一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/Nisin复合保鲜剂以及制备方法与流程

一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂以及制备方法
技术领域
1.本发明涉及海洋食品的抗菌保鲜领域，涉及到的一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂以及制备方法。


背景技术：

2.海洋产品因富含蛋白质、不饱和脂肪酸等营养物质，导致其贮存加工过程中极易发生腐败变质。而微生物的生长繁殖是引发海洋食品腐败变质的最主要因素。传统上的保鲜方法是利用低温来抑制微生物的生命活动，从而达到保鲜的效果。尽管低温保藏能在一定程度上延长货架期，但为了满足海洋产品的远销以及消费者对新鲜度的高需求，更有效的保鲜技术正不断涌现。近年来，将冷藏与涂膜相结合的新保鲜技术，不仅在很大程度上抑制了在低温下仍然生命力顽强的微生物的生长，还能大大延长货架期，保证海洋产品的品质。
3.随着耐药菌株的出现，细菌感染问题日益严重，影响了人类正常的生产生活。乳酸链球菌素(nisin)作为一类天然多肽类抗菌剂，凭借其广泛的抗菌机制，能有效的避免耐药菌株的出现，因此被广泛用于各类海洋食品的抗菌保鲜。但nisin作为天然活性成分，功能特性敏感，极易与食品中的有效成分发生相互作用，从而导致抗菌功效的丧失，因此严重制约了nisin在更深层次的应用。
4.中国专利cn201510275303.9公开了“一种壳聚糖/nisin核壳微球及其制备方法与应用”，介绍了在酸性条件下，通过利用壳聚糖包埋nisin，从而制备核壳微球结构的包容物。壳聚糖/nisin核壳微球虽然能够降低空间阻力，提高nisin的稳定性以及抗菌活性，但是整个微球尺寸较大(约为 1000nm)，微球的稳定性也仅仅依靠布朗运动形成的胶束来维持，所以对于 nisin的稳定性提升有限，对海洋产品的抗菌保鲜效果并不理想。
5.而在中国专利cn201610130824.x公开了“一种海鲜保鲜剂及其制备和应用”，介绍了仅以卡拉胶寡糖和水为主的保鲜剂。该保鲜剂对海鲜产品的保鲜时间短暂，抗菌效果也十分微弱。
6.中国专利cn201810868852.0公开了“一种茶多酚
‑
溶菌酶海鲜制品复合保鲜剂”(申请日：2018.08.02)，介绍了以茶多酚10％、溶菌酶30％、乳酸链球菌素10％、植酸5％、山梨酸钾5％、蒸馏水40％的比例制备的复合保鲜剂。该保鲜剂将各种活性成分混合，并加入了山梨甲酸，则安全性有待验证，不符合绿色安全的理念。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对nisin当前应用的局限性，旨在提供一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂及其制备方法，来提高nisin稳定性以及增强抗菌活性，并赋予了复合保鲜剂更广谱的抗菌效果，具有绿色、安全无毒、低成本的优点，从而满足其在海洋食品的抗菌保鲜方面的应用。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin 复合保鲜剂的制备方法，包括以下步骤：
10.s1甲壳素纳米纤维的制备：
11.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h，得到的甲壳素溶液经抽滤、洗涤，得到的残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维；
12.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
13.将s1所述的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理 1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液，将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，得到nisin与甲壳素纳米纤维混合溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡，调节混合溶液最终的ph。
14.进一步地，上述的甲壳素纳米纤维的制备方法s1中，在抽滤过程中使用去离子水洗涤滤渣5～7次，直至冲洗的滤液无色即可。
15.进一步地，上述的甲壳素纳米纤维的制备方法s1中，将上清液置于洁净的玻璃皿中用保鲜膜包裹并在
‑
80℃的冰柜中冷冻12h，再在真空度为10～ 15，冷冻温度
‑
80℃～
‑
85℃的条件下冷冻干燥时间24h～72h。
16.进一步地，上述的转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备方法s2中，其特征在于，整个溶解制备的温度条件为40℃。
17.进一步地，上述的转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备方法s2中，水浴恒温震荡的振荡速度为200rpm/min，震荡时间50～60min。
18.进一步地，上述的转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备方法s2中，使用ph7.2的磷酸盐缓冲溶液调节混合溶液的ph。
19.进一步地，上述的制备方法s1,s2中的超声的功率均为25khz。
