一种灵芝液体发酵技术及其发酵制品与应用的制作方法

本发明涉及一种灵芝液体发酵技术及其发酵制品与应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术：

食药用真菌的液体深层发酵是指将食药用真菌的菌丝体培养于营养全面的液态培养基中，同时通入无菌空气并加以机械搅拌或振荡，控制适宜温度压力等外界条件使菌丝体快速生长繁殖，从而快速高效获得菌丝体和其他代谢产物，应用于科学研究或工业生产。食药用真菌液体培养技术因其生产周期短、产量大、质量高、经济效益突出等优势而被广泛研究和应用。通过液体深层发酵食药用真菌菌丝体获得发酵产物，一般分为发酵液和真菌菌丝体。

灵芝(ganodermalingzhishengh.wetal.)为一种名贵的大型真菌，具有较高的食用和药用价值。在中国过去两千多年，一直被人们视为延年益寿的珍品。如今灵芝作为药材，早已被收入中国药典，并且被国家卫生部门批准可用于保健食品开发。目前灵芝多糖、三萜、甾醇、核苷等是灵芝中主要的活性成分，具有广泛的药理活性，如增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老，保肝、降血脂等。灵芝在临床应用上也有良好的疗效。显齿蛇葡萄(ampelopsisgrossedentata(hand-mazz)w.t.wang)，俗称藤茶，主产于湖南、江西、福建等地，系一种资源丰富的类茶植物。2013年由原卫计委批准成为新食品原料。叶子是主要的使用部位。在我国，显齿蛇葡萄已有超过700年的饮用历史，其味甘淡、性凉，夏天泡茶多日不馊，民间赋予其“神草”之美称。曾有多部医药学专著记载该茶的功效，如清热解毒、消胀止渴、治疗黄疸肝炎等。显齿蛇葡萄叶中富含多酚类、黄酮类、鞣质、氨基酸及微量元素，尤其以二氢杨梅素的高含量(通常占干重15％-25％)而出名。现代药理学表明藤茶具有抗氧化、消炎、降压降脂、抗肿瘤等功效活性，近年来愈发引起人们的关注，相关的功能性饮料、保健品乃至药品被陆续开发。

灵芝属于高等真菌，菌丝代谢能力很强。通常灵芝的液体发酵技术大多使用葡萄糖、蔗糖、玉米粉、黄豆粉、蛋白胨、无机盐等作为发酵营养成分，进行液体深层发酵。由于培养基仅为营养成分，即便使用不同的培养基，受灵芝遗传特性决定，所以发酵产物中初级代谢物和次级代谢产物基本相同，大多为多糖、三萜、核苷、蛋白质及氨基酸等。多年来，灵芝液体发酵大多采用这一技术，缺少原始创新。若能在培养基中加入一些安全且有活性的植物成分，可为灵芝菌丝体的代谢途径提供某些前提物质，利用菌丝体胞外酶的生物催化作用，从而合成一些新的活性物质，增强发酵产物的功效，扩大用途。这一过程属于生物转化作用。

2018年4月国家卫健委食品安全司公示关于征求将党参等9种物质作为按照传统既是食品又是中药材物质管理意见的函(国卫办食品函〔2018〕278号)，拟将灵芝等列入食药同源物品目录，这无疑将有利于灵芝的加工技术和相关产业发展。灵芝这种名贵的药用真菌与传统类茶药物植物显齿蛇葡萄进行有机结合，运用现代生物工程技术，进行液体发酵，无论在政策法规、理论和技术上都具有较高的可行性，发酵产物在食品、保健食品或药品领域具有较广阔开发前景。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足和缺点，提供一种添加显齿蛇葡萄的灵芝液体发酵技术，增强发酵产物的功效。

本发明的另一目的在于提供上述发酵技术产生的发酵制品，包括灵芝发酵液和菌丝体。

本发明的再一目的在于提供上述灵芝发酵液的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种灵芝液体发酵技术，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备显齿蛇葡萄提取液；取显齿蛇葡萄干燥样品，热水浸提，去渣，得显齿蛇葡萄提取液；

(2)取灵芝保存菌种，22-26℃活化培养后转接至试管斜面固体培养基上，长成菌丝致密健壮，色泽洁白斜面种，备用；

(3)从斜面种上挑取数块的灵芝菌块接入液体培养基中，22-26℃、120-180rpm振荡培养10-20d，制备液体菌种；

(4)将显齿蛇葡萄提取液加入基础培养基中，混合成为发酵全成分培养基，接入步骤(3)的液体菌种，进行深层发酵；

(5)将深层发酵产物固液分离，获得灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

本发明中显齿蛇葡萄提取的料液比(w/v)为1:10-1:30，优选1：20，提取温度80-90℃，优选80-85℃，提取1-2次，每次1-2h，优选提取1次，提取1.5h，提取完成后抽滤或离心，弃去料渣，得显齿蛇葡萄提取液。

