利用食药用菌对大豆或其他油料作物进行发酵处理的方法与流程

本发明涉及利用食药用菌对大豆或其他油料作物进行发酵处理的方法，属于发酵技术领域。

背景技术：

大豆，是世界重要的粮油兼用作物，且世界大豆产量的约85％都用于榨油，因此，大豆是全球植物油和蛋白饲料最主要的来源。现有的制备大豆油和豆粕的大豆加工工艺主要为将大豆先膨化处理，榨油得到大豆油，然后将残渣烘干获得豆粕。其榨得的大豆油是一种优良的食用油脂，具有很髙的营养价值，是人们日常生活中最为常见的食用油之一；其加工得到的大豆粕作为大豆制油后得到副产物，不仅产量巨大，且豆粕中蛋白含量高达45％以上，其中氨基酸组成较为合理，是养殖饲料优质植物蛋白源。

对于大豆油，目前，随着生活质量的不断提高，消费者对食用油脂的质量要求也越来越高，食用油脂研究者和生产企业为获得消费者的青睐，尝试在大豆油中添加天然功能性物质(如类胡萝卜素、角鲨烯、黄酮等)，以赋予大豆油一定的生物活性，其得到的产品功能性油脂不但更具市场竞争力并大幅度提高了附加值；然而，这些天然功能性物质的获得本身需要一个生产、提取、制备的过程，因此，该类油产品的生产存在着工艺流程长的缺陷或者需要以较高的成本购买天然功能性物质产品进行添加。

对于大豆粕，饲料研究者和生产企业往往通过对豆粕进行微生物发酵，以进一步改善和提高豆粕的品质；但是，发酵豆粕的获得需要进行加水配料、原料灭菌，接种发酵，烘干等多个环节，在改善和提高豆粕品质的同时也大幅度增加了生产成本，这对于需要严格控制成本的饲料和养殖行业来讲，是一个重要且亟待解决的问题。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种利用食药用菌对膨化大豆或其他油料作物进行发酵处理的方法。此方法为通过在含如膨化大豆、花生、菜籽等的富含油脂的油料作物的发酵基质中接种如灵芝、金耳、猴头菇、蛹虫草等的可产活性多糖、黄酮类化合物、三萜类化合物等生物活性物质的食药用真菌进行固态发酵，以得到富含黄酮类化合物、三萜类化合物类胡萝卜素的油脂及富含活性多糖、黄酮类化合物、三萜类化合物的油料作物粕；利用此方法获得的油脂中的黄酮类化合物含量可高达0.302mg/g、三萜类化合物含量可高达65.663mg/g，油料作物粕中的活性多糖含量可高达60.651mg/g、黄酮类化合物含量可高达1.599mg/g、三萜类化合物含量可高达14.225mg/g，且以上活性物质具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、预防癌症等生物活性；利用此方法仅需一次发酵、一次榨油，无需额外添加即可同时得到富含生物活性成分的油脂以及油料作物粕，大幅度降低了功能性油脂及发酵油料作物粕的生产成本。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种利用食药用菌对大豆或其他油料作物进行发酵处理的方法，所述方法为先将食药用真菌接种至发酵培养基中进行固态发酵，得到固态发酵后的发酵物，然后将发酵物进行榨油，得到油脂以及油料作物粕；

所述食药用真菌为可产生物活性物质的食药用真菌；

所述生物活性物质包含活性多糖、黄酮类化合物或三萜类化合物中的一种或多种；

所述发酵培养基的成分包含油料作物粉末以及水；

所述油料作物粉末包含大豆膨化粉、大豆粉、花生粉、菜籽粉、蓖麻粉或芝麻粉中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含占发酵培养基总质量40～50％的油料作物粉末以及占发酵培养基总质量50～60％的水。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含占发酵培养基总质量40％的油料作物粉末以及占发酵培养基总质量60％的水。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含大豆膨化粉以及水。

在本发明的一种实施方式中，所述食药用菌包含所述食药用真菌包含灵芝(ganodermalucidum)、金耳(tremellaaurantialba)、猴头菇(hericiumerinaceus)或蛹虫草(cordycepssinensis)中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述食药用菌为灵芝。

在本发明的一种实施方式中，所述固态发酵的条件为温度25～30℃、时间10～20d。

在本发明的一种实施方式中，所述固态发酵的条件为温度30℃、时间10d。

在本发明的一种实施方式中，所述将食药用真菌接种至发酵培养基中进行固态发酵为将食药用真菌种子液接种至发酵培养基中进行固态发酵；所述食药用真菌种子液在发酵培养基中的接种量为食药用真菌种子液体积占油料作物粉末质量的5～20％；所述食药用真菌种子液是通过将食药用真菌接种至种子培养基中进行培养获得的。所述5～20％是指每100g油料作物粉末中接种了5～20ml的食药用真菌种子液。

