量为42.3％的fame。在这些条件下，脂质生产力为5.53g/l/天，ω-3生产力为3.8g/l/天，有1.2g/l/天的epa生产力和2.3g/l/天的dha生产力。
实施例3
微生物菌株atccpta-10208和pta-10212的脂肪酸谱
对四种生物质样品(pta-10208样品#1；pta-10208样品#2；pta-10212样品#1；和pta-10212样品#2)分析通过溶剂提取的总粗制油含量，通过高效液相色谱/蒸发光散射检测器(hplc/elsd)测定脂质种类，通过hplc/质谱(hplc/ms)分析甘油三酯(tag)，并通过具有火焰离子化检测的气相色谱(gc-fid)测定脂肪酸(fa)谱。使用用溶剂己烷研磨来测定每一冷冻干燥的生物质的粗制脂质含量，并与通过直接酯交换产生的fame之和(mg/g)比较，并通过gc/fid分析来量化产生的脂肪酸甲酯(fame)。还通过酯交换量化在提取的粗制脂质中的脂肪酸，并对产生的fame使用gc/fid分析进行量化。使用具有elsd和常压化学电离-ms(apci-ms)鉴定的正相hplc，测定提取的粗制脂质中的所有中性脂质(nl)和游离脂肪酸(ffa)的重量百分比。所述方法分离并量化甾醇酯(se)、tag、游离脂肪酸(ffa)、1,3-二酰甘油(1,3-甘油二酯，1,3-dag)、甾醇、1,2-二酰甘油(1,2-甘油二酯，1,2-dag)和单酰基甘油(mag)。结果在下面表4和5中示出。
tag和磷脂(pl)分离自从四种生物质样品(pta-10208样品#1；pta-10208样品#2；pta-10212样品#1；和pta-10212样品#2)提取的粗制油。使用低压快速色谱法分离tag，使用固相提取(spe)分离pl。通过薄层色谱法(tlc)确认每一种分离的组分的身份。直接酯交换之后，使用gc-fid，测定分离的tag和pl组分的脂肪酸谱，表示为fame。结果在下面表6和7中示出。
还对来自微生物菌株atccpta-10212(pta-10212样品#3和pta-10212样品#4)的两个额外的生物质样品，测定总粗制油含量和分离的脂质种类的脂肪酸谱。通过己烷提取从每一样品获得粗制油并使用低压快速色谱法分离各单独种类的脂质。使用gc-fid，测定生物质、粗制油和分离的组分的脂肪酸谱，表示为fame。结果在下面表8-11中示出。
从先前使用
使用具有elsd和apci-ms鉴定的正相hplc，从来自微生物菌株atccpta-10208(pta-10208样品#3)的粗制油样品中分离单种类的脂质。
实验程序
粗制油提取–使用溶剂研磨从冷冻干燥的生物质样品中提取粗制油。例如，在swedish管中称大约3克的生物质。将三个球轴承和30ml的己烷添加至swedish管，用氯丁橡胶塞子密封并放在摇床中2小时。使用buchner漏斗和whatman滤纸对产生的淤浆过滤。收集过滤的液体，在真空下去除溶剂，并用重量测量法测定剩余的粗制脂质的量。
脂肪酸分析–对生物质样品、提取的粗制脂质和分离的脂质种类分析其脂肪酸组合物，表示为fame。简而言之，在螺帽试管中直接称冷冻干燥的生物质和分离的脂质种类，同时将粗制油样品溶于己烷以产生大约2mg/ml的浓度。将含有内标物的甲苯和在甲醇中的1.5nhcl添加至每一管。旋转管，盖上帽，并加热至100℃，2小时。将管冷却并添加饱和nacl水。将管再次旋转并离心至使层分离。接着将一部分有机层放在gc小瓶中并通过gc-fid分析。使用nu-check-prepglc参照标准物(nucheck，elysian，mn)产生的3点校准曲线，来量化fame。在提取物中存在的脂肪酸以mg/g和重量百分比表示。当通过gc-fid分析时，假设对内标物有相等响应值，评估样品中的脂肪含量。
hplc/elsd/ms方法–
