一种利用褐藻寡糖提高动物精液品质的方法与流程

本发明涉及动物生殖生理与繁殖
技术领域：
，具体涉及一种利用褐藻寡糖提高动物精液品质的方法。
背景技术：
：近年来，由于农药化肥的超量或不正确应用、环境污染、气候变化等原因导致雄性动物精子活力下降、精子浓度降低、精子畸形率升高，从而导致雄性不孕不育率大幅度提高，这是一个世界性的问题，引起了全世界的广泛重视。然而现在还没有良好的方法来改善精液品质从而来治疗雄性不孕不育。因此，科学家们都在寻找有效的药物或方法来提高雄性动物的精液品质。褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物,是一种功能性寡糖。褐藻寡糖由β-d甘露糖醛酸(mana)和其c-5差向异构体α-l古洛糖醛酸(gula)通过1-4糖苷键连接而成。褐藻寡糖分子量低,不仅水溶性强,稳定性高,而且具有很多生物活性,如抗肿瘤、抗氧化、抑菌、促生长等,在药物研制、功能食品开发、绿色农业等领域具有广阔的开发前景。然而褐藻寡糖是否也具有改善精液品质的功效还未知，也没有任何文献公开关于利用褐藻寡糖来改善精液品质的方法。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提出一种利用褐藻寡糖提高动物精液品质的的方法，目的在于提供一种利用天然成分的褐藻寡糖，安全有效地提高动物精液品质的方法。本发明的利用褐藻寡糖提高动物精液品质的方法，关键在于，雄性哺乳动物断奶后每日通过灌胃或添加到饲料中的方式补充褐藻寡糖，小型雄性哺乳动物摄入剂量为0.01-20mg/kg体重，中型雄性哺乳动物摄入剂量为0.05-50mg/kg饲料。进一步，所述褐藻寡糖的制备步骤如下：1)制备褐藻胶：将海带清洗后称重，以料液比100g/l加水，用匀浆机均匀破碎，然后加入碳酸钠(浓度为4％w/v),在93℃恒温降解4h得到褐藻胶；2)在步骤1)所得褐藻胶中加入1×磷酸缓冲液，加热到45℃溶解褐藻胶，配置成0.3％w/v的底物，然后调节ph到7.35，加入特异的褐藻寡糖降解酶0.45iu/ml，充分混匀，然后于37℃条件下酶解4h；3)将步骤2)所得酶解液加热到沸腾7min使酶灭活，用sevage方法反复去除溶液中的蛋白质，随后11000r/min离心10min，丢弃沉淀，回收上清液，利用旋转蒸发仪浓缩上清液到蒸发掉上清液的80％；4)将步骤3)所得浓缩液用100％酒精沉淀，得到的沉淀冷冻干燥，然后将冷冻干燥得到的粉末再次溶解于超纯水中，通过凝胶柱进行纯化，将纯化后的液体再次冷冻干燥得到褐藻寡糖粉末；5)将步骤4)所得褐藻寡糖粉末进行检测，褐藻寡糖含量≥95％的为合格品，置于4℃保存备用。进一步，所述小型雄性哺乳动物为小鼠时，从21日龄开始补充褐藻寡糖，所述褐藻寡糖通过灌胃方式进行补充。进一步，所述雄性哺乳动物为猪时，从35日龄开始补充褐藻寡糖，所述褐藻寡糖通过每天添加到饲料中的方式进行补充。进一步，所述雄性哺乳动物为绵羊时，从60日龄开始补充褐藻寡糖，所述褐藻寡糖通过每天添加到饲料中的方式进行补充。优选地，所述小型雄性哺乳动物为小鼠时，所述褐藻寡糖每日摄入量为10mg/kg体重。优选地，所述雄性哺乳动物为猪时，所述褐藻寡糖每日摄入量为30mg/kg饲料。优选地，所述雄性哺乳动物为绵羊时，所述褐藻寡糖每日摄入量为15mg/kg饲料。本发明的有益效果如下：1、首次提出利用酶解法获得的褐藻寡糖经过进一步纯化后，给雄性哺乳动物补饲可以显著地提高动物的精液品质，补饲时机为雄性哺乳动物断奶后即开始。精子的品质不仅与公畜的营养水平有关，更与公畜发育期的发育情况有关，经本申请的发明人团队多年研究发现，从公畜发育期就开始进行人工干预，能更好的建立生殖系统，充分挖掘公畜的遗传潜力。用酶解法提取褐藻寡糖是现有技术常用工艺，但是也含有一些杂质，影响了公畜利用褐藻寡糖构建生殖系统的效率，甚至还会起反作用，因此，本申请增加了纯化步骤，使用纯化后褐藻寡糖，为断奶后的哺乳动物补饲，获得了动物性成熟后精液品质显著提高的技术效果。2、扩展褐藻寡糖的利用范围。现有