本发明提供了应用上述方法制备得到的油脂以及油料作物粕。

本发明提供了含有上述油脂和/或油料作物粕的产品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包含饲料、食品、药品或保健品。

有益效果：

(1)利用本发明的方法制备得到的油脂富含黄酮类化合物、三萜类化合物等生物活性物质，其中，黄酮类化合物含量可高达0.302mg/g、三萜类化合物含量可高达65.663mg/g，因此，利用本发明的方法制备得到的油脂具有抗癌、抗氧化等功效，在食品、药品以及保健品领域均具有极大的应用前景；

(2)现有的功能性油脂需先制备、提取得到营养成分，再将油脂与各种能够对人体健康起调节作用的营养成分进行调配才能得到，具有工艺复杂、成本较高的缺陷，而本发明通过直接将能够生产生物活性成分的食药用菌接种至如膨化大豆、花生、菜籽等的富含油脂的油料作物粉末与水混合而成的发酵培养基中进行固态发酵，得到了富含黄酮类化合物、三萜类化合物等生物活性物质的功能性油脂，操作简单、成本低；

(3)利用本发明的方法制备得到的如豆粕、花生粕、菜籽粕等的油料作物粕富含活性多糖、黄酮类化合物、三萜类化合物等生物活性物质，其中，活性多糖含量可高达60.651mg/g、黄酮类化合物含量可高达1.599mg/g、三萜类化合物含量可高达14.225mg/g，因此，利用本发明的方法制备得到的油料作物粕具有抗癌、抗氧化等功效，在制备优质饲料方面具有极大的应用前景；

(4)现有的饲料生产厂家常将这些榨油后油料作物灭菌后再与各种菌进行发酵以作成发酵豆粕饲料，这无疑为饲料的加工添加了灭菌、发酵等的额外工序，使得饲料的成本大幅度增加，而本发明通过直接将能够生产生物活性成分的食药用菌接种至如膨化大豆、花生、菜籽等的富含油脂的油料作物粉末与水混合而成的发酵培养基中进行固态发酵，榨油所获得的油料作物粕已经达到原有对油料作物粕发酵的目的和意义，同时减少了操作工序，有利于大幅度降低成本；

(5)为降低被饲养动物的成活率，饲料生产厂家常将大量的抗生素添加至饲料中，这无疑会造成大量抗生素在被饲养动物体内残留，给健康食品卫生安全造成隐患，而本发明通过直接将能够生产生物活性成分的食药用菌接种至如膨化大豆、花生、菜籽等的富含油脂的油料作物粉末与水混合而成的发酵培养基中进行固态发酵，得到了富含多糖、三萜、黄酮等的活性物质的，具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、预防癌症抗等功效的油料作物粕，此油料作物粕有极大潜力完全或部分取代饲料中的抗生素，起到提高被饲养动物成活率的效果。

附图说明

图1：不同食药用菌固态发酵膨化大豆提取所得功能性油脂。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的灵芝5.26、金耳、猴头菇、蛹虫草均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号分别为cgmccno.5.26、cgmccno.5.506、cgmccno.5.111以及cgmccno.3.15498；下述实施例中涉及的大豆膨化粉来自山东渤海油脂工业有限公司，花生、菜籽均购自无锡农贸市场(上述菌株灵芝cgmccno.5.26、金耳cgmccno.5.506、猴头菇cgmccno.5.111、蛹虫草cgmccno.3.15498均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

食药用真菌的种子培养基(m/v)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、vb0.01％。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

功能性油脂和油料作物粕分析：

1、提取

固态发酵后的发酵物在50℃下进行干燥，烘干至含水量5-10％；与正己烷以1:30的质量比混合浸泡搅拌24h；抽滤，取滤液；用旋转蒸发仪50℃旋蒸滤液，得到功能性油脂和油料作物粕。

2、功能性油脂中的脂肪酸种类及其含量的测定

取50mg得到的功能性油脂加入2ml的0.5mol/l的naoh-ch3oh溶液；65℃水浴皂化30min；冷却至室温，加入2ml的14％的bf3-ch3oh溶液；65℃水浴皂化30min；冷却至室温，加入5ml的正己烷振荡3～4min提取脂肪酸甲酯；加入少许的无水na2so4进行脱水处理；10000r/min离心5min；取上层有机相过0.22μm的有机膜备用；在甲酯化过膜后的溶液中以1:1的体积比加入0.2mg/ml的十九烷酸甲酯溶液(以正己烷作为溶剂)作为内标；使用gc-ms对提取物中的脂肪酸的含量进行测定。