固相提取–使用放在vacelut装置(varianinc,paloalto,usa)中的2g氨丙基萃取柱(cartridge)(biotage,uppsala,sweden)，通过固相提取(spe)从粗制脂质中分离pl组分。用15ml己烷调节萃取柱使并将约60mg的每一样品溶解在1mlchcl3中并应用至萃取柱。用15ml的2:1的chcl3：异丙醇洗涤柱以洗脱所有的中性脂质，所述中性脂质被丢弃。接着用15ml在醚中的2％乙酸(hoac)洗脱脂肪酸，所述脂肪酸被丢弃。用15ml的6:1的甲醇:氯仿洗脱pl部分，将所述pl部分收集、在氮气下干燥并称重。
快速色谱法–快速色谱法用来分离在粗制油中存在的脂质种类。将溶于己烷的大约200mg的粗制油注入柱头。色谱系统利用硅胶60(emdchemical，gibbstown，nj)，用以5ml/min(表6-7)或3ml/min(表8-13)的含石油醚和乙酸乙酯的流动相。阶梯式梯度用来从柱中选择性洗脱每一种类脂质。流动相梯度从100％石油醚开始并用50％乙酸乙酯结束。使用gilsonfc204大床组分收集器(gilson,inc.,middleton,wi)，将组分收集在10ml试管中。通过薄层色谱法(tlc)分析每一管，并将含有单种类脂质的管(如通过具有预期保留因子(rf)的tlc板上的单点判断的)合并、浓缩至干燥并称重。然后用重量测量法测定总组分含量。
tlc分析–在硅胶板上进行薄层色谱。使用由石油醚：乙基醚：乙酸(80:20:1)组成的溶剂系统洗脱板，并使用碘蒸汽显现。然后将每一点的rf值与每一种类脂质的报道文献值比较。
tag和pl组分的分析–对分离的tag和pl组分分析其脂肪酸组成(表示为脂肪酸甲酯(fame))。将tag组分溶于己烷以产生大约1-2mg/ml的浓度。将1ml等分部分的溶液在氮气下浓缩至干燥。将含有内标物的甲苯和在甲醇中的1.5nhcl添加至每一管。旋转管、盖上帽并加热至100℃，2小时。将内标物和hcl甲醇直接添加至含有pl组分的管并加热。将管冷却并添加饱和nacl水。将管再次旋转并离心以使层分离。然后将一部分有机层放在gc小瓶中并通过gc-fid分析。使用nu-check-prepglc502b参照标准物(nucheck，elysian，mn)产生的3-点校准曲线量化fame。在提取物中存在的脂肪酸以mg/g和fame的％表示。
结果
pta-10208样品#1
使用gc/fid测定pta-10208样品#1的生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱。通过直接在fame管中称28.6mg生物质，原位酯交换生物质中的脂肪酸，而通过在50ml体积烧瓶中称55.0mg粗制脂质并将1ml转移至另外的fame管，制备提取的粗制脂质样品。使用具有fid检测的gc，估计的生物质的粗制脂质含量测定为53.2％(表示为fame的和)，而从干燥生物质中提取了52.0％(wt/wt)脂质，产生97.8％的总脂质回收率。使用gc/fid，粗制脂质测定为91.9％脂肪酸(表示为fame的和)。粗制脂质中含有的主要脂肪酸是c16:0(182.5mg/g)、c20:5n-3(186.8mg/g)和c22:6n-3(423.1mg/g)。
通过在50ml体积烧瓶中称55.0mg粗制脂质并将一个等分部分转移至hplc小瓶用于hplc/elsd/ms分析，测定提取的粗制脂质的脂质种类谱。根据hplc/elsd/ms分析，粗制脂质含有0.2％甾醇酯(se)、95.1％tag、0.4％甾醇和0.5％1,2-二酰甘油(dag)。5％的tag组分包括在tag峰之后直接洗脱的峰，但不能给出可辨认的质谱。
如通过快速色谱法测定的，来自该样品的分离的tag构成大约92.4％的粗制油。在spe分离之后通过重量法或tlc未检测出pl。tag中含有的主要脂肪酸(>50mg/g)为c16:0(189mg/g)、c20:5n-3(197mg/g)和c22:6n-3(441mg/g)。
pta-10208样品#2
