模拟空腹饮食在防治帕金森病方面的应用的制作方法

本发明涉及模拟空腹饮食在防治帕金森病方面的应用，属于医学神经学技术领域。

背景技术

帕金森病(parkinson’sdisease,pd)是最常见的运动神经系统退行性疾病，主要临床表现为：静止性震颤、行动迟缓、站立不稳、姿势反射障碍以及菌群失调、便秘等非运动症状。pd患者脑部的主要病变部位为黑质及纹状体，其中黑质致密部多巴胺(dopamine,da)能神经元的变性死亡是造成投射到纹状体内多巴胺减少的直接原因。pd的发病机制目前并不明确，但大量研究表明其发生与氧化应激损伤、免疫炎症、凋亡、自噬等病理机制相互作用,最近研究表明饮食干预方案或对pd具有神经保护作用。目前pd的治疗多集中于药物治疗以及手术治疗，手术治疗具有一定的适应症，且费用较高，药物治疗只能改善症状，并不能阻止病情的发展。

与传统治疗不同，模拟空腹饮食(fastingmimickingdiet,fmd)是一种饮食干预治疗方式，通过低热量、低蛋白的饮食来模拟禁食的有益作用，并使禁食的副作用最小化。目前主要应用于糖尿病、心血管疾病、癌症以及多发性硬化等疾病的基础研究。此外，其在免疫系统再生、海马神经发生、认知功能改善、寿命延长等方面也起到重要作用。fmd在神经退行性疾病方面的研究极少，目前关于pd治疗方面并无文献报道，其巨大潜力有待发掘。

已有研究证明，其他的饮食干预治疗方法，如热量限制(30％热量限制)对pd哺乳动物模型均具有缓解作用，但是william等人表明40％热量限制对mptp诱导的pd小鼠无治疗作用，同时也有文献表明隔天禁食(每隔24小时)对pd大鼠并无显著影响。然而，对于大多数人来说，无论是热量限制还是隔天禁食，其可操作性较低，并且其极端性质可能会造成不利影响，其中包括营养不良和功能障碍的恶化，尤其是对老年人和体弱者而言。

技术实现要素：

为了克服现有临床治疗帕金森病的治疗方式和药物的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有潜在治疗或辅助治疗帕金森病的餐包。本发明通过建立c57bl/6j小鼠帕金森病模型，观察模拟空腹饮食对帕金森病小鼠运动障碍症状的作用，通过实验论证，fmd能改善帕金森病小鼠的运动障碍症状，减少黑质致密部神经元丢失，从而证明fmd对帕金森病小鼠具有神经保护作用。

本发明的第一个目的是提供一种缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的餐包，所述餐包中至少包括3种热量值不同的独立可食用包，其中第1种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的40-60％、第2种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的5-15％、第3种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，第1种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的50％，第2种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的10％、第3种独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的100％。

在本发明的一种实施方式中，所述第2种独立可食用包的数量为第1种独立可食用包的数量的2倍；所述第3种独立可食用包的数量为第1种独立可食用包的数量的4倍。

在本发明的一种实施方式中，所述独立可食用包有7个，按顺序编号；其中编号第1的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的40-60％，编号第2的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的5-15％，编号第3的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的5-15％，编号第4的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第5的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第6的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第7的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，所述独立可食用包有21个，其中编号第1、8、15的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的40-60％，编号第2、9、16的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的5-15％，编号第3、10、17的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的5-15％，编号第4、11、18的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第5、12、19的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第6、13、20的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％，编号第7、14、21的独立可食用包的热量为普通帕金森病患者每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，所述编号可采用任意一种常见的编号方式，比如罗马数字编号。

在本发明的一种实施方式中，所述普通帕金森病患者每日摄入热量采用联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的老年人每日摄入热量，具体是：50—60岁为11340千焦(2700千卡)，60岁以上为10080干焦(2400千卡)，70岁以上为8820千焦(2100千卡)。