本发明步骤(2)中的斜面固体培养基组成为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，(nh4)2so42g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，ph调至6.5。

步骤(2)中菌种的活化温度优选为24-26℃。

本发明步骤(3)中的液体培养基组成为：葡萄糖2-3％、蛋白胨0.2-0.5％、mgso4·7h2o0.1％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.0-6.5；步骤(3)中的菌种培养温度优选为24-26℃。

本发明步骤(4)的基础培养基配方为：葡萄糖3-6％、蛋白胨0.4-0.8％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.5。

基础培养基优选配方为：葡萄糖4％、蛋白胨0.5％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b10.002％，ph6.5。

本发明中步骤(4)中基础培养基中显齿蛇葡萄提取液添加量为添加后混合物体积的4-15％，优选添加率为10％。

步骤(4)中发酵全成分培养基在接入液体菌种前灭菌处理。可以将显齿蛇葡萄提取液加入基础培养基中混合，一同灭菌，也可以预先过滤除菌后再加入灭菌后冷去的基础培养基中。

优选地，显齿蛇葡萄提取液过0.22微米滤膜后加入灭菌后的基础培养基中。

本发明步骤(4)所述液体菌种的接种率为5％-12％，优选为8％。

本发明步骤(5)中固体分离方法包括离心、抽滤、板框压滤、过滤等方式。

一种上述灵芝液体发酵技术的发酵制品，为发酵产物固液分离后获得的灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

本发明制备的灵芝发酵液具有较强的抗超氧阴离子自由基活性。

一种上述发酵制品的应用。

本发明发酵制品的应用，其特征在于含有灵芝发酵液的饮品。该含有灵芝发酵液的饮品还包括甜味剂、酸味剂、助悬剂、益生元和水果粉中的一种或几种的混合物。

其中甜味剂优选为蔗糖、罗汉果甜苷；酸度调节剂优选柠檬酸；益生元优选低聚果糖、低聚半乳糖和/或菊粉；水果粉优选猕猴桃粉、苹果粉和蓝莓粉中的一种或几种。

制备时，将甜味剂、酸味剂、益生元和水果粉等加入灵芝发酵液中，调配后均质、灭菌、灌装即得灵芝发酵液保健饮品。本发明中的灵芝发酵液饮品为功能性保健饮品，安全无毒，集营养保健功效于一体，经常饮用对人体健康产生十分有益的作作。

本发明发酵制品的应用，其特征在于含有灵芝菌丝体的胶囊、粉剂、片剂或颗粒剂，或其他功能食品或保健品。制备时，将灵芝菌丝体经干燥、粉碎、过筛后制成胶囊、片剂、粉剂或颗粒剂即可。

与现有技术相比，本发明有如下优点：

(1)本发明在灵芝现有发酵技术基础上，在培养基中加入显齿蛇葡萄提取液体，可为灵芝菌丝体的代谢途径提供某些前提物质(如黄酮类、多酚类成分)利用菌丝体胞外酶的生物催化作用，修饰活性物质的化学结构，或合成一些新的活性物质，增强发酵产物的功效，扩大用途。这一过程是对灵芝和显齿蛇葡萄的创新结合。

(2)本发明在灵芝基础培养基中显齿蛇葡萄提取物的添加量恰到好处，既不会因添加量过高而抑制灵芝菌丝生长，又不会因加入量太低而导致发酵产物功效不强。

(3)本发明的灵芝发酵液，有较强的抗氧化功效；再添加天然甜味剂、益生元低聚果糖、水果粉，集营养保健作用于一体，经常饮用，十分有益于人体健康。

(4)本发明所用真菌是拟列入食药同源的物质，发酵基质添加新型植物食品原料显齿蛇葡萄，整个发酵过程严格控制条件，避免杂菌污染，发酵产物安全无毒，保健功效显著，开发价值大，应用前景广阔。