使用gc/fid测定pta-10208样品#2的生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱。通过直接在fame管中称32.0mg生物质原位酯交换生物质中的脂肪酸，同时通过在50ml体积烧瓶中称60.1mg粗制脂质并将1ml转移至另外的fame管，制备提取的粗制脂质样品。使用具有fid检测的gc，估计的生物质的粗制脂质含量测定为52.4％(表示为fame的和)，而从干燥生物质中提取48.0％(wt/wt)的脂质，产生91.7％的总脂质回收率。使用gc/fid，粗制脂质测定为95.3％脂肪酸(表示为fame的和)。粗制脂质中含有的主要脂肪酸是c16:0(217.5mg/g)、c20:5n-3(169.3mg/g)和c22:6n-3(444.1mg/g)。
通过在50ml体积烧瓶中称60.1mg粗制脂质并将一等分部分转移至hplc小瓶用于hplc/elsd/ms分析，测定提取的粗制脂质的脂质种类谱。根据hplc/elsd/ms分析，粗制脂质含有0.2％se、95.7％tag、0.3％甾醇和0.7％1,2-dag。5.1％的tag组分包括在tag峰之后直接洗脱的峰，但不能给出可辨认的质谱。
来自该样品的分离的tag构成大约93.9％粗制油。在spe分离之后通过重量法或tlc未检测出pl。在tag中含有的主要脂肪酸(>50mg/g)为c16:0(218mg/g)、c20:5n-3(167mg/g)和c22:6n-3(430mg/g)。
pta-10208样品#3
使用hplc/elsd/ms，分析来自以atcc登记号pta-10208保藏的微生物(样品pta-10208#3)的粗制油样品。回收了总共98.38％的脂质，甾醇酯(se)组分占0.32％、tag组分占96.13％、1,3-二酰甘油(dag)组分占0.22％、1,2-dag组分占0.78％和甾醇组分占0.93％。
pta-10212样品#1
使用gc/fid，测定pta-10212样品#1的生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱。通过直接在fame管中称27.0mg生物质，原位酯交换生物质中的脂肪酸，同时通过在50ml体积烧瓶中称52.5mg粗制脂质并将1ml转移至另外的fame管，制备提取的粗制脂质样品。使用具有fid检测的gc，估计的生物质的粗制脂质含量测定为38.3％(表示为fame的和)，而从干燥生物质中提取36.3％(wt/wt)脂质，产生94.6％的总脂质回收率。使用gc/fid，粗制脂质测定为83.2％脂肪酸(表示为fame的和)。粗制脂质中含有的主要脂肪酸是c16:0(328.5mg/g)、c20:5n-3(90.08mg/g)和c22:6n-3(289.3mg/g)。
通过在50ml体积烧瓶中称52.5mg粗制脂质并将一等分部分转移至hplc小瓶用于hplc/elsd/ms分析，测定提取的粗制脂质的脂质种类谱。根据hplc/elsd/ms分析，粗制脂质含有0.2％se、64.2％tag、1.9％ffa、2.8％1,3-dag、1.4％甾醇、18.8％1,2-dag和0.5％mag。3.4％的tag组分包括在tag峰之后的直接洗脱的峰，但不能给出可辨认的质谱。
来自该样品的分离的tag构成大约49.8％的粗制油。分离的pl构成大约8.1％的粗制油。tag组分中含有的主要的脂肪酸(>50mg/g)是c16:0(400mg/g)、c20:5n-3(91mg/g)和c22:6n-3(273mg/g)。pl组分中含有的主要的脂肪酸(>50mg/g)是c16:0(98mg/g)、c20:5n-3(33mg/g)和c22:6n-3(227mg/g)。
pta-10212样品#2
