假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用的制作方法

本发明属于多酚氧化酶活性研究技术领域，尤其涉及假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用。

背景技术：

多酚氧化酶(ppo)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。

多酚氧化(ppo)酶是导致切分马铃薯变色的主要原因，在马铃薯加工过程中，有效地抑制酶促褐变一直影响马铃薯开发利用的主要因素。褐变即在有氧的条件下，植物中的酚酶催化酚类物质形成醌，醌再进一步氧化聚合形成黑色素或类黑精。一直以来，解决马铃薯加工中的这一问题不是采用物理方法就是化学方法。而近年来，天然抗褐变剂的研究已受到关注和重视，已有研究发现豌豆发酵液对马铃薯褐变有抑制作用；也有研究发现发酵酸浆不仅是其中有机酸起作用，还有可能与微生物有关；另外研究中发现红茶菌液也能明显抑制马铃薯多酚氧化酶活性。但是目前天然抗褐变剂的作用机理尚不明确，并不确定天然抗褐变剂中哪一种具体的成分起作用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用，生长对数期的假囊酵母菌悬液能够显著的抑制多酚氧化酶，抑制率能够达到32％。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用。

优选的，所述多酚氧化酶为马铃薯多酚氧化酶。

优选的，所述假囊酵母为培养至生长对数期的假囊酵母。

优选的，所述生长对数期的假囊酵母为假囊酵母菌悬液。

优选的，所述假囊酵母菌悬液的菌浓度为5～30×10⁶个/ml。

优选的，所述应用为将假囊酵母菌悬液与多酚氧化酶混合。

优选的，所述多酚氧化酶包括游离的多酚氧化酶和底物结合的多酚氧化酶。

优选的，所述底物包括邻苯二酚。

本发明的有益效果：本发明提供了假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用，生长对数期的假囊酵母菌悬液能够显著的抑制多酚氧化酶，抑制率能够达到32％；假囊酵母对于多酚氧化酶的抑制属于混合抑制类型，不仅能够与游离的多酚氧化酶反应，还能够与底物结合的多酚氧化酶的络合物反应，抑制途径多，抑制率高，应用范围广。

附图说明

图1为假囊酵母菌的生长曲线；

图2假囊酵母菌悬液对多酚氧化酶的抑制结果；

图3为假囊酵母菌悬液对酶的抑制作用动力学分析图；

图4为假囊酵母菌悬液抑制常数的计算。

具体实施方式

本发明提供了假囊酵母在抑制多酚氧化酶活性中的应用。所述假囊酵母优选为培养至生长对数期的假囊酵母，更优选为培养8～20h的假囊酵母，最优选为培养16h的假囊酵母。在本发明中，所述生长对数期的假囊酵母优选为假囊酵母菌悬液；所述假囊酵母菌悬液的菌浓度优选为5～30×10⁶个/ml，优选的为20～29×10⁶个/ml。在本发明中，所述假囊酵母优选为eremotheciumcymbalariaedbvpg(xr_002431951.1)。

在本发明中，所述应用具体优选为将假囊酵母菌悬液与多酚氧化酶混合。在本发明中，所述多酚氧化酶包括游离的多酚氧化酶和底物结合的多酚氧化酶。在本发明中，所述多酚氧化酶的浓度优选为200～400μg/ml，更优选为300μg/ml。在本发明中，所述多酚氧化酶优选为马铃薯多酚氧化酶；所述底物优选的包括邻苯二酚。本发明对所述马铃薯多酚氧化酶的来源没有特殊限定，可以采用市售马铃薯多酚氧化酶获得自行从马铃薯中提取获得的多酚氧化酶均可。

在本发明中，所述从马铃薯中提取多酚氧化酶的方法包括以下步骤：1)用丙酮研磨马铃薯后抽滤获得马铃薯丙酮粉；2)将所述马铃薯丙酮粉与磷酸盐缓冲液混合搅拌、离心收集上清获得粗酶液；3)将所述粗酶液与饱和硫酸铵混合沉淀、离心，收集沉淀后，以磷酸盐缓冲液溶解得到纯化的多酚氧化酶液。在本发明中，所述丙酮为0℃预冷的丙酮；所述抽滤的次数优选为1～3次，更优选为2次。在本发明中，所述马铃薯丙酮粉与磷酸盐缓冲液混合的比例优选为1g:6～10ml，更优选为1g:8ml。在本发明中，粗酶液与饱和硫酸铵混合沉淀的次数优选为1～3次，更优选为2次；当所述混合沉淀的次数为2次是，第一次饱和硫酸铵的加入体积优选为粗酶液体积的35％～45％，更优选为40％；第二次饱和硫酸铵的加入体积优选为粗酶液体积的65％～75％，更优选为70％。在本发明中，上述过程中的离心优选的在冷冻离心机中进行，所述离心的转速优选为14000～16000rpm，更优选为15000rpm；所述离心的时间优选为15～25min，更优选为20min。

