一种大豆低聚肽及其制备方法与流程

本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种大豆低聚肽及其制备方法。

背景技术：

大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶酶解作用后，再分离、纯化得到的混合物，大豆肽的氨基酸吸收、转运速度均高于含等量氨基酸的蛋白质和游离氨基酸，具有调节免疫功能、抗氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳等功能特性。低聚肽是指含有2～6个氨基酸的肽。肽本质上就是一种低分子量的蛋白质，可以不经过消化而被直接吸收。

硒(selenium，se)是一种具有抗氧化特性的人体必需微量营养素，具有增强机体免疫、预防癌症、防治心血管疾病、延缓人体衰老的功能，同时，对重金属引起的中毒还具有一定的保护和解毒作用。缺硒会引起克山病、大骨节病、肝病、心血管疾病、肿瘤、心肌坏死等疾病。但是，在世界许多地区硒分布不均匀，尤其在我国的一些偏远地区，人们由于食用缺硒土壤中生长的植物性食品，可能患有食用硒缺乏症。who提出成人硒生理需求量为40μg/天，膳食硒供给量为50-250μg/天。

植物、酵母都具有一定富集硒能力，能主动吸收环境中的硒，将无机硒转化为有机硒。硒酵母、富硒西蓝花、碎米荠、富硒大豆都能以蛋白质形式结合硒，是目前低硒人群补硒的主要食品。但是由于蛋白质的消化率低，特别是老年人群和一些蛋白酶分泌不足的特殊人群，硒的吸收率也无法保障。此外，部分低硒植物蛋白，蛋白质摄入了数百克，而硒的吸收率只有几微克，达不到补硒的推荐剂量。

目前，常规酶解方法制备富硒大豆低聚肽存在硒损失率高，硒/蛋白含量较低等问题。大豆富集的硒80％与蛋白结合，其中硒是以硒代胱氨酸(se-cys)和硒代甲硫氨酸(se-met)形态存在，硒代甲硫氨酸占比在75％以上。富硒大豆低聚肽的富硒能力与甲硫氨酸，胱氨酸含量有关。但是富硒大豆蛋白存在壳核结构，疏水性的甲硫氨酸埋在疏水中心内侧，不易被酶解到，无法大量富集于酶解肽段，易造成硒损失。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种大豆低聚肽的制备方法，制备得到的大豆低聚肽有机硒含量高，硒吸收速度快。

本发明的目的之二在于提供一种大豆低聚肽。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种大豆低聚肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)取富硒大豆豆粕在酸性条件下加水萃取，取上清液，加酸至出现沉淀，离心后取沉淀，即为富硒大豆蛋白乳胶；

(2)将上述步骤(1)的富硒大豆蛋白乳胶加水稀释，得到富硒大豆蛋白溶液，杀菌处理；

(3)取上述步骤(2)中杀菌后的富硒大豆蛋白溶液进行酶解，酶解过程如下：酶解过程的起始ph值为9.0-9.5，首先加入碱性蛋白酶充分酶解，然后加入中性蛋白酶继续酶解，最后加入胰蛋白酶完成酶解，优选的，碱性蛋白酶可选米曲霉产碱性蛋白酶，中性蛋白酶可选米曲霉中性蛋白酶，胰蛋白酶可选地衣芽孢杆菌胰蛋白酶，将完成酶解的溶液进行超滤得到富硒大豆低聚肽液；

(4)将上述步骤(3)的富硒大豆低聚肽液经浓缩、干燥得到大豆低聚肽粉。

进一步地，上述步骤(3)中碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的加入总量为富硒大豆蛋白溶液的0.5-1.5％，其中碱性蛋白酶的含量至少为40％。

进一步地，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的用量比例为2:1-2:1。

进一步地，首先加入碱性蛋白酶作用1.5-2h，然后加入中性蛋白酶作用1-1.5h，最后加入胰蛋白酶作用0.5-1h。

进一步地，上述步骤(1)中萃取过程为：在45-55℃，ph＝6.3-6.8的条件下加入10-15倍大豆豆粕重量的水，上述用量的水分两次进行萃取，每次萃取10-20min。