【附图说明】

图1为本发明制备及应用工艺流程图。

【具体实施方式】

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

如图1所示，一种灵芝液体发酵技术，包括以下步骤：

(1)制备显齿蛇葡萄提取液；取显齿蛇葡萄干燥样品，以料液比1：20，提取温度80-85℃热水浸提1-2h，提取1-2次，去渣，得提取液；

(2)取灵芝保存菌种，22-26℃活化培养后转接至试管斜面固体培养基上，长成菌丝致密健壮，色泽洁白斜面种，备用；

(3)从斜面种上挑取数块的灵芝菌块接入液体培养基中，22-26℃，120-180rpm振荡培养10-20d，制备液体菌种；

(4)将显齿蛇葡萄提取液加入基础培养基中，混合成为发酵全成分培养基，显齿蛇葡萄提取液的比例为发酵全成分培养基体积的4-15％，无菌操作接入步骤(3)的液体菌种，进行深层发酵；

(5)将深层发酵产物固液分离，获得灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

其中基础培养基配方为：葡萄糖3-6％、蛋白胨0.4-0.8％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.5。

灵芝发酵液的应用加工步骤为：与其他组分调配、均质、灭菌和灌装。

灵芝菌丝体的应用加工步骤为：干燥、粉碎、过滤，制成胶囊、片剂、颗粒及其他功能食品或保健品。

实施例1：

制备灵芝发酵液和灵芝菌丝体，步骤如下：

(1)显齿蛇葡萄提取液的制备：取显齿蛇葡萄干燥样品20g，加入400ml纯化水，85℃水浴浸提2h，提取一次，趁热抽滤，得提取液，相当于每20ml提取液含有1g原材料；

(2)取灵芝保存菌种(购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，菌株编号为gdmcc5.250)，26℃活化培养后转接至试管pda斜面固体培养基上，长成菌丝致密健壮，色泽洁白斜面种，备用；

斜面培养基配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，(nh4)2so42g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，ph调至6.5；

(3)选用500ml三角瓶，每瓶装入100ml液体培养基，115℃灭菌20min，从斜面种上挑取数块的灵芝菌块接入灭菌并冷却的液体培养基中，26℃、150rpm振荡培养10d，制备灵芝液体菌种；

所述液体培养基配方为：葡萄糖6％、蛋白胨0.8％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.5；

(4)选用500ml三角瓶，每瓶装入122.5ml基础培养基，115℃灭菌20min，再将步骤(1)中的显齿蛇葡萄提取液经0.22μm滤膜过滤除菌后，加入22.5ml至基础培养基中(相当于显齿蛇葡萄原材料含量为7.5g/l)，混合均匀，制成发酵全成分培养基，接入步骤(3)制备的灵芝液体菌种15ml，26℃、150rpm振荡培养20d，深层发酵；

同时，设置不加显齿蛇葡萄提取液的对照组，仅用基础培养基发酵培养；

(5)采用真空抽滤分离步骤(4)所制得的深层发酵产物，获得灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

灵芝发酵液作为基础原料用于调制灵芝发酵液保健饮品。

灵芝菌丝体50-60℃鼓风干燥后，粉碎过100目筛，于阴凉干燥处保存。

实施例2：

制备添加显齿蛇葡萄的灵芝发酵液和灵芝菌丝体，步骤如下：

(1)显齿蛇葡萄提取液的制备：取显齿蛇葡萄干燥样品20g，加入400ml纯化水，85℃水浴浸提2h，提取一次，趁热抽滤，得提取液，相当于每20ml提取液含有1g原材料；

(2)取灵芝保存菌种(购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，菌株编号为gdmcc5.250)，26℃活化培养后转接至试管pda斜面上，长成菌丝致密健壮，色泽洁白斜面种，备用；

斜面培养基配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，(nh4)2so42g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，ph调至6.5；

(3)选用500ml三角瓶，每瓶装入100ml液体培养基，115℃灭菌20min，从斜面种上挑取数块的灵芝菌块接入灭菌并冷却的液体培养基中，26℃、150rpm振荡培养10d，制备液体菌种；

所述液体培养基配方为：葡萄糖4％、蛋白胨0.5％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.5；

(4)选用500ml三角瓶，每瓶装入135ml液体培养基，再加入步骤(1)中的显齿蛇葡萄提取液15ml(相当于显齿蛇葡萄原材料含量为5g/l)，混合均匀，制成发酵全成分培养基，115℃灭菌20min，冷却后接入步骤(3)所述的灵芝液体种12ml，26℃、150rpm振荡培养15d，深层发酵；

同时，设置不加显齿蛇葡萄提取液的对照组，仅用基础培养基发酵培养；

(5)采用真空抽滤分离步骤(4)制得的深层发酵产物，获得灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