在本发明中，所述假囊酵母对于多酚氧化酶的抑制属于混合抑制类型，不仅能够与游离的多酚氧化酶反应，还能够与底物结合的多酚氧化酶的络合物反应，抑制途径多，抑制率高，应用范围广。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

试验材料

马铃薯：甘肃省定西市农科院提供。

主要试验试剂

牛血清白蛋白(生化试剂)sigma公司；

考马斯亮蓝g-250(生化试剂)sigma公司；

葡萄糖(生化试剂)sigma公司；

丙酮、邻苯二酚、硫酸铵均为分析纯，天津化学试剂三厂。

试验仪器

电热恒温水浴锅hh-s4，北京科伟永新仪器有限公司；

电子分析天平ab104-n，梅特勒-托利多仪器有限公司；

紫外可见分光光度计uv-9200，美国瓦里安公司；

循环水多用真空泵shb-ⅲ，郑州长城科工贸有限公司；

离心机l550，长沙湘仪离心机有限公司；

冷冻离心机fd-1-55，北京博衣康实验仪器有限公司。

试验方法

多酚氧化酶的提取和纯化

将在冰箱中保藏的马铃薯，清洗去皮，切块后称取20g放入研钵中，再向研钵中加入30ml预冷的丙酮溶液，充分研磨。将研磨浆液重复两次抽滤，同时加入20ml预冷丙酮继续提取，抽滤至无丙酮味，即得马铃薯丙酮粉，制得的马铃薯丙酮粉置于冰箱中冷冻保存。称取1g马铃薯丙酮粉与8ml磷酸盐缓冲溶液在冰浴中搅拌10min，然后在4℃下，15000r/min条件下用冷冻离心机离心20min，取上清液，即为粗酶液。向粗酶液中缓慢加入40％饱和硫酸铵，并在冰浴中搅拌至完全溶解，随后在4℃下，6000r/min条件下用冷冻离心机离心20min。离心后取上清液再次加入70％饱和硫酸铵，在冰浴中搅拌完全溶解后，继续在4℃下，15000rpm条件下离心20min。最后收集沉淀，用预冷的磷酸盐缓冲溶液溶解，得到纯化的多酚氧化酶液，酶液冷冻保藏备用。

蛋白质浓度的测定

采用考马斯亮蓝g-250测定蛋白浓度。

多酚氧化酶活性测定

本实验用分光光度计测定多酚氧化酶活性，测定前将混有2.3ml磷酸盐缓冲溶液、0.6ml的0.1mol/l邻苯二酚的溶液在30℃水浴锅中恒温10min。测定时向恒温溶液中加入0.1ml酶液，混匀后立即转移到比色皿中，于420nm处测定吸光度，每10s读一次数，测定1min，磷酸盐缓冲溶液作为空白对照。

按以下公式：

其中u为多酚氧化酶活力，δa反应时间内吸光度变化值，t为反应时间。以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活力单位计算样品的酶活力。

将保藏的假囊酵母菌株接种于ypd培养液中，培养一天后吸取5ml发酵液接

种于95ml的ypd培养液中培养48h，期间每4h取一次发酵液在600nm处测定吸光值，未接种的ypd培养液作为空白对照。制作出假囊酵母菌株的生长曲线，对比不同培养时期同种菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的抑制率。并用血球计数板对菌悬液计数。保藏的假囊酵母菌株在mrs培养液中培养一天后，吸取5ml发酵液接种于95ml的mrs培养液，培养24h。期间每2h取一次发酵液在600nm处测定吸光值，未接种的mrs培养液为空白对照。最后制作出lactobacillussp.菌株的生长曲线，对比不同培养时期同种菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的抑制率，并用血球计数板对菌悬液计数。

多酚氧化酶的抑制率的计算方法：

菌悬液0.1ml分别加入混有2.2ml磷酸盐缓冲液、0.6ml邻苯二酚(0.1mol/l)、0.1ml多酚氧化酶(ppo)的比色皿中，磷酸盐缓冲溶液作为空白对照，于420nm处测定吸光值，每10s读一次数，测定1min。按如下公式计算：

式中：i为抑制率；a1为未加抑制剂的酶活力；a2为加抑制剂的酶活力。

计算各个菌悬液的抑制率，筛选对ppo活性有抑制作用的菌株。

菌悬液对多酚氧化酶抑制类型的检测

配制4个梯度的假囊酵母菌悬液，分别为0、稀释4倍菌悬液(5×10⁶个/ml)、稀释2倍菌悬液(10×10⁶个/ml)和原菌悬液(20×10⁶个/ml)。再将多酚氧化酶液用pbs稀释成10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml4个梯度。以0.1mol/l的邻苯二酚作为底物，底物浓度不变，改变酶的浓度，测定不同浓度菌悬液对酶活力的影响。按照上述多酚氧化酶的抑制率的计算方法测吸光值，最后用酶活力对酶浓度作图，根据图型判断假囊酵母的菌悬液对多酚氧化酶的抑制作用是否可逆。

