一种基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法。

背景技术：

酸鲊鱼，是苗族及侗族少数名族的一种传统佳肴。酸鲊鱼，可生食，亦可炒食或放上辣椒煮成酸辣汤，味道鲜嫩爽口，使人食欲倍增。但是酸鲊鱼的制作以家庭作坊式的传统工艺为主，存在诸多问题，如规模小、季节性强、产品质量不稳定、生物胺含量高、生产周期长(一般为两个月)、产品无标准、难以实现工业化生产等缺陷。

酸鲊鱼风味的形成不仅只是依靠乳酸菌代谢产生，鱼体自身还含有大量的内源酶会使蛋白质降解，释放出游离氨基酸，这就为微生物提供了可利用的底物。然而内源酶的释放需要较长的时间，对风味的增加起到的作用比较慢酸鲊鱼。中性蛋白酶可以水解蛋白质成为小分子肽，释放游离氨基酸来。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，选择中性蛋白酶与内源酶共同作用，将动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，从而释放更多的游离氨基酸增加酸鲊鱼的风味与滋味，提供一种酶菌耦合的快速发酵酸鲊鱼的方法，在促进产品风味的同时，改善了产品的营养价值、感官特性，保障了酸鲊鱼产品的安全性。

为达到上述目的，本发明提供了一株食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)m3，保藏号cgmccno.16611，于2018年10月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。

本发明还提供了一种基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，切成小块备用；实际操作时，可根据需要对鱼进行切块或者不切块，切块大小不影响酸鲊鱼发酵；

s2、发酵：将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐、浓度为10⁶～10⁸cfu/ml的食窦魏斯氏菌m3菌液和浓度为10000～20000u/ml的中性蛋白酶液混合后搅拌均匀；装入容器中混合发酵，用米粉封住最上层，盖紧容器的盖子，20℃～30℃密封放置发酵20～30天，得酸鲊鱼；其中，鱼块、米粉、食盐的重量比为(90～115)∶(50～70)∶(2～4)；以添加鱼块的总重量计，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.0006ml～0.06ml/g鱼块；中性蛋白酶液的添加量为0.005～0.025ml/g鱼块；所述米粉为大米炒熟后磨成的粉，食窦魏斯氏菌m3的保藏号为cgmccno.16611。

优选方式下，步骤s1所述鱼为鲫鱼、鳙鱼、鲶鱼、草鱼或鲤鱼等；也可以根据需要，选取其他种类的鱼。

优选方式下，步骤s2所述10⁶～10⁸cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30～37℃、16～24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到mrs肉汤液体培养基，150～250rpm、37℃、培养16～24h，所得菌液5000～10000×g，室温离心5～10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁶～10⁸cfu/ml备用。

优选方式下，步骤s2所述10000～20000u/ml中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至1000～20000u/ml；所述饮用水为灭菌水或将水烧开后晾凉。

优选方式下，所述基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100∶65∶3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液和10000u/ml中性蛋白酶酶液混合后搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌m3菌液30ml)；中性蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块(共25ml)；

其中，所述10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、18h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到mrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养16h，所得菌液10000×g，室温离心8min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得食窦魏斯氏菌m3菌液备用；

所述10000u/ml中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至10000u/ml，得中性蛋白酶液。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法采用中性蛋白酶与乳酸菌混合的方法，使得发酵周期缩短。

2、本发明方法采用中性蛋白酶与乳酸菌混合的方法，提高了酸鲊鱼中必需氨基酸的含量，其中丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸分别提高1.8～3.0倍、1.2～2.0倍、1.0～1.5倍、1.0～2.0倍、1.5～2.5倍。

3、本发明方法采用中性蛋白酶与乳酸菌混合的方法，促进了酸鲊鱼中的关键风味物质的产生，己醛、戊醛、庚醛、苯甲醛、1，3-丁二醇等关键风味物质分别提高了1.0～1.5倍、1.2～2.0倍、2.0～3.0倍、1.8～3.5倍、1.2～2.5倍。

4、本发明方法采用中性蛋白酶与乳酸菌混合的方法，酸鲊鱼肉中的生物胺含量有效降低，组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺分别降低1.2～2.5倍、1.0～2.5倍、1.2～2.5倍、1.0～3.5倍、1.2～2.2倍、1.2～2.5倍，保证了产品的安全性。

综上所述，本发明运用中性蛋白酶的水解能力来释放更多的游离氨基酸以及通过食窦魏斯氏菌m3的代谢二者相结合，在内源酶与外源酶的共同作用下，有效缩短了酸鲊鱼的发酵周期，在促进产品风味的同时，改善了产品的营养价值、感官特性，保障了酸鲊鱼产品的安全性。

附图说明

图1为本发明制备的发酵酸鲊鱼电子鼻测定结果；

图2为本发明制备的发酵酸鲊鱼的生物胺含量；

图3为本发明制备的发酵酸鲊鱼的感官评定结果。

具体实施方式

以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本专利，但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围有权利要求来决定。

下述实施例中的中性蛋白酶购自于：南宁庞博生物有限公司；米粉购自于：成芳特色养生杂粮馆

实施例1：

一种基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比90∶50∶2将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁶cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液和15000u/ml中性蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，20℃密封放置发酵30天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.0006ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌m3菌液3ml)；中性蛋白酶液添加量为0.0066ml/g鱼块、(共添加中性蛋白酶液33ml)；

其中，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，150rpm、37℃、培养16h，所得菌液5000×g，室温离心10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁶cfu/ml，得食窦魏斯氏菌m3菌液备用；

所述中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至15000u/ml。

实施例2：

一种基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100∶65∶3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液和10000u/ml中性蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌m3菌液30ml)；中性蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加中性蛋白酶液25ml)；