在本发明的一种实施方式中，所述餐包中含有蛋白、维生素、脂肪、微量元素等。比如：维生素a、维生素d、维生素c、维生素e、维生素b6、维生素b12、硫铵素、核黄素、烟酸、铁、碘、镁、铜、锌、钾、钠、钙等等。

在本发明的一种实施方式中，所述餐包中还带有一个标签；标签上记载了按照编号顺序依次每日摄食一包的信息。

本发明的第二个目的是提供一种动物食品或动物饲料，所述动物食品或动物饲料中至少包括3种热量值不同的独立可食用包，其中第1种独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的40-60％、第2种独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的5-15％、第3种独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，所述第2种独立可食用包的数量为第1种独立可食用包的数量的2倍；所述第3种独立可食用包的数量为第1种独立可食用包的数量的4倍。

在本发明的一种实施方式中，所述独立可食用包有7个，按顺序编号；其中编号第1的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的40-60％，编号第2的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的5-15％，编号第3的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的5-15％，编号第4的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第5的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第6的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第7的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，所述所述独立可食用包有21个，其中编号第1、8、15的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的40-60％，编号第2、9、16的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的5-15％，编号第3、10、17的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的5-15％，编号第4、11、18的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第5、12、19的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第6、13、20的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％，编号第7、14、21的独立可食用包的热量为普通动物每日摄入热量的90-110％。

在本发明的一种实施方式中，所述动物为小鼠。

在本发明的一种实施方式中，所述普通动物每日摄入热量与如下饲料配方相同：原料组成：小麦粉、玉米粉、次粉、豆粕、玉米蛋白粉、植物油、啤酒酵母、盐、赖氨酸、蛋氨酸、矿物质、维生素(型号lad0011，购自南通特洛菲饲料科技有限公司)。此普通饲料的热量为3.4千卡/克。

在本发明的一种实施方式中，所述动物食品或动物饲料中还带有一个标签；标签上记载了按照编号顺序依次每日摄食一包的信息。

在本发明的一种实施方式中，所述动物食品或动物饲料可以有效地改善帕金森病小鼠的运动迟缓症状，减少黑质致密部神经元丢失，明显改善纹状体内多巴胺含量，提高或者改善小鼠的运动能力、黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量。

本发明的有益效果：

本发明通过建立小鼠帕金森病模型，观察模拟空腹饮食对帕金森病小鼠运动障碍症状，通过实验论证，模拟空腹饮食能改善帕金森病小鼠的运动迟缓症状，减少黑质致密部神经元的丢失，从而证明模拟空腹饮食对帕金森病具有神经保护作用。本发明使用模拟空腹饮食治疗方法，明显改善纹状体内多巴胺含量，小鼠的运动能力、黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞数量等有了显著的提高或者改善。

采用本发明的餐包或者动物食品，只需要根据编号依次每天摄食一个独立可食用包即可。

附图说明

图1：模拟空腹饮食对mptp诱导帕金森模型小鼠的热量摄入和体重的影响实验结果图；

图2：模拟空腹饮食对mptp诱导帕金森模型小鼠运动行为学影响实验结果图；

图3：模拟空腹饮食对mptp诱导帕金森模型小鼠纹状体多巴胺含量影响图；

图4：模拟空腹饮食对mptp诱导帕金森模型小鼠黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞数量影响图。

具体实施方案

下面通过具体实施进一步阐述本发明方法，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：动物模型的建立和分组