进一步地，上述步骤(1)中加酸至出现沉淀的ph值为4.2-4.4。

进一步地，上述步骤(2)中将富硒大豆蛋白乳胶加水稀释为白利度在7-12％的富硒大豆蛋白溶液，进行高温瞬时杀菌。

进一步地，高温瞬时杀菌的温度为145-180℃，杀菌时间为15-45s，然后降温至50-60℃。

进一步地，上述步骤(1)中富硒大豆豆粕为富硒大豆经低温脱油制备得到。

进一步地，上述步骤(3)中超滤选用截留分子量为1000-1500da的超滤膜。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种富硒大豆低聚肽，由上述方法制备得到。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种富硒大豆低聚肽的制备方法，将富硒大豆豆粕萃取后加酸沉淀，稀释后得到的富硒大豆蛋白和富硒大豆相比有机硒保留率较高，通过依次加入碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶分步酶解，得到的富硒大豆低聚肽液的有机硒/蛋白值和甲硫氨酸/蛋白值相比富硒大豆蛋白溶液均有提高。本发明还提供一种富硒大豆低聚肽，平均分子量590-790da，以上述富硒大豆低聚肽为载体，硒的吸收速度比以富硒大豆蛋白为载体快，体内的最高血硒峰值是摄入含等量有机硒的大豆富硒蛋白的1.10-1.35倍，吸收率更高，可以作为人体补硒的优选方式，在提高免疫力方面发挥更好的效果。

附图说明

图1为试验例1中大鼠血浆中硒含量(a)与总氨基酸(b)平均浓度-时间曲线(`x±sd，n＝8)；

图2为试验例2中不同分组血清总蛋白含量(a)，白蛋白含量(b)的结果统计图，其中*代表与模型组相比有显著差异；#代表与阳性对照组相比有显著差异；**代表与模型组相比有极显著差异；##代表与阳性对照组相比有极显著差异；

图3为试验例3中不同分组白细胞含量(a)，淋巴细胞含量(b)的结果统计图，其中*代表与模型组相比有显著差异；**代表与模型组相比有极显著差异；+代表与富硒低聚肽组相比有显著差异；

图4为试验例4中不同分组脾脏il-2含量比较结果图，其中*代表与模型组相比有显著差异；**代表与模型组相比有极显著差异；+代表与富硒低聚肽组相比有显著差异。

具体实施方式

下面，结合附图及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种大豆低聚肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)富硒大豆经过低温脱油，得到富硒大豆豆粕，蛋白含量56％，豆粕有机硒含量为39.5μg/g，取上述富硒大豆豆粕在55℃，ph＝6.8的条件下加10倍大豆豆粕重量的水萃取，上述用量的水分两次进行萃取，每次萃取20min，离心取上清液，加酸至ph值为4.4出现沉淀，离心后取沉淀，即为富硒大豆蛋白乳胶，富硒大豆蛋白乳胶的硒/蛋白值为68.0μg/g，甲硫氨酸/蛋白值为105μmol/g，与富硒大豆豆粕相比硒保留率96.4％；

(2)将上述步骤(1)的富硒大豆蛋白乳胶加水稀释成白利度(brix)在7％的富硒大豆蛋白溶液，进行高温瞬时杀菌，杀菌的温度为180℃，杀菌时间为15s，然后降温冷却至60℃；

(3)取上述步骤(2)中杀菌后的富硒大豆蛋白溶液进行酶解，酶解过程如下：酶解过程的起始ph值为9.5，首先加入碱性蛋白酶作用2h，然后加入中性蛋白酶作用1.5h，最后加入胰蛋白酶作用1h，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的用量比例为2:1:1，三种蛋白酶的加入总量为富硒大豆蛋白溶液的1.5％，具体的，碱性蛋白酶为米曲霉产碱性蛋白酶，中性蛋白酶为米曲霉中性蛋白酶，胰蛋白酶为地衣芽孢杆菌胰蛋白酶，将完成酶解的溶液用截留分子量为1500da的超滤膜进行超滤，通过膜的低聚肽比例占过滤前总蛋白的60％，得到富硒大豆低聚肽液，富硒低聚肽液的有机硒/蛋白值为115μg/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.69倍，富硒低聚肽液的甲硫氨酸/蛋白值是181μmol/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.72倍，富硒大豆低聚肽液平均分子量为620da；