使用gc/fid，测定pta-10212样品#2的生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱。通过直接在fame管中称29.5mg生物质，原位酯交换生物质中的脂肪酸，同时通过在50ml体积烧瓶中称56.5mg粗制脂质并将1ml转移至另外的fame管，制备提取的粗制脂质样品。使用具有fid检测的gc，估计的生物质的粗制脂质含量测定为40.0％(表示为fame的和)，而从干燥生物质中提取了41.3％(wt/wt)脂质，产生106.1％的总脂质回收率。使用gc/fid，粗制脂质测定为82.8％脂肪酸(表示为fame的和)。粗制脂质中含有的主要脂肪酸是c16:0(327.3mg/g)、c20:5n-3(92.5mg/g)和c22:6n-3(277.6mg/g)。
通过在50ml体积烧瓶中称56.5mg粗制脂质并将一等分部分转移至hplc小瓶用于hplc/elsd/ms分析，测定提取的粗制脂质的脂质种类谱。根据hplc/elsd/ms分析，粗制脂质含有0.2％se、58.2％tag、2.3％ffa、3.4％1,3-dag、1.7％甾醇、23.4％1,2-dag和0.6％mag。3.3％的tag组分包括在tag峰之后直接洗脱的峰，但不能给出可辨认的质谱。
来自该样品的分离的tag构成大约51.9％的粗制油。分离的pl构成大约8.8％的粗制油。tag组分含有的主要脂肪酸(>50mg/g)是c16:0(402mg/g)、c20:5n-3(92mg/g)和c22:6n-3(245mg/g)。pl组分中含有的主要脂肪酸(>50mg/g)是c16:0(121mg/g)、c20:5n-3(48mg/g)和c22:6n-3(246mg/g)。
表4：pta-10208和pta-10212生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(mg/g)
表5：pta-10208和pta-10212生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(％)
表6：pta-10208和pta-10212分离的tag的脂肪酸谱
表7：pta-10212分离的pl的脂肪酸谱
pta-10212样品#3
pta-10212样品#3的生物质的脂质含量估计为34％(表示为fame的和)，且溶剂提取之后获得的粗制油的量按重量计为37％，产生生物质中存在的脂肪的109％回收率。使用快速色谱法分级之后，分离出大约46％的粗制油为tag，分离出28％为dag。粗制油含有309mg/gdha和264mg/gepa。分离的tag含有341mg/gdha和274mg/gepa。分离的dag组分含有262mg/gdha和237mg/gepa。下面表8和表9中分别示出了计算为mg/g和％fame的生物质、提取的粗制油和经分离的组分的总脂肪酸谱。
表8：pta-10212样品#3生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(mg/g)
表9：pta-10212样品#3生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(％)
pta-10212样品#4
pta-10212样品#4含有大约23％脂质(测定为fame的和)，其中使用己烷提取回收了107％。使用快速色谱法分级之后，分离出大约42％的粗制油为tag，分离出18％为dag。粗制油含有275mg/gdha和209mg/gepa。分离的tag含有296mg/gdha和205mg/gepa。分离的dag组分含有245mg/gdha和219mg/gepa。下面表10(mg/g)和表11(％fame)中示出了生物质、提取的粗制油和经分离的组分的总脂肪酸谱。
表10：pta-10212样品#4生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(mg/g)
表11：pta-10212样品#4生物质和提取的粗制脂质的脂肪酸谱(％)
pta-10212样品#5
使用
简而言之，通过将240mg粗制油溶于600μl己烷并应用至柱头制备样品。使用快速色谱法将样品分级之后，所有组分的合并重量是240mg，产生100％回收率。甾醇酯组分占0.9％，tag组分占42.6％，游离脂肪酸(ffa)组分占1.3％，甾醇组分占2.2％，dag组分占41.6％。在下面表12和表13分别示出了计算为mg/g和％fame的