体重20-25g，7周龄，雄性c57bl/6j小鼠，随机分为空白对照组(ns-al组，自由摄食以及腹腔注射生理盐水)，空白饮食组(ns-fmd组，模拟空腹饮食以及腹腔注射生理盐水)，模型组(mptp-al组，自由摄食以及腹腔注射mptp)，治疗组(mptp-fmd组，模拟空腹饮食以及腹腔注射mptp)，每组20只。置于23±2℃，照明时间为12小时/天，动物适应环境一周后开始饮食干预。ns-fmd组和mptp-fmd组连续三周进行fmd饮食，在第二周的最后一天进行0.9％生理盐水或mptp腹腔注射mptp(20mg/kg)连续四次，每次间隔2小时。ns-al组和mptp-al组均为自由摄食，且与上述两组在相同时间以相同剂量和方法注射生理盐水和mptp。实验过程中记录各组小鼠的体重变化并采集各组小鼠粪便。随后通过爬杆实验和悬挂实验对小鼠的运动能力进行评价，然后通过免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,th)阳性细胞数量。通过以上方法来评价模拟空腹饮食对帕金森病小鼠的神经保护作用。

一、热量摄入和体重

各组小鼠的饮食安排如图1a所示，所谓fmd即以每一周为一个循环，每周中第1天给以普通水平的50％的热量，第2-3天给以普通水平的10％热量，第4-7天给以普通饲料。连续行3个循环。如图1b所示，fmd第2个循环中，由于mptp-al组小鼠注射mptp,其平均每日摄入热量显著减少，而mptp-fmd组小鼠则无显著变化。fmd第1和3个循环的平均摄入热量与al组相似，表明并没有减少热量摄入。

各组小鼠分别在进行所有操作前进行称重并记录，连续称重至实验结束。体重监测结果如图1c所示，在fmd期间(前3天)，ns-fmd组和mptp-fmd组小鼠的体重分别降低21.8％和22.3％，但在恢复标准饮食的第4天，其体重水平与基本水平相似。

二、行为学评价

各组小鼠分别在给予行为学检测前三天进行训练，每天一次，于饮食干预的最后一天进行行为学检测。

爬杆实验(poletest)：自制爬杆架：选择长55cm，直径lcm的金属管，外紧裹纱布防滑，上端覆以直径2cm的球形突起(实验时作为小鼠的附着点)，然后将其固定于金属底座，放置在鼠笼中，底座用敷料覆盖。测试时将小鼠头朝上置于球形突起，记录其自放置杆至爬至杆底后肢着地的时间，测3次取平均值，每次间隔10分钟以上。如小鼠出现中途停顿或反向攀爬，则重新测量。该实验动物要经过提前训练3天。

利用爬杆实验检测小鼠运动能力，如图2a所示。检测结果显示，ns-al组、ns-fmd组、mptp-al组、mptp-fmd组的小鼠的爬杆平均时间分别为3.964s、3.803s、4.920s、3.661s。与ns-al组小鼠比较，mptp-al组小鼠爬杆所需时间增加，运动的速度减慢。结果证实注射mptp的小鼠活动能力减弱。mptp-fmd组的小鼠较模型组小鼠所需时间减少，速度较快，与mptp-al组比较具有显著性差异(p<0.001)。结果证实fmd能改善帕金森病小鼠的运动能力。

悬挂实验(tractiontest)：在两金属立柱之间水平拉紧一条金属线，直径1mm，距地面30cm。实验时让小鼠用两前爪悬挂在一水平金属线上停留10s，测3次取平均值，每次间隔10分钟以上。小鼠悬挂能力评分标准：在测试时间内，小鼠能够用两后爪抓住金属线计为3分，小鼠仅用一后爪抓住金属线计为2分，两后爪均抓不住金属线计为1分，小鼠跌落计为0分。同时每次实验前观察每只小鼠是否有震颤、竖毛、前腿抬高、竖尾、动作缓慢、减少等异常行为。该实验动物要经过提前训练3天。

利用悬挂实验检测小鼠运动能力，如图2b所示。检测结果显示，ns-al组、ns-fmd组、mptp-al组、mptp-fmd组的小鼠的悬挂实验平均得分分别为3.61、3.38、2.39、3.29。与ns-al组小鼠比较，mptp-al组小鼠悬挂得分低，运动灵活性下降。结果证实注射mptp的小鼠活动能力较ns-al组减弱。mptp-fmd组的小鼠较mptp-al组小鼠悬挂得分高(p<0.001)，灵活性好。本实验结果证实fmd能改善帕金森病小鼠的运动能力。