(4)将上述步骤(3)的富硒大豆低聚肽液经浓缩、干燥得到大豆低聚肽粉。

实施例2

一种大豆低聚肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)富硒大豆经过低温脱油，得到富硒大豆豆粕，蛋白含量51％，豆粕有机硒含量为32.5μg/g，取上述富硒大豆豆粕在45℃，ph＝6.3的条件下加15倍大豆豆粕重量的水萃取，上述用量的水分两次进行萃取，每次萃取10min，离心取上清液，加酸至ph值为4.2出现沉淀，离心后取沉淀，即为富硒大豆蛋白乳胶，富硒大豆蛋白乳胶的硒/蛋白值为61.5μg/g，甲硫氨酸/蛋白值为98μmol/g，与富硒大豆豆粕相比硒保留率96.5％；

(2)将上述步骤(1)的富硒大豆蛋白乳胶加水稀释成白利度(brix)在12％的富硒大豆蛋白溶液，进行高温瞬时杀菌，杀菌的温度为145℃，杀菌时间为45s，然后降温冷却至50℃；

(3)取上述步骤(2)中杀菌后的富硒大豆蛋白溶液进行酶解，酶解过程如下：酶解过程的起始ph值为9.0，首先加入碱性蛋白酶作用1.5h，然后加入中性蛋白酶作用1h，最后加入胰蛋白酶作用0.5h，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的用量比例为2:2:1，三种蛋白酶的加入总量为富硒大豆蛋白溶液的0.5％，具体的，碱性蛋白酶为米曲霉产碱性蛋白酶，中性蛋白酶为米曲霉中性蛋白酶，胰蛋白酶为地衣芽孢杆菌胰蛋白酶，将完成酶解的溶液用截留分子量为1000da的超滤膜进行超滤，通过膜的低聚肽比例占过滤前总蛋白的50.3％，得到富硒大豆低聚肽液，富硒低聚肽液的有机硒/蛋白值为105μg/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.67倍，富硒低聚肽液的甲硫氨酸/蛋白值是158μmol/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.61倍，富硒大豆低聚肽液平均分子量为750da；

(4)将上述步骤(3)的富硒大豆低聚肽液经浓缩、干燥得到大豆低聚肽粉。

实施例3

一种大豆低聚肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)富硒大豆经过低温脱油，得到富硒大豆豆粕，蛋白含量54％，豆粕有机硒含量为35.5μg/g，取上述富硒大豆豆粕在50℃，ph＝6.5的条件下加12倍大豆豆粕重量的水萃取，上述用量的水分两次进行萃取，每次萃取15min，离心取上清液，加酸至ph值为4.3出现沉淀，离心后取沉淀，即为富硒大豆蛋白乳胶，富硒大豆蛋白乳胶的硒/蛋白值为65.0μg/g，甲硫氨酸/蛋白值为100μmol/g，与富硒大豆豆粕相比硒保留率96.4％；

(2)将上述步骤(1)的富硒大豆蛋白乳胶加水稀释成白利度(brix)在10％的富硒大豆蛋白溶液，进行高温瞬时杀菌，杀菌的温度为150℃，杀菌时间为30s，然后降温冷却至55℃；

(3)取上述步骤(2)中杀菌后的富硒大豆蛋白溶液进行酶解，酶解过程如下：酶解过程的起始ph值为9.3，首先加入碱性蛋白酶作用1.8h，然后加入中性蛋白酶作用1.2h，最后加入胰蛋白酶作用0.8h，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的用量比例为2:1:1，三种蛋白酶的加入总量为富硒大豆蛋白溶液的1.0％，具体的，碱性蛋白酶为米曲霉产碱性蛋白酶，中性蛋白酶为米曲霉中性蛋白酶，胰蛋白酶为地衣芽孢杆菌胰蛋白酶，将完成酶解的溶液用截留分子量为1500da的超滤膜进行超滤，通过膜的低聚肽比例占过滤前总蛋白的60％，得到富硒大豆低聚肽液，富硒低聚肽液的有机硒/蛋白值为110μg/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.69倍，富硒低聚肽液的甲硫氨酸/蛋白值是165μmol/g，是富硒大豆蛋白溶液的1.65倍，富硒大豆低聚肽液平均分子量为790da；

