一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法。

背景技术：

酸鲊鱼，是苗族及侗族少数名族的一种传统佳肴。酸鲊鱼，可生食，亦可炒食或放上辣椒煮成酸辣汤，味道鲜嫩爽口，使人食欲倍增。但是酸鲊鱼的制作以家庭作坊式的传统工艺为主，存在诸多问题，如规模小、季节性强、产品质量不稳定、生物胺含量高、生产周期长(一般为28～60天)、产品无标准、难以实现工业化生产等缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于开发一种可以快速发酵酸鲊鱼的方法，运用脂肪酶的控制脂解的能力来释放更多的游离脂肪酸以及通过乳酸菌的代谢二者相结合，在内源酶与外源酶的共同作用下，有效缩短了酸鲊鱼的发酵周期。脂肪酶可控制脂解，这导致多不饱和脂肪酸(pufa)及游离脂肪酸的释放。在促进产品风味的同时，不仅改善了产品的营养价值、感官特性，还保障了酸鲊鱼产品的安全性。

为达到上述目的，本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)24，保藏号cgmccno.16613，于2018年10月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。

本发明提供了一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，切成小块备用；实际操作时，可根据需要对鱼进行切块或者不切块，切块大小不影响酸鲊鱼发酵；

s2、发酵：将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐、浓度为10⁶～10⁸cfu/ml的植物乳杆菌24菌液和浓度为10000～20000u/ml的脂肪酶液混合后搅拌均匀；装入容器中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧容器的盖子，10℃～30℃放置发酵20～30天，得酸鲊鱼；其中，所述鱼块、米粉、食盐的重量比为(90～115):(50～70):(2～4)；所述浓度为10⁶～10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液的添加量为0.0006ml～0.06ml/g鱼块；所述10000～20000u/ml脂肪酶液的添加量为0.005～0.025ml/g鱼块；所述米粉为大米炒熟后磨成的粉，所述植物乳杆菌24保藏号为cgmccno.16613。

优选方式下，步骤s1所述鱼为鲫鱼、鳙鱼、鲶鱼、草鱼或鲤鱼；也可以根据需要，选取其他种类的鱼。

优选方式下，步骤s2所述10⁶～10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30～37℃、16～24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到mrs肉汤液体培养基，150～250rpm、37℃、培养16～24h，所得菌液5000～10000×g，室温离心5～10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁶～10⁸cfu/ml备用。

优选方式下，步骤s2所述10000～20000u/ml脂肪酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至10000～20000u/ml；所述饮用水为灭菌水或将水烧开后晾凉。

优选方式下，所述基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:2将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液和20000u/ml脂肪酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃发酵30天，得酸鲊鱼；其中，所述米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.06ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液300ml)；脂肪酶液添加量为0.025ml/g鱼块、(共添加脂肪酶液125ml)；

所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基35℃、24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，250rpm、37℃、培养24h，所得菌液8000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁸cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；所述脂肪酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至20000u/ml。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法采用脂肪酶与植物乳杆菌24混合的方法制备酸鲊鱼，使得发酵周期缩短。

2、本发明方法采用脂肪酶与植物乳杆菌24混合的方法制备酸鲊鱼，游离脂肪酸(ffa)，多不饱和脂肪酸(pufa)，ω-3和ω-6的含量增加，有助于酸鲊鱼中营养成分的提高。硬脂酸(c18：0)含量减少，可能诱导硬脂酸去饱和使酸鲊鱼中的饱和脂肪酸(sfa)有效降低。

3、本发明方法采用脂肪酶与植物乳杆菌24混合的方法，使酸鲊鱼不会因缩短发酵时间，而造成风味不足。

4、本发明方法采用脂肪酶与植物乳杆菌24混合的方法，鱼肉中的生物胺含量有效降低，保证了产品的安全性。酸鲊鱼鱼肉中的生物胺含量有效降低，其中组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺分别降低1.8～2.5倍、1.2～2.5倍、1.2～2.5倍、1.4～3.5倍、1.0～2.0倍、1.5～2.7倍。

