本发明涉及微生物发酵剂技术领域，具体涉及一株能够降解生物胺的植物乳杆菌及其在降低湿腌马鲛鱼生物胺含量中的应用。
背景技术：
湿腌马鲛鱼制品是我国历史悠久的鱼类加工制品，是沿海地区饮食的主要组成部分。新鲜的马鲛鱼经由腌制后风味独特、货架期延长、营养价值得到保存；但是腌制过程中微生物含有的氨基酸脱羧酶会将游离氨基酸分解生成组胺、酪胺、精胺、腐胺等生物胺，使这类食品存在安全问题。组胺和酪胺为引起水产品食物中毒的主要生物胺，而尸胺、腐胺的存在可以增强组胺的毒性作用，因此控制发酵过程生物胺的积累对食品安全非常重要。
针对食品中的生物胺，目前主要有生产工艺控制、化学法、物理法、酶法等控制手段。浙江海洋大学2017年申请了“一种低生物胺含量鱼露的制备方法”(申请号：201711289413.6)，浙江海洋大学2016年申请了“一种水产品中组胺的降解方法”(申请号：201610394461.0)。以上方法具有各自不可避免的局限性：(1)降解生物胺种类少；(2)降解效果差；(3)营养成分的流失、风味的改变；(4)安全性存疑。与上述控制技术不同的是，合理选择发酵剂，尤其是具备降解生物胺能力、不存在安全隐患的微生物，可以有效控制食品中的生物胺积累。
乳酸菌是食品工业中重要的发酵剂；除了对产品的风味有提升作用，乳酸菌可以提升产品的风味，同时具有抑制有害微生物的作用；乳酸菌可以使环境酸化、分泌抗菌物质，从而能够有效抑制一些病原菌及腐败菌。此外，多数乳酸菌安全、健康、无毒害作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用植物乳杆菌降低湿腌马鲛鱼制品中生物胺的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为达到上述目的，本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)yc-6，保藏号cgmccno.16616，于2018年10月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。上述植物乳杆菌分离自发酵食品，采用细菌通用引物27f/1492r进行16srdna序列鉴定，为植物乳杆菌。
本发明同时提供了一种利用所述植物乳杆菌降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：将浓度为106～108cfu/ml的植物乳杆菌菌液作为发酵剂，按原料鱼重量的1％～10％接种至体系内，进行同步腌制；其中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌yc-6，保藏号为cgmccno.16616。
优选方式下，所述利用植物乳杆菌降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
s1、原料预处理：取马鲛鱼，去除头部、尾部及内脏，清洗干净，切成鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：将步骤s1所得鱼段、质量浓度2％～7％的食盐水和106～108cfu/ml植物乳杆菌yc-6菌液混合置于容器内，10～20℃密封放置20～28天，得湿腌马鲛鱼；所述植物乳杆菌yc-6保藏号为cgmccno.16616；
其中，所述鱼段、食盐水和植物乳杆菌yc-6菌液的添加重量比为1:(2～5):(0.01～0.10)。
优选方式下，步骤s1所述鱼段的单块重量为45g；
优选方式下，步骤s2所述容器121℃灭菌20min后使用；所述植物乳杆菌yc-6菌液的制备方法为：将植物乳杆菌yc-6在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至mrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；离心收集菌体，用质量分数0.85％的生理盐水稀释至106～108cfu/ml；
其中，所述mrs琼脂培养基成分为：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉8.0g/l、酵母粉4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、琼脂14.0g/l、吐温801.0g/l，25℃的ph值为6.5±0.2；
所述mrs肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉8.0g/l、酵母浸粉4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、乙酸钠5g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、吐温801.0g/l，5℃的ph值为5.7±0.2。
优选方式下，所述利用植物乳杆菌降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净后切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段45g、135g质量浓度5％的食盐水和0.45g108cfu/ml的植物乳杆菌yc-6菌液混合均匀，置于所述容器中，10℃密封放置腌制24天，得湿腌马鲛鱼；所述植物乳杆菌yc-6保藏号为cgmccno.16616；
其中，所述植物乳杆菌yc-6菌液的制备方法为：将植物乳杆菌yc-6在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至3mlmrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％水溶液，w/v，g/ml)制备成108cfu/ml的菌悬液。
本发明的有益效果是：
本发明提供的植物乳杆菌yc-6，可用于降低发酵鱼制品尤其是湿腌马鲛鱼制品中的生物胺含量，具有非常广泛的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。
实施例1
利用植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净后切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段450g、2250g质量浓度2％的食盐水和22.5g107cfu/ml的植物乳杆菌yc-6菌液混合均匀，置于所述容器中，15℃密封放置腌制20天，得湿腌马鲛鱼；