技术领域：
，褐藻寡糖用于抗肿瘤、抗氧化、抑菌、促生长等，本申请利用褐藻寡糖含有丰富的甘露糖醛酸可以和动物睾丸细胞上的甘露醇受体结合诱导生成一氧化氮和多种细胞因子的特点，，在动物发育期就进行补饲，促进性成熟后动物精子发生。同时，褐藻寡糖还具有类激素的作用，它可以和雌激素受体结合，从而激活雌激素受体信号通路，对精子发生中也是非常重要的。褐藻寡糖还可以促进性激素的合成，性激素在精子发生中也是非常重要的。而本申请通过实验发现从发育期开始补充褐藻寡糖，可以提高动物精子活力和密度，而且不改变精子的畸形率或顶体完整性。3、给出了完整的提取有效褐藻寡糖的方法及用于不同动物的方法。本申请的技术方案，提出酶解法的褐藻寡糖经进一步纯化后才用于给动物进行补充。进一步纯化的褐藻寡糖，去除了更多杂质，而这些杂质有可能对发育期公畜构建生殖系统有副作用。针对不同动物，褐藻寡糖的使用方法和剂量均不相同。本申请经过大量试验，最终确定了在小鼠、猪和绵羊上的使用方法和剂量。附图说明图1为小鼠补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子密度柱状对比图图2为小鼠补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子活力柱状对比图图3为猪补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子密度柱状对比图图4为猪补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子活力柱状对比图图5为绵羊补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子密度柱状对比图图6为绵羊补充不同补充剂量褐藻寡糖的精子活力柱状对比图具体实施方式以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。实施例1：制备褐藻寡糖1)制备褐藻胶：将海带清洗后称重，以料液比100g/l加水，用匀浆机均匀破碎，然后加入碳酸钠(浓度为4％w/v),在93℃恒温降解4h得到褐藻胶；2)在步骤1)所得褐藻胶中加入1×磷酸缓冲液，加热到45℃溶解褐藻胶，配置成0.3％w/v的底物，然后调节ph到7.35，加入特异的褐藻寡糖降解酶0.45iu/ml，充分混匀，然后于37℃条件下酶解4h；3)将步骤2)所得酶解液加热到沸腾7min使酶灭活，用sevage方法反复去除溶液中的蛋白质，随后11000r/min离心10min，丢弃沉淀，回收上清液，利用旋转蒸发仪浓缩上清液到蒸发掉上清液的80％；4)将步骤3)所得浓缩液用100％酒精沉淀，得到的沉淀冷冻干燥，然后将冷冻干燥得到的粉末再次溶解于超纯水中，通过凝胶柱进行纯化，将纯化后的液体再次冷冻干燥得到褐藻寡糖粉末；5)将步骤4)所得褐藻寡糖粉末进行检测，褐藻寡糖含量≥95％的为合格品，置于4℃保存备用。