一种富含乳清蛋白多肽的产品及其制备方法、应用与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种富含乳清蛋白多肽的产品及其制备方法、应用。

背景技术：

肠道微生物对人体的健康有着重要的作用，然而医疗中抗生素的使用能改变肠道细菌种类和数量的平衡状态，造成肠道菌群失调，严重的时候会导致肠道炎症，引发腹痛腹泻、腹痛或便秘等症状。

目前用于促进抗生素治疗后肠道菌群失调恢复的主要手段是服用复合的益生菌制剂，例如乳酸杆菌、双歧杆菌、枯草杆菌、屎肠球菌、酪酸梭菌等一种或几种的组合。通常情况下，益生菌制剂对人体是安全的，但也有少数免疫系统功能紊乱的人群不一定适合服用益生菌，例如免疫系统功能低下者，服用益生菌可能会导致感染，而免疫系统亢进者；服用益生菌可能会出现过敏。此外，最新的研究表明，在抗生素治疗后实施益生菌干预，固然可促进益生菌在肠道内的定殖，但是与使用抗生素后无干预的自发性恢复相比，益生菌的使用会明显推迟宿主的粪便和肠粘膜菌群的重建，并不利于肠道菌群复原到抗生素治疗前的水平suezj,zmoran,zilberman-schapirag,et.al.,post-antibioticgutmucosalmicrobiomereconstitutionisimpairedbyprobioticsandimprovedbyautologousfmt.cell.2018september6,174(6):1406-1423。

膳食结构的变化能迅速影响到肠道菌群的定殖lawrenceadavid，corinnefmaurice，rachelncarmody，et.al.，dietrapidlyandreproduciblyaltersthehumangutmicrobiome.nature.2014january23,505(7484):559-563,事实上，对于任何哺乳动物而言，最初的膳食都是乳品，因而乳品在肠道微生物多样性的形成过程中起到了关键性的“起点”作用，这一作用依赖于乳蛋白的水解产物实现。

部分水解乳清蛋白是以乳清蛋白为原料，经蛋白酶水解形成的多肽的总称。作为食品原料，部分水解乳清蛋白通常被用于消化系统功能发育不全或对乳蛋白过敏的婴幼儿的配方奶粉。此外，使用特定酶水解得到的部分水解乳清蛋白中，还存在对于特定微生物生长具有抑制或促进作用的多肽。新生儿的肠道是近乎无菌状态的，伴随着乳品的摄入和消化，部分水解的乳清蛋白进入婴幼儿的肠道，协助婴儿逐步形成自身的肠道微生态系统。但是对于成年人而言，乳清蛋白对肠道生物多样性的作用被削弱了，一方面是由于成人膳食中，乳清蛋白的比重较婴儿饮食低很多，健康成人的肠道微生态系统已趋于稳定和成熟，能被干扰的程度较婴幼儿大大降低；另一方面，成人与婴幼儿的消化系统功能存在差异，胃肠道内蛋白酶的复合降解作用，使乳清蛋白水解多肽无法发挥其生理功能。因此，在部分水解乳清蛋白中，真正能对肠道微生态起作用的是能抵抗消化酶降解且相对大分子量的肽段，因为低分子量多肽在达到小肠末端前就被降解为氨基酸。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种富含乳清蛋白多肽的产品及其制备方法、应用的技术方案。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品，其特征在于通过以下步骤制得：

1）复水乳清蛋白溶液的制备：将乳清蛋白原料与水混合，混合比例4-20%（w/w），充分搅拌至悬浊液，且无明显大颗粒和团块状粉末，随即进行巴斯德杀菌，杀菌后迅速冷却至45-50℃，调节ph6.8-7.0，即为复水乳清蛋白溶液；

2）部分水解乳清蛋白的制备：向复水乳清蛋白溶液中加入中性蛋白酶，加入量为酶底比1000-10000u/g，反应期间控制反应液温度45-50℃，在反应过程中ph会下降，需使用碱调节，保持ph稳定在6.8-7.0，当水解进度dp达到0.1-0.2时，升高反应液温度至80-100℃，并保持5-30min，得部分水解乳清蛋白溶液；所述的水解进度dp的计算方式为dp=alk÷pro，其中alk是酶解反应进行时加入的碱中oh^-的物质的量，以mol计；pro是步骤2）中作为酶解底物的乳清蛋白的质量，以kg计；