其中，所述植物乳杆菌yc-6菌液的制备方法为：将植物乳杆菌yc-6在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至3mlmrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％水溶液，w/v，g/ml)制备成107cfu/ml的菌悬液。
取本实施例所得湿腌马鲛鱼，通过丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测鱼肉中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺的含量，检测结果如表1所示。
实施例2
利用植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净后切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段45g、135g质量浓度5％的食盐水和0.45g108cfu/ml的植物乳杆菌yc-6菌液混合均匀，置于所述容器中，10℃密封放置腌制24天，得湿腌马鲛鱼；
其中，所述植物乳杆菌yc-6菌液的制备方法为：将植物乳杆菌yc-6在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至3mlmrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％水溶液，w/v，g/ml)制备成108cfu/ml的菌悬液。
取本实施例所得湿腌马鲛鱼，通过丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测鱼肉中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺的含量，检测结果如表1所示。
实施例3
利用植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段45g、90g质量浓度5％的食盐水(5％，w/w)和4.5g106cfu/ml的植物乳杆菌yc-6菌液混合均匀，置于所述容器中，20℃密封放置腌制28天，得湿腌马鲛鱼；
其中，所述植物乳杆菌yc-6菌液的制备方法为：将植物乳杆菌yc-6在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至3mlmrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％水溶液，w/v，g/ml)制备成106cfu/ml的菌悬液。
取本实施例所得湿腌马鲛鱼，通过丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测鱼肉中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺的含量，检测结果如表1所示。
对比例1
湿腌马鲛鱼制品，包括步骤：
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净后将鱼背部切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段45g、225g质量浓度2％的食盐水混合均匀，置于所述容器中，15℃密封放置腌制20天，得湿腌马鲛鱼；
取本实施例所得湿腌马鲛鱼，通过丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测鱼肉中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺的含量，检测结果如表1所示。
对比例2
利用植物乳杆菌pl-2(cgmccno.13919)降低湿腌马鲛鱼生物胺含量的方法，包括步骤：
其中，所述植物乳杆菌pl-2，分离自泡菜，购自于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为：cgmcc13919；
s1、原料预处理：
马鲛鱼，除去头部、尾部及内脏，洗净后切割成单块重量为45g的鱼段；
s2、制作湿腌马鲛鱼：
将容器清洗后，121℃高温灭菌20min；取步骤s1所得马鲛鱼段45g、225g质量浓度2％的食盐水和2.25g107cfu/ml的pl-2菌液混合均匀，置于所述容器中，15℃密封放置腌制20天，得湿腌马鲛鱼；
其中，所述植物乳杆菌pl-2菌液的制备方法为：将植物乳杆菌pl-2在mrs琼脂培养基平板上划线，37℃、耗氧、静置培养24h，挑取单菌落接种至3mlmrs肉汤培养基中，37℃、耗氧、静置培养12h；10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％水溶液，w/v，g/ml)制备成107cfu/ml的菌悬液。
取本实施例所得湿腌马鲛鱼，通过丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测鱼肉中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺的含量，检测结果如表1所示。
植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)对湿腌马鲛鱼中生物胺含量的影响如表1所示：
表1植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)对轻腌马鲛鱼中生物胺含量的影响
实验结果表明，通过接种植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)，湿腌马鲛鱼体系内的生物胺被很好的抑制，实施例1、2、3中六种生物胺总含量的降解率分别为53.81％、58.53％、55.63％，特别是对组胺的降解率分别达为86.50％、89.53％、86.26％；相较于对比例2，植物乳杆菌yc-6(cgmccno.16616)对生物胺的降解效率更好，因此该菌株可作为低生物胺湿腌马鲛鱼产品的发酵剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。