5、本发明方法采用脂酶与植物乳杆菌24混合的方法，提高了酸鲊鱼的滋味和口感。

综上所述，本发明运用脂肪酶和植物乳杆菌24二者相结合发酵酸鲊鱼，在内源酶与外源酶的共同作用下改善酸鲊鱼品质，增加了游离脂肪酸及不饱和脂肪酸的含量，提升酸鲊鱼风味与滋味，缩短发酵周期，抑制了酸鲊鱼的生物胺含量。

附图说明

图1为本发明制备的酸鲊鱼的电子鼻测定结果；

图2为本发明制备的酸鲊鱼的生物胺含量；

图3为本发明制备的酸鲊鱼的的感官评定结果。

具体实施方式

以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本专利，但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围由权利要求来决定。

下述实施例中的脂肪酶购自于：南宁庞博生物有限公司；米粉购自于：成芳特色养生杂粮馆。

实施例1：

一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比90:70:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液和10000u/ml脂肪酶酶液搅拌均匀；装入发酵罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧发酵罐的盖子，10℃密封放置发酵20天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)；脂肪酶酶液添加量为0.005ml/g鱼块(共添加脂肪酶酶液25ml)；

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，150rpm、37℃、培养16h，所得菌液5000×g，室温离心10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述脂肪酶酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至10000u/ml。

实施例2：

一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115:50:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁶cfu/ml植物乳杆菌24菌液和15000u/ml脂肪酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，30℃密封放置发酵25天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.0006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液3ml)；脂肪酶酶液添加量为0.0066ml/g鱼块、(共添加脂肪酶酶液33ml)；

其中，所述10⁶cfu/ml植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、18h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养16h，所得菌液10000×g，室温离心8min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁶cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述脂肪酶酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至15000u/ml。

实施例3：

一种基于脂肪酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:2将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液和20000u/ml脂肪酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵30天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.06ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液300ml)；脂肪酶液添加量为0.025ml/g鱼块(共添加脂肪酶液125ml)；

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基35℃、24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，250rpm、37℃、培养24h，所得菌液8000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁸cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述脂肪酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至20000u/ml。

对比例1：

传统酸鲊鱼的制备方法，包括步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比110:70:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃发酵60天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，组别为对比例1。

对比例2：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液充分搅拌均匀，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)，组别为对比例2。

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用。

对比例3：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10000u/ml脂肪酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，脂肪酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加脂肪酶酶液25ml)，组别为对比例3；

所述脂肪酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至10000u/ml。

对比例4：

一种基于脂肪酶与植物乳杆菌(购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏号cicc22858)混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鲫鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115:70:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌菌液和10000u/ml脂肪酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，所述植物乳杆菌菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)；脂肪酶酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加脂肪酶酶液25ml)，组别为对比例4；

其中，所述植物乳杆菌菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌(购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”，保藏号cicc22858)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌菌液备用；

所述脂肪酶液的制备方法为：使用饮用水将脂肪酶稀释至10000u/ml。

对本发明制备的酸鲊鱼的理化指标、脂肪酸甲酯、风味、电子鼻(滋味)、生物胺以及感官特性进行了测定。

一、脂肪酸含量的测定

运用气相色谱分析脂肪酸。对各组酸鲊鱼中的脂肪酸进行测定。结果如表1所示，与对比例1相比，除了c18:0、c14:1，实例组制备酸鲊鱼中的20种游离脂肪酸(ffa)含量均有较明显的增长，特别是实例组3游离脂肪酸(ffa)增加最多,表明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合可促进脂肪分解和游离脂肪酸(ffa)的释放。与对比例1相比，实例组制备的酸鲊鱼的多不饱和脂肪酸(pufa)增加，ω-3和ω-6的含量在发酵结束后均增加，特别是实例组3多不饱和脂肪酸(pufa)增加最多。表明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合可加速释放出更多的多不饱和脂肪酸，有助于酸鲊鱼的营养成分的提升。与对比例1相比，实例组制备的酸鲊鱼(c18：0)含量减少，表明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合可能诱导硬脂酸去饱和。与对比例1组相比，实施例组制备的酸鲊鱼饱和脂肪酸(sfa)较低，说明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合发酵酸鲊鱼可降低酸鲊鱼中的饱和脂肪酸。表明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合有助于营养成分的增加。