3、功能性油脂中的生物活性物质的提取与含量测定

(1)功能性油脂中黄酮类化合物的提取测定

准确称量200mg功能性油脂，加入4ml的70％的乙醇，在80℃水浴下提取2h；取1ml稀释适当倍数的黄酮提取物置于10ml比色管中，依次加入0.2ml5％的nano2溶液摇匀，放置5min；加入0.2ml10％al(no3)3溶液，放置6min；加入7ml的1mol/lnaoh摇匀，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，溶液呈棕红色，放置15min；以蒸馏水作为空白对照，在吸光波长为510nm处测其od值带入标曲计算黄酮的含量；

标准曲线的制作：精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品12.5mg，加入50％的乙醇溶解并定容至50ml，配成浓度为0.25mg/ml的标准品；准确吸取标品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分别置于10ml比色管中，依次加入0.2ml5％的nano2溶液摇匀，放置5min；加入0.2ml10％al(no3)3溶液，放置6min；加入7ml的1mol/lnaoh摇匀，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，溶液呈棕红色，放置15min；以0号作为空白对照，在吸光波长为510nm处测其od值，以吸光度a为横坐标，浓度为纵坐标绘制曲线。

(2)功能性油脂中三萜类化合物的提取测定

精密称取功能性油脂0.2g，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，超声提取2h(每20min摇匀一次)；取1ml提取液于1.5ml的离心管中，4000rpm离心10min，取上清备用；取样品溶液0.1ml，沸水浴蒸干，再分别加入0.2ml的5％香草醛溶液和0.5ml的高氯酸，60℃水浴20min；转移入冰水浴中冷却，再加入5.0ml的冰醋酸，摇匀；利用分光光度计在吸光波长为548nm处测其od值，带入标曲计算其含量；

标准曲线制作：精密吸取度0.1mg/ml熊果酸溶液，0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.20ml置具塞10ml比色管中，水浴加热挥去溶剂，加入新配制的5％的香草醛-冰乙酸溶液0.2ml和0.8ml的高氯酸溶液，在65℃水浴加热15min，取出冰浴冷却，再加入5.0ml冰乙酸，摇匀放置15min，在548nm波长处测定；以吸收度(a)对浓度(c)进行线性回归，得回归方程。

4、油料作物粕中的生物活性物质的提取与含量测定

(1)油料作物粕中多糖的提取测定

取20mg油料作物粕加入4ml的水，在沸水浴中煮3h，10000r/min离心10分钟，取上清液定容待测；取100μl的上清溶液，加入1.9ml的去离子水，对照组为2ml的去离子水；加入1ml的60％的苯酚溶液；加入5ml的浓硫酸，摇匀；冷却后在吸光波长为490nm处测其od值带入标曲计算多糖含量；

标准曲线制作：配制0.04g/l的葡萄糖标准溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml标准品到25ml比色管中，分别加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml的去离子水，加入1ml的60％的苯酚溶液，最后加入5ml的浓硫酸，摇匀，冷却后在吸光波长为490nm处测其od值，绘制标准品曲线。

(2)油料作物粕中黄酮类化合物的提取测定

取200mg油料作物粕加入4ml70％乙醇，在80℃下提取2h；取1ml稀释适当倍数的黄酮提取物置于10ml比色管中，依次加入0.2ml5％的nano2溶液摇匀，放置5min；加入0.2ml10％al(no3)3溶液，放置6min；加入7ml的1mol/lnaoh摇匀，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，溶液呈棕红色，放置15min；以蒸馏水作为空白对照，在吸光波长为510nm处测其od值带入标曲计算黄酮的含量；

标准曲线的制作：精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品12.5mg，加入50％的乙醇溶解并定容至50ml，配成浓度为0.25mg/ml的标准品；准确吸取标品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分别置于10ml比色管中，依次加入0.2ml5％的nano2溶液摇匀，放置5min；加入0.2ml10％al(no3)3溶液，放置6min；加入7ml的1mol/lnaoh摇匀，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，溶液呈棕红色，放置15min；以0号作为空白对照，在吸光波长为510nm处测其od值，以吸光度a为横坐标，浓度为纵坐标绘制曲线。

(3)油料作物粕中三萜类化合物的提取测定

准确称取样品0.5g置于50ml的容量瓶中，加入35ml乙酸乙酯溶解，用超声震动提取30min，取出放冷至室温，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，静置，过滤，弃去初滤液，保留续滤液，作为样品提取液备用；稀释适当倍数，在548nm波长处测定；