表12：pta-10212样品#5粗制油的脂肪酸谱(mg/g)
表13：pta-10212样品#5粗制油的脂肪酸谱(％)
实施例4
使用非水性反相hplc分离和apci-ms检测，对来自实施例3的样品pta-10208样品#1、pta-10208样品#2、pta-10212样品#1、pta-10212样品#2和pta-10212样品#3、pta-10212样品#4和pta-10212样品#5的每一种测定在提取的粗制脂质中存在的每一种tag异构体的相对量和脂肪酸组成。
tag方法–
pta-10208样品#1
制备分离自pta-10208样品#1的粗制脂质，用于tag分析，所述制备通过在hplc小瓶中称5.5mg油并用1ml己烷稀释来进行。
表14：pta-10208样品#1中tag种类的鉴定
pta-10208样品#2
制备分离自pta-10208样品#2的粗制脂质，用于tag分析，所述制备通过在hplc小瓶中称5.3mg油并用1ml己烷稀释来实现
表15：pta-10208样品#2中tag种类的鉴定
pta-10212样品#1
制备分离自pta-10212样品#1的粗制脂质，用于tag分析，所述制备通过在hplc小瓶中称5.3mg油并用1ml己烷稀释来实现。
表16：pta-10212样品#1中tag种类的鉴定
nd＝未检测出
pta-10212样品#2
制备分离自pta-10212样品#2的粗制脂质，用于tag分析，所述制备通过在hplc小瓶中称3.6mg油并用1ml己烷稀释来进行
表17：pta-10212样品#2中tag种类的鉴定
nd＝未检测出
pta-10212样品#3
在己烷中制备pta-10212样品#3的tag组分样品并通过hplc/apci/ms分析，以测定各单独的tag异构体的身份。
表18：pta-10212样品#3中tag种类的鉴定
nd＝未检测出
pta-10212样品#4
在己烷中制备pta-10212样品#4的tag组分样品并通过hplc/apci/ms分析，以测定各单独的tag异构体的身份。
表19：pta-10212样品#4中tag种类的鉴定
nd＝未检测出
pta-10212样品#5
在己烷中制备pta-10212样品#5的tag组分样品并通过hplc/apci/ms分析，以测定各单独的tag异构体的身份。
表20：pta-10212样品#5中tag种类的鉴定
实施例5
通过精制、漂白和除臭对粗制油进一步处理，以获得精制油。用高油酸的葵花籽油稀释精制油以获得具有约400mg/g的dha含量的最终油。分离各单独种类的脂质，并使用gc-fid测定每一种类的脂肪酸谱，表示为fame。
pta-10208最终油
pta-10208最终油#1-5的脂肪酸谱总结在表21-22中，所述脂肪酸谱包括分离的tag组分(表23-24)和分离的甾醇/dag组分(表24-26)中的相关谱。
也使用快速层析(表27)和具有elsd和apci-ms确认的正相hplc(表28)，测定最终油中的各单独种类的脂质。
表21：pta-10208最终油的脂肪酸谱(mg/g)
表22：pta-10208最终油的脂肪酸谱(％)
表23：分离的tag脂肪酸谱：pta-10208最终油(mg/g)
表24：分离的tag脂肪酸谱：pta-10208最终油(％)
表25：分离的甾醇/dag脂肪酸谱：pta-10208最终油(mg/g)
表26：分离的甾醇/dag脂肪酸谱：pta-10208最终油(％)
表27：通过快速层析的脂质种类分离(wt％)
表28：通过hplc-elsd的脂质种类分离(wt％)
nd＝未检测出
pta-10212最终油
dha在pta-10212最终油中以41.63％和366.9mg/g存在，而epa以16.52％存在。测定各自的脂肪酸谱并总结在表29中。
表29：pta-10212最终油的脂肪酸谱(％fame)