3）肽段筛分：降低部分水解乳清蛋白溶液的温度至常温，控制部分水解乳清蛋白中游离氨基酸的质量占比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段的质量占比不低于40%，得到筛分后的部分水解乳清蛋白；

如果步骤2）中得到的部分水解乳清蛋白溶液已经满足游离氨基酸质量占总蛋白质量的比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段质量占总蛋白质量的比不低于40%，则直接进行步骤4）；

4）调配：取步骤2）或步骤3）得到的部分水解乳清蛋白与食品添加剂进行调配；

5）步骤4）中获得的调配后的原料，通过本领域技术人员已知的任何途径制成经口摄入的产品。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品，其特征在于所述的步骤1）中乳清蛋白是乳清粉、浓缩乳清蛋白和分离乳清蛋白中的一种或多种。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品，其特征在于所述的步骤3）中使用下列方法i、ii、iii的一种或几种组合，控制部分水解乳清蛋白中游离氨基酸的质量占比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段的质量占比不低于40%：

i）向部分水解乳清蛋白溶液中加入食用酒精，使溶液中酒精的体积比达到40-90%，冷却至-6到14℃之间，取沉淀备用；

ii）使用截留分子量为3000-5000da的超滤膜，对部分水解乳清蛋白作超滤处理，当有部分透过液过膜后，往残留液中加水，重复加水步骤0-3次，得透过液和残留液，取残留液备用；

iii）使用体积排阻层析的方法来分离部分水解乳清蛋白，收集不同分子量的肽段，使筛分后的部分水解乳清蛋白符合要求，所用层析填料为葡聚糖和环氧氯丙烷交联物、烯丙基葡聚糖和n,n亚甲基双丙烯酰胺交联物、交联琼脂糖、高交联琼脂糖、琼脂糖和葡聚糖交联物的一种或几种的组合。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品，其特征在于所述的步骤4）中取筛分后的部分水解乳清蛋白，如果是液体状态的，按照占总固形物的比例加入β-环状糊精0-10%、抗性淀粉0-20%、乳酸钠0-2%、乳糖20-40%、合成甜味剂0-0.15%和维生素0-0.02%；如果产品为固体形态，则各组分以固体质量计，比例同液体状态下。此外，无论产品为固态或液态，均可加入适量香精。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品，其特征在于所述的步骤4）中维生素为vb1、vb2、vb6、vb12、烟酰胺、抗坏血酸和异抗坏血酸中的一种或几种；甜味剂为人工合成的非营养型甜味剂。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）复水乳清蛋白溶液的制备：将乳清蛋白原料与水混合，混合比例4-20%（w/w），充分搅拌至悬浊液，且无明显大颗粒和团块状粉末，随即进行巴斯德杀菌，杀菌后迅速冷却至45-50℃，调节ph6.8-7.0，即为复水乳清蛋白溶液；

2）部分水解乳清蛋白的制备：向复水乳清蛋白溶液中加入中性蛋白酶，加入量为酶底比1000-10000u/g，反应期间控制反应液温度45-50℃，在反应过程中ph会下降，需使用碱调节，保持ph稳定在6.8-7.0，当水解进度dp达到0.1-0.2时，升高反应液温度至80-100℃，并保持5-30min，得部分水解乳清蛋白溶液；所述的水解进度dp的计算方式为dp=alk÷pro，其中alk是酶解反应进行时加入的碱中oh^-的物质的量，以mol计；pro是步骤2）中作为酶解底物的乳清蛋白的质量，以kg计；

3）肽段筛分：降低部分水解乳清蛋白溶液的温度至常温，控制部分水解乳清蛋白中游离氨基酸的质量占比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段的质量占比不低于40%，得到筛分后的部分水解乳清蛋白；

如果步骤2）中得到的部分水解乳清蛋白溶液已经满足游离氨基酸质量占总蛋白质量的比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段质量占总蛋白质量的比不低于40%，则直接进行步骤4）；