实施例2：小鼠饲养试验健康icr品系的3周龄小鼠(体重均匀一致)240只，随机平均分配到8组(30只/组)，小鼠都是正常的进食和饮水，而且在统一的spf级鼠房进行饲养。每天按表1设计称取一定量的实施例1步骤5)所得粉末，按实验组设计的褐藻寡糖用量换算需要使用的粉末量，溶于纯净水中，配制成所需的褐藻寡糖溶液。每天按时通过灌胃的方式，给每只小鼠灌服与体重相匹配的褐藻寡糖溶液。每只小鼠灌胃0.1ml褐藻寡糖溶液。灌胃5周后，收取小鼠的精液，运用精液品质分析仪对精子活力和密度进行分析。试验结果如表1所示：表1小鼠补充褐藻寡糖对精液品质的影响研究发现在0.01-10mg/kg范围内具有剂量依赖性(随着浓度增加，效果越明显，10mg/kg是最好的剂量)，15-20mg/kg与10mg/kg效果没有差异，如图1精子密度和图2精子活力所示。实施例3：猪饲养试验在本校合作实验基地，选取80头健康断奶(35日龄)公猪，随机分成8组(10头/组)。所有猪在一个大饲养房内，都是正常的进食和饮水，而且在统一管理。每天按表2设计称取一定量的实施例1步骤5)所得粉末，按实验组设计的褐藻寡糖用量换算需要使用的粉末量。把称取的动物精料和褐藻寡糖粉末充分混合均匀。每天按时把配制好的含有褐藻寡糖的饲料精料饲喂猪。饲喂到6个月龄，收取猪的精液，运用精液品质分析仪对精子活力和密度进行分析。表2猪补充褐藻寡糖对精液品质的影响每日补充褐藻寡糖的剂量精子浓度(×10^9)精子活力(％)对照组1.9571.2实验组1(0.1mg/kg饲料)2.0172.5实验组2(1mg/kg饲料)2.1673.2实验组3(10mg/kg饲料)2.2576.9实验组4(20mg/kg饲料)2.3382.5实验组5(30mg/kg饲料)2.4585.6实验组6(40mg/kg饲料)2.485.1实验组7(50mg/kg饲料)2.4184.8实验发现在0.1-30mg/kg范围内具有剂量依赖性(随着浓度增加，效果越明显，30mg/kg是最好的剂量)，40-50mg/kg与30mg/kg效果没有差异，如图3猪精子密度和图4猪精子活力所示。实施例4：绵羊饲养试验在本校合作实验基地，选取80只健康断奶(60日龄)公绵羊，随机分成8组(10只/组)。所有绵羊在一个大饲养房内，都是正常的进食和饮水，而且在统一管理。每天按表3设计称取一定量的实施例1步骤5)所得粉末，按实验组设计的褐藻寡糖用量换算需要使用的粉末量，把称取的动物精料和褐藻寡糖充分混合均匀。每天按时把配制好的含有褐藻寡糖的饲料精料饲喂绵羊，保证每只动物吃到与采食量相匹配的褐藻寡糖饲料。饲喂到7.5-8个月龄，收取羊的精液，运用精液品质分析仪对精子活力和密度进行分析。表3绵羊补充褐藻寡糖对精液品质的影响每日补充褐藻寡糖的剂量精子浓度(×10^9)精子活力(％)对照组2.2372.3实验组1(0.05mg/kg饲料)2.3173.2实验组2(0.5mg/kg饲料)2.4374.3实验组3(1mg/kg饲料)2.5675.6实验组4(5mg/kg饲料)2.6381.2实验组5(10mg/kg饲料)2.7283.4实验组6(15mg/kg饲料)2.8586.7实验组7(20mg/kg饲料)2.7986.1实验发现在0.05-15mg/kg范围内具有剂量依赖性(随着浓度增加，效果越明显，15mg/kg是最好的剂量)，20mg/kg与15mg/kg效果没有差异，如图5绵羊精子密度和图6绵羊精子活力所示。以上对本发明所提供的一种利用褐藻寡糖提高动物精液品质的方法进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12