nd＝未检测出
实施例6
使用实施例4中描述的技术，对实施例5中所述的pta-10208最终油的甘油三酯(tag)进行分析。如下表30所总结的，对每一脂肪酸部分进行鉴定。
表30：pta-10208最终油中tag种类的鉴定
实施例7
在根据表1和2的培养基中，将以atcc登记号pta-10208和10212保藏的经分离的微生物的两天烧瓶接种物制备为碳和氮进料的培养物。
根据下述程序进行诱变：
将大约50ml的t＝2天的无菌烧瓶培养物，倒进40ml无菌玻璃匀化器。培养物在匀化器中接受50次均化。吸出培养物，并通过放在50ml无菌管中的无菌的50微米筛网过滤器(网孔作为保留更大的集落丛同时让更小的簇和单细胞通过50微米网孔的手段)过滤。在50ml无菌管中收集全部浓缩的浸渍物。旋转浸渍的培养物并制得高至1:100倍水平的稀释液。旋转稀释的浸渍物样品，之后将200μl接种物添加至含有4-5个玻璃珠(3mm玻璃珠)的100×15mm培养基琼脂板。将每一板轻轻搅动，努力使珠子将接种物均匀地在板各处扩展。将珠子从板上丢弃并将板打开盖子静置大约5分钟至干燥。将无菌罩和毗邻区域两处的光关掉，因为程序在暗淡的光中进行。仅以极微的光来运行程序，但仅仅是间接的且暗淡的。
将五个复制板放在xl交联仪(spectronicscorporation,newyork)底部，将盖子关闭，同时辐照样品。交联仪以微焦耳方式传递能量并寻求实现90％-95％杀死率水平。使用相同方案，用未诱变处理的细胞接种五个复制对照板。对这些细胞计数，用来计算％杀死率。一旦辐照结束将板取出，将盖子放回原处并将板在封口膜中包裹，随后在铝箔中包裹。第一周必须使板在黑暗中生长，使得它们不能修复损伤的基因。
将板在22.5℃屋子中放约10天，之后对集落计数。当得到最终计数时，用无菌接种环挑取单独集落并在新培养基板上再划线。每一集落在单独板上铺平板。当板生长密集时，使用接种环取样，并接种进含有50ml培养基的无菌250ml摇瓶。将该摇瓶放在22.5℃房间中的200rpm的摇床上。t＝7天时，将摇瓶培养物收获，移入50ml无菌管中。得到ph，并将样品离心以收集生物质球团。将每一样品漂洗并再悬浮在异丙醇和蒸馏水的50:50混合物中，之后再次离心。将收集的球团冷冻干燥称重并进行fame分析。表31和32中的数据分别表示用上述工艺从菌株pta-10208和pta-10212产生的突变体。
表31：pta-10208突变体
表32：pta-10212突变体
实施例8
根据实施例5所述的方法，制备油，其中用高油酸的葵花籽油稀释油，以实现至少约500mg/g油的总dha+epa含量。根据本实施例制成的油的典型分析和产品规格在表33中示出。
表33
油中含有的其他成分包含少于2％的葵花卵磷脂；迭迭香提取物；生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯(作为抗氧化剂)。
实施例9
根据实施例5所述的方法，制备油，其中用高油酸的葵花籽油稀释油，以实现至少约400mg/g油的总dha+epa含量。根据本实施例制成的油的典型分析和产品规格在表34中示出。
表34
油中含有的其他成分包含少于2％的葵花卵磷脂；迭迭香提取物；生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯(作为抗氧化剂)。
在一些实施方式中，以大小为20的素食凝胶胶囊来提供上述实施例8或9，其中填充重量为约999mg至约1105mg油、胶囊毛重为约1463mg至约1789mg，其中胶囊具有不超过15分钟的破裂时间和约24个月的保存期。
本文描述的所有的各种技术方案、实施方式和选择可以以任何和所有变化形式进行组合。
生物材料保藏
如下生物材料已按照布达佩斯条约的规定保藏于美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,atcc,manassas,va20110-2209,美国)，并获得如下保藏号：