(4)将上述步骤(3)的富硒大豆低聚肽液经浓缩、干燥得到大豆低聚肽粉。

对比例1

(1)富硒大豆经过低温脱油，得到富硒大豆豆粕，蛋白含量52％，豆粕有机硒含量38.4μg/g，在55℃，采用传统碱溶-酸沉法提取富硒大豆蛋白，ph＝8下15倍重量的水分两次萃取富硒大豆豆粕粉，每次15min，离心取上清液，上清液调整到ph＝4.5沉淀，离心去除上清，获得富硒大豆蛋白乳胶，富硒大豆蛋白乳胶的硒/蛋白值为54.7μg/g，甲硫氨酸/蛋白值为67μmol/g，与富硒大豆豆粕相比硒保留率74％。和实施例1至3相比，对比例1的有机硒含量损失较大。

对比例2

对比例2和实施例1的区别为酶解过程不同：直接加入组成为碱性蛋白:木瓜蛋白:胰蛋白酶:风味蛋白酶＝1:1:1:1的复合酶进行酶解，富硒低聚肽液的有机硒/蛋白值为60.6μg/g，是富硒大豆蛋白溶液的0.99倍，富硒低聚肽液的甲硫氨酸/蛋白值是74μmol/g，是富硒大豆蛋白溶液的0.70倍。可以看出调整酶解过程后富硒大豆低聚肽的得率相比实施例1较低，并且富硒低聚肽液的有机硒/蛋白值偏低。

试验例1

将sd雄性大鼠随机分为2组，每组8只，饲以无硒饲料建立低硒模型，自由采食饮水，室温保持(25±1)℃。给药前12h对大鼠禁食，自由饮水。两组以硒含量为18μg/kg·bw分别灌胃对比例1的富硒大豆蛋白乳胶稀释得到的富硒大豆蛋白溶液和实施例1的富硒大豆低聚肽溶液，并于灌胃前和灌胃后5，10，20，30，40，60，80，100，120min尾部取血600μl，置于edta抗凝管中，3000r/min下离心10min，吸取上层血浆于离心管中，做好标记。取离心后血浆加等体积10％水杨酸，混匀，4℃静置30min，以8500r/min在4℃离心5min，取上清过膜后在氨基酸分析仪上进行定量分析。采用氢化物发生-原子荧光光谱法(hg-afs)检测血浆硒含量。绘制总游离氨基酸及硒平均浓度-时间曲线，见图1。

由图1的浓度-时间曲线图可看出富硒大豆低聚肽组血硒值达峰时间(10min，40min)显著快于富硒大豆蛋白组(20min，80min)，故以大豆肽为载体，可以显著提高硒的体内吸收速度。血液氨基酸达峰时间(5min，40min)显著快于富硒大豆蛋白组(10min，80min)，表明富硒大豆低聚肽的体内吸收速度高于富硒大豆蛋白。富硒大豆低聚肽组血硒峰值可达1.34mg/l，显著高于富硒大豆蛋白组(1.07mg/l)。

试验例2

雄性balb/c小鼠(体重18-22g)共60只，随机分成6组，每组10只。分别设定空白组、模型组、阳性对照组(10mg/kg·bw灌胃盐酸左旋咪唑)、实施例1的富硒大豆低聚肽组(有机硒32.5μg/kg·bw，低聚肽含296mg/kg·bw)、对比例1的富硒大豆蛋白组(有机硒32.5μg/kg·bw)、普通大豆肽组(无硒低聚肽，含肽296mg/kg·bw)。于灌胃第14-15天腹腔注射环磷酰胺造成免疫抑制。取小鼠血液于3000r/min条件下离心15min，使血清与血细胞分离，吸出上层血清，分装于-80℃储存。使用全自动血生化分析仪进行血清总蛋白(tp)、白蛋白(alb)检测，结果如图2所示。