表1酸鲊鱼中总脂质中脂肪酸含量(g/100g脂肪酸)

二、风味测定

对本发明制得的酸鲊鱼进行挥发性化合物的测定，采用顶空固相微萃取技术对酸鲊鱼中的挥发性化合物进行分离，结果如表3所示，其中酸鲊鱼中主要的挥发性成分有醛类、醇类、酮类、酯类、烯烃类、酸类等。与对比例相比，实施例组所得酸鲊鱼中的关键风味物质：己醛、戊醛、庚醛、苯甲醛、1,3-丁二醇与对比例相比，分别提高了1.1～1.3倍、1.5～1.8倍、2.2～3.7倍、2.3～2.4倍、2.0～2.3倍。

表2酸鲊鱼主要风味物质

三、电子鼻测定

使用电子鼻对本发明实施例和对比例所得酸鲊鱼的风进行测定，采用pen3型便携式电子鼻(德国airsense公司)进行测定，结果如图1所示，从电子鼻的结果可看出，与对比例相比，在发酵结束后，实施例组制备的酸鲊鱼的风味比较大，说明实施例的酸鲊鱼风味是增多的；与对比例1(传统酸鲊鱼的制备方法)相比，实施例1酸鲊鱼的风味相似度为83.0％，与对比例1(传统酸鲊鱼的制备方法)相比，实施例2酸鲊鱼的风味相似度为80.6％，与对比例1(传统酸鲊鱼的制备方法)相比，实施例3酸鲊鱼的风味相似度为86.8％，因此实施例组的方法对酸鲊鱼发酵是有效的，可以改善酸鲊鱼的风味。

表3pen3型电子鼻传感器

四、生物胺含量的测定

生物胺是评价水产品的安全性的重要指标之一，本发明采用液相色谱与质谱联用仪对对比例和实施例制得酸鲊鱼的生物胺进行了分析，如图2所示，实施例组所得酸鲊鱼中生物胺总量少于对比例组。传统酸鲊鱼产品中的主要生物胺为酪胺，实施例组的酪胺远远低于对比例组，生物胺的结果说明脂肪酶与植物乳杆菌24耦合会减少酸鲊鱼产品中的生物胺含量，产品的安全性得到了提高。与对比例1(传统方法)组相比，实施例组中的组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺分别降低2.19～3.93倍、2.73～3.27倍、1.24～1.49倍、1.51～1.86倍、1.98～2.22倍、2.17～3.39倍。

五、感官评价

对几组产品进行了感官评价，评分标准如表4所示。评分结果如图3所示。由图3可看出，与对比例组相比，实施例组的组织形态、硬度、风味等均比对照组评分高，说明植物乳杆菌24与脂肪酶相结合的方法都是在可接受范围内，还可以提高接受度。与对比例相比较，可以看出无论是风味还是色泽都是实施例组较高，所以从感官的结果来看，实施例组发酵酸鲊鱼是大众能够接受的产品，明显提升了酸鲊鱼的品质和口感。

表4酸鲊鱼感官评价表

综上所述，本发明使用酶菌耦合的方法来发酵酸鲊鱼可以提高酸鲊鱼的品质和风味，是一种良好的发酵酸鲊鱼的技术，在此条件下，发酵周期有效缩短，风味也得到了较大的提升，呈鲜味的必需氨基酸都得到了不同程度的提升，感官特性软硬适中，大众可接受度高，其滋味和口感也有提升，且生物胺含量降低，安全性得到了保障。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。