其中，所述10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、18h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养16h，所得菌液10000×g，室温离心8min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得食窦魏斯氏菌m3菌液备用；

所述中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至10000u/ml。

实施例3：

一种基于中性蛋白酶实现混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115∶70∶4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁸cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液和20000u/ml中性蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，30℃密封放置发酵20天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.06ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌m3菌液3ml)；中性蛋白酶液添加量为0.025ml/g鱼块、(共添加中性蛋白酶液125ml)；

其中，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基35℃、24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，250rpm、37℃、培养24h，所得菌液8000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得食窦魏斯氏菌m3菌液备用；

所述中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至20000u/ml。

对比例1：

传统酸鲊鱼的制备方法，包括步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比110∶70∶4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃发酵60天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，组别为对比例1。

对比例2：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100∶65∶3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌m3菌液充分搅拌均匀，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌m3菌液30ml)，组别为对比例2。

其中，所述食窦魏斯氏菌m3菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌m3(cgmccno.16611)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得食窦魏斯氏菌m3菌液备用。

对比例3：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100∶65∶3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10000u/ml中性蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，中性蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加中性蛋白酶液25ml)，组别为对比例3；

所述中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至10000u/ml。

对比例4：

s1、原料预处理：活鲫鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115∶70∶4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml食窦魏斯氏菌菌液和10000u/ml中性蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述食窦魏斯氏菌菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加食窦魏斯氏菌菌液30ml)；中性蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加中性蛋白酶液25ml)，组别为对比例4；

其中，所述食窦魏斯氏菌菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的食窦魏斯氏菌(购买于“国家微生物菌种保藏中心”-北纳生物，保藏号bncc206838)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得食窦魏斯氏菌菌液备用；

所述中性蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将中性蛋白酶稀释至10000u/ml。

在完成制作酸鲊鱼后，对酸鲊鱼的理化指标游离氨基酸、风味、电子鼻(滋味)、生物胺以及感官评定进行了测定。

一、游离氨基酸的测定

运用高效液相色谱仪对组酸鲊鱼中的必需氨基酸进行测定，结果如表1。亮氨酸、异亮氨酸可以转化成a-酮酸，进一步生成支链酮、醛、酸等物质，从表1中可以看出这两种氨基酸与对比例组相比，实施例组均较高，说明中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合会释放更多的游离氨基酸，可以水解更多的蛋白，加速释放出更多的呈味氨基酸，增加酸鲊鱼的风味。组氨酸可以通过脱羧反应生成组胺，组胺经fda规定鱼类食品中含量≤50mg/kg，可以从表1中得出结论，均未超出标准，而实施组有效减低了组氨酸的含量，表明中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3有可能可以降低生物胺的含量，确保酸鲊鱼的安全性。

表1游离氨基酸含量表

二、风味测定

对本发明制得的酸鲊鱼进行挥发性化合物的测定，采用顶空固相微萃取技术对酸鲊鱼中的挥发性化合物进行分离，结果见表2。从表2可看出，其中酸鲊鱼中主要的挥发性成分有醛类、醇类、酮类、酯类、烯烃类、酸类等。其中与对比例相比，实施例组中的己醛、戊醛、庚醛、苯甲醛、1，3-丁二醇等关键风味物质分别提高了1.02～1.25倍、1.46～1.69倍、2.29～3.63倍、2.28～2.39倍、2.00～2.31倍。

三、电子鼻测定

使用电子鼻对本发明实施例和对比例所得酸鲊鱼的风味进行测定，结果如图1所示。从电子鼻的结果可看出，七组试验中，实施例组的风味物质比对比例组的较好一点，说明中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合对酸鲊鱼的发酵形成风味的贡献是最大的，从相似度来看实施例三组的平均相似度与对比例1(传统方法)相比达到86％，这也就是说中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合可以提高酸鲊鱼风味，但不会改变其原有的风味。

四、生物胺含量的测定

生物胺是评价水产品的安全性的重要指标之一，本发明采用液相色谱与质谱联用仪对对比例和实施例制得酸鲊鱼的生物胺进行了分析，如图2所示。从图中可看出，实施例组发酵酸鲊鱼中生物胺总量少于对比例组。传统酸鲊鱼产品中的主要生物胺为酪胺，实施例组的酪胺远远低于对比例组，生物胺的结果说明中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合会减少酸鲊鱼产品中的生物胺含量，产品的安全性得到了提高。与对比例1(传统方法)组相比，实施例组中的组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺分别降低2.13～3.28倍、1.96～2.35倍、1.80～3.05倍、1.43～1.99倍、2.59～3.27倍、2.78～3.29倍。

五、感官评价

对本发明实施例和对比例制备的酸鲊鱼进行感官评价，评分标准如表3所示。评分结果如图3所示。由图3可看出，与对比例组相比，实施例组中的风味、气味、组织形态与之相似，说明中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合不会对酸鲊鱼造成不良气味，而且在大众接受的范围内，其风味也比对照组增强，与对比例1(传统方法)比较，滋味相似度达到91％左右。所以从感官的结果来看，中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3耦合可以提高酸鲊鱼的品质，综合用气质联用仪测定的挥发性成分及感官评定而言，说明仪器检测到的与人直观感受到的有略微差别，但是实施例组的风味得到了提升，品质也提高，明显改善了酸鲊鱼的滋味。

表3酸鲊鱼感官评价表

综上所述，中性蛋白酶与食窦魏斯氏菌m3共同作用对发酵酸鲊鱼改善风味起到有效作用，发酵周期缩短，风味、营养价值、感官特性以及安全性都得到了提不同程度的提高。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。