灵芝发酵液作为基础原料用于调制灵芝发酵液保健饮品。

灵芝菌丝体50-60℃鼓风干燥后，粉碎过100目筛，与阴凉干燥处保存。

实施例3

制备添加显齿蛇葡萄的灵芝发酵液和灵芝菌丝体，步骤如下：

(1)显齿蛇葡萄提取液的制备：取显齿蛇葡萄干燥样品20g，加入400ml纯化水，85℃水浴浸提2h，提取一次，趁热抽滤，得提取液，相当于每20ml提取液含有1g原材料；

(2)取灵芝保存菌种(购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，菌株编号为gdmcc5.250)，26℃活化培养后转接至试管pda斜面上，长成菌丝致密健壮，色泽洁白斜面种，备用；

斜面培养基配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，(nh4)2so42g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，ph调至6.5；

(3)选用500ml三角瓶，每瓶装入100ml液体培养基，115℃灭菌20min，从斜面种上挑取数块的灵芝菌块接入灭菌并冷却的液体培养基中，26℃、150rpm振荡培养10d，制备液体菌种；

所述液体培养基配方为：葡萄糖3％、蛋白胨0.4％、mgso4·7h2o0.05％、kh2po40.1％、维生素b1微量，ph6.5。

(4)选用500ml三角瓶，每瓶装入96ml液体培养基，再加入步骤(1)中的显齿蛇葡萄提取液4ml(相当于显齿蛇葡萄原材料含量为2g/l)，混合均匀，制成发酵全成分培养基，115℃灭菌20min，冷却后接入步骤(3)所述的灵芝液体种5ml，26℃、150rpm振荡培养12d，深层发酵；

同时，设置不加显齿蛇葡萄提取液的对照组，仅用基础培养基发酵培养；

(5)采用真空抽滤分离步骤(4)制得的深层发酵产物，获得灵芝发酵液和灵芝菌丝体。

灵芝发酵液作为基础原料用于调制灵芝发酵液保健饮品。

灵芝菌丝体50-60℃鼓风干燥后，粉碎过100目筛，与阴凉干燥处保存。

抗氧化实验

超氧阴离子自由基(o2^—·)也是一种人体生理自由基，氧化能力较强。模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基o2^—·，加入电子传递物质及显色剂，使反应体系呈现紫红色。当存在抗超氧阴离子的物质，可抑制该反应使超氧阴离子自由基o2^—·减少，故比色时颜色变浅。依据形成物的颜色深浅计算出抑制氧阴离子自由基o2^—·的能力强弱。具体操作依据试剂盒要求(购自南京建成生物工程有限公司)进行。

结果显示实施例1-3制得的灵芝发酵液对o2^—·抑制率分别为67.3％、52.5％、46.2％，不添加显齿蛇葡萄提取液的对照组的灵芝发酵液对o2^—·抑制率为25％-30％，这表明培养基中添加显齿蛇葡萄提取液，经过灵芝菌丝发酵后，抗氧化活性显著提高。

由于本发明的灵芝菌丝体可通过代谢过程中的多种生物酶利用显齿蛇葡萄提取液中的黄酮、多酚类活性成分，进行结构修饰、转化，使得菌丝体活性成分不局限于原来的灵芝多糖、灵芝三萜、甾醇、核苷类物质，在发酵过程中自经身代谢作用转换为菌丝体中的其他活性物质。基于显齿蛇葡萄提取液的前体物质，采用本发明发酵技术，所得的灵芝菌丝体比常规发酵工艺的灵芝菌丝体具有更广泛的活性成分，具备更优的生物功效。

应用实施例1：灵芝发酵液保健饮品的调制

(1)取实施例1制备的灵芝发酵液，加入甜味剂罗汉果甜苷、蔗糖，益生元低聚果糖，水果粉猕猴桃粉、苹果粉，混合调配，各组分的重量百分比例如下：

灵芝发酵液95.738％；罗汉果甜苷0.015％；蔗糖2％；柠檬酸0.045％；低聚果糖0.6％；猕猴桃粉0.1％；苹果粉0.1％；

(2)调配后的半成品检测感官(色泽、滋气味、性状、杂质)、酸度等指标，符合要求后进入下一工序。

(3)调配半成品经均质，灭菌、灌装至玻璃瓶或易拉罐中，制成灵芝发酵液保健饮品。

应用实施例2：制备灵芝菌丝体制品

将实施例1-3制备的灵芝菌丝体，分别经干燥、粉碎、过筛后制成灵芝菌丝体胶囊、灵芝菌丝体片剂、灵芝菌丝体粉剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。