由图2可知：富硒大豆低聚肽组总蛋白含量(54.88g/l)与模型组总蛋白含量(50.49g/l)相比具有极显著差异，摄入富硒大豆蛋白可以显著提高体内总蛋白水平，主要表现为白蛋白含量(20.08g/l)相较于模型组显著增加。富硒大豆蛋白组总蛋白含量(52.81g/l)与白蛋白含量(18.49g/l)与模型组比有所提高。由图2可以看出，富硒大豆低聚肽相较于富硒大豆蛋白对于增加血清总蛋白及白蛋白水平有更好效果，可以更好维持机体稳定与健康。

试验例3

雄性balb/c小鼠(体重18-22g)共60只，随机分成6组，每组10只。分别设定空白组、模型组、阳性对照组(10mg/kg·bw灌胃盐酸左旋咪唑)、实施例1的富硒大豆低聚肽组(有机硒32.5μg/kg·bw，低聚肽含296mg/kg·bw)、对比例1的富硒大豆蛋白组(有机硒32.5μg/kg·bw)、普通大豆肽组(无硒低聚肽，含肽296mg/kg·bw)。于灌胃第14-15天腹腔注射环磷酰胺造成免疫抑制。小鼠处死前眼眶取血250μl，使用血细胞分析仪进行小鼠血液的血常规检测(外周血常规测定：白细胞数，中性粒细胞数，淋巴细胞数，单核细胞数，红细胞数，血小板)，结果如表3所示。

由图3可知：富硒大豆低聚肽组白细胞浓度(2.213×10⁹/l)相较于模型组(1.515×10⁹/l)有所提高，淋巴细胞数(1.290×10⁹/l)相较于模型组(0.676×10⁹/l)显著增加。富硒大豆低聚肽组的白细胞浓度与淋巴细胞浓度显著高于富硒大豆蛋白组和普通肽组，说明本申请的富硒大豆低聚肽在预防免疫力低下方面具有更好的效果。

试验例4

雄性balb/c小鼠(体重18-22g)共60只，随机分成6组，每组10只。分别设定空白组、模型组、阳性对照组(10mg/kg·bw灌胃盐酸左旋咪唑)、实施例1的富硒大豆低聚肽组(有机硒32.5μg/kg·bw，低聚肽含296mg/kg·bw)、对比例1的富硒大豆蛋白组(有机硒32.5μg/kg·bw)、普通大豆肽组(无硒低聚肽，含肽296mg/kg·bw)。于灌胃第14-15天腹腔注射环磷酰胺造成免疫抑制。将小鼠脾脏在冰上用pbs(ph7.2-7.4，浓度为0.01mol/l)匀浆，4℃下5000r/min离心15min，收集上清液。使用酶联免疫吸附(elisa)测定上清液的il-2含量。il-2是免疫系统中能调控白血球的细胞活性，参与抗体反应，造血，肿瘤监视的一类细胞生长因子。

由图4可知：灌胃富硒大豆低聚肽的balb/c小鼠脾脏内il-2含量相较于模型组极显著增加。富硒大豆蛋白组的il-2含量相较于模型组没有显著增加。进一步说明本申请的富硒大豆低聚肽可以显著提高机体白介素含量，从而提高机体白细胞数，增强机体免疫。

综上，本发明提供的富硒大豆低聚肽在大鼠体内吸收速度均快于摄入等量有机硒含量的大豆富硒蛋白，并且在体内的最高血硒峰值出现在灌胃后的第10min，最大血硒峰值浓度1.34mg/l，是富硒大豆蛋白的1.25倍。在预防免疫力低下小鼠模型方面，灌胃实施例1制得的富硒大豆低聚肽，低聚肽剂量296mg/kg·bw并含有有机硒32.5μg/kg·bw，血清总蛋白含量、血清白蛋白含量、白细胞含量、淋巴细胞含量、脾脏il-2含量提高效果优于同等蛋白含量的普通大豆低聚肽，优于同等硒含量的富硒大豆蛋白。说明本发明的富硒大豆低聚肽具有易吸收，显著增强免疫力的效果。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。