二、hplc检测纹状体多巴胺的含量

小鼠脑纹状体内多巴胺(da)检测采用高效液相色谱法检测，使用waters2695分离单元串联waters2475荧光检测器。

1.色谱条件：

色谱柱：美国waters公司atlantist3(4.6mm×150mm，5μm)；保护柱：美国water公司(4.6mm×20mm，5μm，gdcrt)；流动相的配制：0.01mol/lpbs磷酸缓冲液试剂包(超纯水溶解到1l并调节ph到合适范围)，乙腈，超纯水，0.2μm滤膜过滤后超声脱气备用；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；荧光检测器：激发波长280nm，吸收波长320nm。

2.标准曲线绘制：将da对照品用甲醇溶液(含有10％超纯水)制成浓度为1mg/ml的贮备液，再用甲醇溶液稀释成0.2，0.4，0.8，1.2，2，4，8，20，40μg/ml的对照品溶液，取10μl注入色谱仪进行分析，得到对照品溶液色谱图。以各对照品溶液的浓度为横坐标(x)，各组分的峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到标准曲线方程。

3.实验结果

如图3所示，mptp-al组纹状体内da含量较ns-al组降低了78.7％(p<0.001)，mptp-fmd组da含量较mptp-al组上升108.3％(p<0.01)，并且da含量在ns-fmd组与ns-al组之间并无显著差异。此结果表明fmd能够挽救mptp诱导的pd小鼠的纹状体内da水平，且fmd对正常小鼠并无显著影响。

四、免疫荧光检测黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞数量

1.冰冻切片的制备

将储存于4℃超低温冰箱中的脑组织取出，弃去4％pfa溶液后依次用20％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液脱水。将钢制冰托置于切片机内固定位置处，在冰托上滴加组织胶，使之将冰托的平面完全覆盖，待凝固后，将其固定在切片机上。将脑组织适当控干表面溶液，准确放在冰托上。

用组织胶将固定于冰托的脑组织包埋，待凝固后将其固定在切片机上，调整切片机使切片厚度在10m左右，取开始含有黑质到其结束的区段连续切片。将所得到的切片置于55℃烘箱烘干30min，后置于-80℃保存。

2.免疫荧光染色

2.1组织切片的抗原修复

免疫荧光染色前，从-80℃冰箱取出所需切片，放入55℃鼓风干燥箱中烘片半小时。

修复时，将烤好的切片浸于ph6.0的柠檬酸缓冲液的染色盒中进行抗原修复，将染色盒置于95℃水浴锅中，水浴修复45分钟。水浴锅抗原修复后将含有切片的染色盒取出，冷却至室温。当修复后的切片冷却至室温后，将切片取出放入含有0.01m磷酸盐缓冲液的染色盒内，浸泡5分钟，共2次。

2.2组织切片的封闭

组织切片抗原修复并用0.01m磷酸盐缓冲液浸泡后，使用抗原修复笔勾勒出含有组织切片的部分，使用含有5％山羊血清的0.3％triton溶液封闭组织切片，并将置于保湿盒内，切片于37℃封闭1小时。

2.3抗体的孵育

使用0.3％triton稀释抗体配制工作液，其抗体的稀释浓度为1:1000。

3.实验结果

因为多巴胺能神经元特征性表达th，因此可通过th染色来显示多巴胺能神经元的情况，小鼠黑质内th免疫荧光染色实验显示(图4a和4b)，mptp诱导的pd小鼠其黑质内th阳性神经元数量较ns-al组小鼠显著降低(p<0.001)，而fmd则显著减少了pd小鼠(mptp-fmd组)黑质中th阳性神经元的丢失(p<0.01)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。