4）调配：取步骤2）或步骤3）得到的部分水解乳清蛋白与食品添加剂进行调配；

5）步骤4）中获得的调配后的原料，通过本领域技术人员已知的任何途径制成经口摄入的产品。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中乳清蛋白是乳清粉、浓缩乳清蛋白和分离乳清蛋白中的一种或多种。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中使用下列方法i、ii、iii的一种或几种组合，控制部分水解乳清蛋白中游离氨基酸的质量占比低于5%，同时分子量大于3000da的肽段的质量占比不低于40%：

i）向部分水解乳清蛋白溶液中加入食用酒精，使溶液中酒精的体积比达到40-90%，冷却至-6到14℃之间，取沉淀备用；

ii）使用截留分子量为3000-5000da的超滤膜，对部分水解乳清蛋白作超滤处理，当有部分透过液过膜后，往残留液中加水，重复加水步骤0-3次，得透过液和残留液，取残留液备用；

iii）使用体积排阻层析的方法来分离部分水解乳清蛋白，收集不同分子量的肽段，使筛分后的部分水解乳清蛋白符合要求，所用层析填料为葡聚糖和环氧氯丙烷交联物、烯丙基葡聚糖和n,n亚甲基双丙烯酰胺交联物、交联琼脂糖、高交联琼脂糖、琼脂糖和葡聚糖交联物的一种或几种的组合。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中取筛分后的部分水解乳清蛋白，如果是液体状态的，按照占总固形物的比例加入β-环状糊精0-10%、抗性淀粉0-20%、乳酸钠0-2%、乳糖20-40%、合成甜味剂0-0.15%和维生素0-0.02%；如果产品为固体形态，则各组分以固体质量计，比例同液体状态下。此外，无论产品为固态或液态，均可加入适量香精。

所述的一种富含乳清蛋白多肽的产品在制备促进抗生素治疗后肠道菌群失调恢复的药物或保健品中的应用。

本发明中在步骤2）中，u是酶活力单位，其定义为在25℃，ph7.0，其它条件均为最适的情况下，中性蛋白酶在1min内能转化酪朊酸钠水溶液中1μmol的酰胺键的酶量。

与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：

1）充分认识到乳清蛋白水解产物在哺乳动物肠道微生态最初形成过程中的作用，并将之应用到抗生素治疗后肠道微生物大量死亡的情况中去，促进自发的肠道菌群复原。

2）通过对乳清蛋白的水解程度控制以及肽段筛选，使有助于肠道菌群复原的肽段被保留下来作为产品的主要成分。

3）在产品中加入能促进肠道正常菌群定殖的碳水化合物和生长因子，对乳清蛋白多肽功效发挥起到辅助作用。

4）充分考虑到人体自身消化酶系对部分水解乳清蛋白的降解作用，使用剂量控制、剂型选择、辅料添加等手段，保障有足够数量的未完全降解多肽进入肠道。

5）鉴于乳多肽需要有足够剂量才能发挥作用，利用醇沉、柱层析或膜分离手段除去乳清蛋白酶解产物中对肠道菌群失调恢复没有促进作用的低分子量多肽和氨基酸，以避免造成营养过剩。

6）产品安全、无毒副作用，对于不适合服用益生菌制剂的人群的肠道菌群失调恢复同样适用，产品中的乳蛋白已发生降解，适合对乳蛋白过敏的人群食用。

7）能加快抗生素干预后的肠道菌群恢复速率，与使用益生菌制剂相比，恢复后的肠道菌群更接近抗生素治疗前的状态。

8）产品几乎不含单糖和脂类，对服用者血糖、甘油三酯和血清胆固醇的影响很小，适合高血压和糖尿病人群大量服用；大量服用该产品也不会引起肥胖。

附图说明

图1为实施例1中小鼠体重增长率；

图2为实施例1中各组小鼠粪便的菌落组成（以目分）；

图3为实施例1中各组小鼠粪便的菌落组成（以属分）；

图4为实施例3中各组小鼠小肠推进率；

图5为实施例3中各组小鼠首次黑便时间；

图6为实施例4中各组小鼠粪便的菌落组成（以目分）；

图7为实施例4中各组小鼠粪便的菌落组成（以属分）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1

一种富含乳清蛋白多肽的产品制备方法，包括以下步骤：

粉末状的浓缩乳清蛋白wpc80与水混合，配置成总固形物浓度为10%的悬浊液，将该悬浊液加热到70℃，保持5min，冷却至50℃后用0.1mol/l的naoh溶液调节ph至6.9，得到复水乳清蛋白溶液。

将复水乳清蛋白溶液的温度升至45℃，按照1500u/g底物的量加入中性蛋白酶开始反应，反应中使用0.1mol/l的naoh溶液调节ph，使其ph保持在6.9，当水解进度dp达到0.1时，将反应液煮沸并保持5min,得到部分水解乳清蛋白溶液。