标准曲线制作：精密吸取度0.1mg/ml熊果酸溶液，0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.20ml置具塞10ml比色管中，水浴加热挥去溶剂，加入新配制的5％的香草醛-冰乙酸溶液0.2ml和0.8ml的高氯酸溶液，在65℃水浴加热15min，取出冰浴冷却，再加入5.0ml冰乙酸，摇匀放置15min，在548nm波长处测定；以吸收度(a)对浓度(c)进行线性回归，得回归方程。

实施例1：以大豆膨化粉为原料

具体步骤如下：

(1)取80ml种子培养基置于250ml三角瓶中(121℃灭菌30min)，将4℃下保存的食药用真菌菌株取1cm²的小方块接种到灭菌后液体种子培养基，于30℃、150r·min^-1条件下培养7d，得到种子液；

(2)取300g的发酵培养基置于2500ml三角瓶中(121℃灭菌30min)，将种子液按照表1的发酵参数接种至发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵物。

将得到的发酵产物按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行油脂提取，得到功能性油脂和发酵豆粕；将得到的功能性油脂和发酵豆粕按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行分析，分析结果见表2-4，其中，空白组为不进行微生物发酵的原始大豆膨化粉。

原始大豆膨化粉、a组、b组、c组、d组得到的功能性油脂见图1，原始大豆膨化粉提取得到的油脂呈现金黄色；a组得到的功能性油脂颜色较深，为深棕色；b组得到的功能性油脂较a组浅，为浅棕色；c组得到的功能性油脂较b组浅，为深橘色；d组得到的功能性油脂颜色最浅，为浅橘色。

表1发酵参数

表2功能性油脂和发酵豆粕中的生物活性物质的含量

表3功能性油脂中的脂肪酸种类及其含量(mg/g功能性油脂)

表4功能性油脂中的脂肪酸种类及其含量(mg/g功能性油脂)

注：sfa为饱和脂肪酸；sufa为单不饱和脂肪酸；pufa为多不饱和脂肪酸；ufa为不饱和脂肪酸。

由表2可知，经过食药用菌发酵膨化大豆，进一步加工处理得到的功能性油脂、豆粕中均富含生物活性物质，其中，所得的功能性油脂中富含生物活性物质三萜、黄酮，所得的豆粕中富含生物活性物质三萜、黄酮和多糖，这些生物活性物质赋予油脂增加宿主免疫力、预防血管硬化及抑制肿瘤、抗氧化和抑制自由基等生理功能，也使得发酵豆粕的功能性得到改善，饲养价值得到提升；由表3-4可知，功能性油脂中不同脂肪酸含量变化不明显，而不饱和脂肪酸含量丰富，可见，本发明制备的功能性油脂具有更好的保健功效。

实施例2：以花生粉为原料

具体步骤如下：

(1)同实施例1；

(2)同实施例1；

(3)将花生放入热风循环烘箱，在50℃下进行干燥，洪干至含水量为5-10％，之后对其进行剥壳处理，把去壳后的花生磨成细粉，得到花生粉；

(4)以花生粉替代大豆膨化粉，取300g发酵培养基置于2500ml三角瓶中(121℃灭菌30min)，将种子液按照表1的发酵参数接种至发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵物。

将得到的发酵物进行按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行油脂提取，得到功能性油脂和发酵花生粕；将得到的功能性油脂和发酵花生粕按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行分析后，发现功能性油脂和发酵花生粕中均富含生物活性物质，其中，所得的功能性油脂中富含生物活性物质三萜、黄酮，所得的花生粕中富含生物活性物质三萜、黄酮和多糖，生物活性物质的存在，既赋予了油脂一定的生理功能，又改良了花生粕的品质，全面提升了油脂和花生粕的营养价值。

实施例3：以菜籽粉为原料

具体步骤如下：

(1)同实施例1；

(2)同实施例1；

(3)将菜籽放入热风循环烘箱，在50℃下进行干燥，洪干至含水量为5-10％，之后对其进行剥壳处理，把去壳后的菜籽磨成细粉，得到菜籽粉；

(4)以菜籽粉替代大豆膨化粉，取300g发酵培养基置于2500ml三角瓶中(121℃灭菌30min)，将种子液按照表1的发酵参数接种至发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵物。

将得到的发酵物进行按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行油脂提取，得到功能性油脂和发酵菜籽粕；将得到的功能性油脂和发酵菜籽粕按照功能性油脂和油料作物粕分析的方法进行分析后，发现功能性油脂和发酵菜籽粕中均富含生物活性物质，其中，所得的功能性油脂中富含生物活性物质三萜、黄酮，所得的菜籽粕中富含生物活性物质三萜、黄酮和多糖，生物活性物质的存在，既赋予了油脂一定的生理功能，又改良了菜籽粕的品质，全面提升了油脂和菜籽粕的营养价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。