菌悬液对多酚氧化酶作用动力学的研究

反应初速度

固定多酚氧化酶的浓度(300μg/ml)，改变菌悬液的浓度，分别为假囊酵母菌悬液﹝5个梯度0、稀释4倍菌悬液(5×10⁶个/ml)、稀释3倍菌悬液(7×10⁶个/ml)、稀释2倍菌悬液(10×10⁶个/ml)和原菌悬液(20×10⁶个/ml)﹞；改变底物邻苯二酚的浓度(5个梯度0.02mol/l、0.04mol/l、0.06mol/l、0.08mol/l、0.10mol/l)。测定不同处理的酶活力，所得趋势线的斜率为初速度值。

动力学分析及抑制常数的测定

根据lineweaver-burk双倒数作图法，分别将底物邻苯二酚浓度和初速度值取倒数后制成图和表，分析两种菌悬液抑制马铃薯中多酚氧化酶的动力学参数并求出抑制常数。

结果与分析

蛋白质含量测定结果

按上述蛋白质含量测定方法，经考马斯亮蓝法测定吸光值，计算得到多酚氧化酶浓度为300μg/ml。

菌株培养时间对多酚氧化酶抑制率的影响

绘制假囊酵母菌株的生长曲线，由图1可知，0～8h是假囊酵母菌株生长的迟缓期，8～20h是菌株生长的对数期，20～48h是菌株生长的稳定期。根据假囊酵母菌株生长曲线的不同时期，分别选取培养时间为8h，16h，24h的假囊酵母菌株培养液，制作成三个不同时期的菌悬液。将培养8h，16h，24h后制作的菌悬液上述提及的方法计算对马铃薯中多酚氧化酶活性的抑制率，抑制率分别为17％、32％、27％。用处于对数生长期假囊酵母菌株制作的菌悬液对马铃薯中多酚氧化酶活性抑制率较高，这可能是由于对数期菌体生长速率快，活细胞生长率远大于死亡率。

菌悬液对多酚氧化酶的影响

以多酚氧化酶的浓度作为横坐标，酶活力作为纵坐标，得到4组数据，分别做趋势线，得到图2。

由图2可知，趋势线穿过坐标原点，而且菌悬液浓度越大，趋势线的斜率越小，这说明假囊酵母菌株的菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的抑制作用属于可逆过程。因此，假囊酵母菌株菌悬液均能有效地抑制马铃薯多酚氧化酶活性，即通过影响酶的活力，降低催化效率。

菌悬液对多酚氧化酶的抑制动力学分析

菌悬液对多酚氧化酶抑制初速度的测定结果

多酚氧化酶浓度不变，改变菌悬液和底物邻苯二酚的浓度，测得在不同浓度底物对应不同浓度抑制剂条件下多酚氧化酶反应的初速度。结果见表1。

表1假囊酵母菌悬液对酶的反应初速度

菌悬液对多酚氧化酶抑制动力学分析及抑制常数的测定结果

根据上述初速度的结果，分别取初速度和底物邻苯二酚浓度的倒数，然后根据lineweaver-burk双倒数法作图。得表2和图3。

表2假囊酵母菌悬液对酶的抑制作用动力学分析

由图3可知，假囊酵母菌株菌悬液对马铃薯多酚氧化酶抑制作用的lineweaver-burk双倒数图像均是相交于坐标轴y左端，坐标轴x上方的直线。随着菌悬液浓度的变化，相交直线的斜率和截距都相应的发生变化，由此说明假囊酵母的菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的抑制类型属于混合抑制类型，菌悬液不仅能与游离酶相结合，而且能与酶和底物的络合物相结合。混合抑制类型的lineweaver-burk公式如下：

其中，

式中v表示反应速率，km是米氏常数，vmax为最大反应速率，i代表抑制剂浓度，s是底物浓度，ki表示抑制剂结合游离酶的常数，kis是抑制剂结合酶-底物络合物的常数。ki和kis是由抑制剂浓度分别对斜率和截距作图所得。斜率和截距的计算公式为：

根据图3，得到两种菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的抑制动力学参数，见表3。

表3假囊酵母对马铃薯多酚氧化酶抑制动力学参数

由表3可知，在菌悬液对马铃薯多酚氧化酶抑制动力学参数中，米氏常数km随着菌悬液浓度增大而增大，最大反应速率vmax随着菌悬液浓度的增大而减小，这一现象再次说明了假囊酵母的菌悬液对多酚氧化酶的抑制类型属于混合抑制类型。

根据表3，再次进行作图。以菌悬液的浓度为纵坐标，以斜率和截距为横坐标作图，并添加趋势线。根据图4，得到假囊酵母的菌悬液对马铃薯多酚氧化酶的游离酶抑制常数ki＝0.0011mol/l，对酶与底物结合物的抑制常数kis＝0.0249mol/l；ki均小于kis，这表示菌悬液对游离酶的亲和力要强于对酶与底物结合物的亲和力，即菌悬液对酶与底物结合物的抑制作用要弱于对游离酶的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。