因该溶液水解进度较低，游离氨基酸质量占比低于5%，且分子量大于3000da的肽段超过40%，故无需筛分直接可以调配。

趁热向部分水解乳清蛋白溶液中加入糖精(0.03g/kg)和甜蜜素(0.12g/kg)，按照0.1g/kg的量加入香精，而后分装到250ml的玻璃瓶中，密封，在121℃杀菌15min，冷却至室温后得富含乳清蛋白多肽的饮料，该饮料的总固形物浓度约为12%。

6周龄雄性c57小鼠18只，使用nih-41饲料喂养，同时往饮用水中添加0.5mg/ml万古霉素，连续7天以清除肠道野生菌。清除野生菌后将小鼠随机分为3组，每组6只，空白组保持正常饮食；干预组按0.2ml/10g体重的剂量灌胃富含乳清蛋白多肽的饮料；对照组在饮用水中按照菌落总数10⁵/ml的剂量添加复配益生菌（屎肠球菌占90%，枯草杆菌占10%），早晚各更换一次。连续喂养12天，检测其体重指标变化，第11天取粪便，每只小鼠取不少于0.5g，进行16srdna生物多样性检测。

如图1所示，从体重增长率来看，干预组与空白组没有明显差异，说明大量服用富含乳清蛋白多肽的饮料，不会导致小鼠体重增长过快。

表1粪便otu聚类情况和对应的物种分类学分析指数

从粪便微生物的物种分类学分析指数来看，膳食干预阶段各组的sobs、shannon和ace指数之间均无显著差异，但是干预组的chao指数最低，显示该组稀有物种数量最少，同时干预组的simpson指数明显高于空白组（p<0.01），仅比益生菌对照组低。这说明在大量服用富含乳清蛋白多肽的饮料后，小鼠粪便的生物多样性会增强，这种多样性的增强，并不是依赖于增加稀有微生物的数量，而是通过增强微生物种类分配的均匀性来实现的。

从图2可以看出，大量服用富含乳清蛋白多肽的饮料的小鼠，肠道内乳酸菌目和双歧杆菌目的微生物明显多于其它组别。从图3可以看出，服用该饮料的小鼠的乳酸菌属和双歧杆菌属微生物同样是占比最高的，甚至高于直接饮用益生菌的对照组。说明该饮料能够促进益生菌在肠道内占比的提高。

实施例2

本实施例与具体实施例1不同的是：调配时加入β-环糊精使其总质量达到发酵液总固形物量的8%。混合物经100目筛网过滤后，收集滤液，进行喷雾干燥，进风温度为185℃，出风温度为110℃，调节进料流量以控制喷雾干燥后的粉末含水量在4.5-5.5%之间。调配前的处理与实施例1相同。得到富含乳清蛋白多肽的固体饮料。

实施例3

一种富含乳清蛋白多肽的产品制备方法，包括以下步骤：

分离乳清蛋白粉wpi与水混合，配置成总固形物浓度为20%的悬浊液，将该悬浊液加热到75℃，保持20s，迅速冷却至45℃后用0.1mol/l的naoh溶液调节ph至7.0，得到复水乳清蛋白溶液。

将复水乳清蛋白溶液的温度升至50℃，按照5000u/g底物的量加入中性蛋白酶开始反应，反应中使用0.1mol/l的naoh溶液调节ph，使其ph保持在7.0，当水解进度dp达到0.2时，将反应液升温至80℃，并保持5min,得到部分水解乳清蛋白溶液。

趁热向该溶液中加入食用酒精至酒精含量超过70%（v/v），同时将该溶液的温度降至4℃，静置，3000rpm下离心分离沉淀，得到筛分后的部分水解乳清蛋白。

取筛分后的部分水解乳清蛋白，与下列成分混合，制成软材。具体比例为水+乙醇15%，部分水解乳清蛋白35%、β-环状糊精5%、抗性淀粉20%、乳糖23%、乳酸钠1%、椰子油0.75%、二氧化硅0.25%。使用双螺杆挤压技术造粒，螺杆转速120r/min,挤压机三区温度分别为105℃、115℃、125℃。即得富含乳清蛋白多肽的方便食品。该食品与早餐谷物一起食用，或替代早餐谷物食用，能迅速改善抗生素治疗导致的便秘情况。

6周龄c57雄性小鼠20只，分为两组，每组10只，模型组使用ntp-2000饲料喂养，干预组将ntp-2000饲料打碎后，混入20%(w/w)粉碎后的富含乳清蛋白多肽的方便食品。重新造粒作为干预组饲料，各组饮用水中均加入复配抗生素，每隔3天测量空腹体重。两周后各组均灌胃墨汁，测定小肠推进率、各组首次黑便时间。随后拉颈处死小鼠，心脏取血做血清生化分析，并测定盲肠指数和脾脏指数。模型组与干预组的体重增长率、盲肠指数、脾脏指数，以及血清生化指标中的血清胆固醇、甘油三酯、血糖、肌酐、尿素、血清丙氨酸氨基转移酶等指标均无明显差异，但是干预组的小肠推进率快于模型组，首次黑便时间也比模型组要短，两者有明显差异，如图4和5所示。

说明在日常饮食中加入20%的富含乳清蛋白多肽的方便食品，对小鼠的生理指标没有影响，但是可以显著改善抗生素治疗导致的便秘情况。

实施例4

一种富含乳清蛋白多肽的产品制备方法，包括以下步骤：

浓缩乳清蛋白粉wpc35溶于水，配置成总固形物浓度为7%的溶液，将该溶液加热到加热到63℃，保持30min，降至45℃后用0.1mol/l的naoh溶液调节ph至6.8，得到复水乳清蛋白溶液。

按照1000u/g的用量，向复水乳清蛋白溶液中加入中性蛋白酶开始反应，控制反应温度为45℃，反应过程中，加入0.1mol/l的naoh溶液维持ph稳定在6.8，当水解进度dp达到0.1时，迅速升高反应液温度至80℃，并保持30min，得部分水解乳清蛋白溶液。

将所得的部分水解乳清蛋白溶液装入切向流超滤系统中进行浓缩，使用所用超滤膜的截留分子量为5000da，当透过液和残留液体积一致时，中止超滤操作，取残留液备用。

往残留液中加入5%的β-环状糊精（w/w），混合均匀后经100目筛网过滤后，收集滤液，进行喷雾干燥，进风温度为185℃，出风温度为110℃，调节进料流量以控制喷雾干燥后的粉末含水量在4.5-5.5%之间。

往喷雾干燥后的粉末中添加0.2%的乳脂素（固体粉末状乳品风味香精）、阿斯巴甜0.2%、二氧化钛0.6%，往复震荡混合混合均匀，而后使用涡轮单冲压片机压成直径15mm，厚6mm的片剂，压片压力15kn，即为富含乳清蛋白多肽的奶片。

6周龄雄性c57小鼠18只，使用nih-41饲料喂养5天，第6天分2次灌胃150mg/ml的头孢曲松钠，每次0.4ml，两次灌胃时间间隔6小时，待小鼠出现严重腹泻与消瘦后视为造模成功。而后随机分为3组。模型组每天灌胃生理盐水2次，每次0.4ml；干预组将富含乳清蛋白多肽的奶片用蒸馏水溶解，配制成总固形物浓度为12%的溶液，每天灌胃2次，每次0.4ml；对照组灌胃复配益生菌，活菌数10⁶/ml（长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的比例为1:1:1），每天灌胃2次，每次0.4ml。各组均保持正常饮食供给，记录粪便成型的时间，待各组小鼠粪便均成型后，取粪便进行16srdna生物多样性检测。

表2抗生素处理后各组粪便成型时间

表3抗生素处理后小鼠粪便的物种分类学分析指数

从物种分类学分析指数看，在抗生素干预后，sobs、ace和chao指数，均是模型组最高，而乳清多肽干预组最低，但是simpson指数，却是模型组最低。说明抗生素干预后的恢复阶段，如果不进行额外的饮食干预，小鼠肠道内稀有微生物的数量会增加，但是富含乳清蛋白多肽的奶片或复配益生菌的摄入，都有利于某些特定微生物确立优势地位，优势菌的增殖，会抑制稀有微生物的生长，使肠道微生物生物多样性的水平下降。

由图6和图7可以看出，自然恢复的模型组，乳酸杆菌、双歧杆菌的占比最高。但是正常肠道中占据主导地位的肠球菌属微生物，在模型组中没有被发现。此外，对照组虽然灌胃了双歧杆菌和乳酸菌，但是这两类微生物并未有效定殖，在粪便中的占比尚不及干预组。粪便中常见的大肠埃希氏菌属，在上述三组中均未发现。模型组和对照组在恢复阶段均出现了较多的稀有微生物，但干预组的稀有微生物数量较少。说明富含乳清蛋白多肽的奶片可以协助小鼠尽快恢复到正常的肠道生物多样性水平，同时，其益生菌的定殖效果，也要优于使用外源的益生菌制剂。