20.本发明提供了一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin 复合保鲜剂及其制备方法，包括以下步骤：s1甲壳素纳米纤维的制备；s2将 nisin与转谷氨酰胺酶加入到醋酸溶解的甲壳素纳米纤维溶液中，经过搅拌、水浴震荡、调节ph值，最终得的基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂。实施例结果显示，本发明所提供的基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂，其有益效果在于：
21.(1)本发明所选取的主要材料nisin、甲壳素纳米纤维、转谷氨酰胺酶均是天然生物提取物，具有安全性以及生物降解性的优点，对人体没有毒害作用，可用于海洋食品的贮藏保鲜。
22.(2)本发明提供一种甲壳素纳米纤维的制备方法，对甲壳素进行提纯及其一定的物理化学方法处理后，获得了纳米级别的纤维状甲壳素，其结构稳定，分散能力好，具备优良的成膜性能以及一定的抗菌特性。
23.(3)本发明主要依据化学交联和纳米吸附的原理，利用转谷氨酰胺酶诱导甲壳素纳米纤维与nisin化学交联形成共价键，以及甲壳素纳米纤维的高表面体积比吸附nisin，
从而提高nisin的稳定性与抗菌活性。
24.(4)本发明中涉及的甲壳素纳米纤维具有良好的成膜性，能够在被包裹物表面形成一层“保护层”，能够在一定程度上隔离微生物的污染。
25.(5)本发明制备的转谷氨酰胺酶诱导交联的nisin
‑
甲壳素纳米纤维抗菌保鲜剂中，甲壳素纳米纤维能对nisin进行纳米吸附，从而组合成复合体。两者复合能够使得甲壳素纳米纤维与nisin达到协同抗菌的效果，极大程度地增强了抗菌特性。
26.(6)此外，本发明制备过程简单，原料来源丰富且安全，成本低廉，适合现代化工业生产，能够与现有的物理保鲜技术联合使用，广泛地运用到食品行业，前景广阔。
附图说明
27.图1为转谷氨酰胺酶诱导甲壳素纳米纤维/nisin交联机理图；
具体实施方式
28.本发明提供了一种基于转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin 复合保鲜剂及其制备方法，包括以下步骤：
29.s1甲壳素纳米纤维的制备：
30.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h，得到的甲壳素溶液经抽滤、洗涤，得到的残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥，得到甲壳素纳米纤维；
31.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
32.将s1所述的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理 1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液，将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，得到nisin与甲壳素纳米纤维混合溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡1h，调节混合溶液最终的ph。
33.在本发明中，s1中所述抽滤过程中使用去离子水洗涤滤渣5～7次，直至冲洗的滤液无色即可。
34.在本发明中，s1中所述的冷冻干燥过程为先将上清液置于洁净的玻璃皿中用保鲜膜包裹并在
‑
80℃的冰柜中冷冻12h，再在真空度10～15，温度
ꢀ‑
80℃～
‑
85℃,冷冻干燥时间24h～72h。
35.s2中所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比为1：0.5～2。
36.在本发明中，s2中所述的混合溶液中nisin浓度为3.0～5.0mg/ml，优选3.0mg/ml。
37.在本发明中，s2中使用ph7.2的磷酸盐缓冲溶液调节混合溶液的ph为 4～8，优选ph为6。
38.在本发明中，s2中所述溶解制备的温度条件为40℃。
39.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属
于本发明保护的范围。
40.实施例1
41.s1甲壳素纳米纤维的制备：
42.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
43.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
44.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1：0.5，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡55min，最后使用ph7.2的磷酸盐缓冲溶液调节混合溶液的ph 为6。
45.实施例2
46.s1甲壳素纳米纤维的制备：
47.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
48.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
49.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:0.8，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡60min，最后调节溶液的ph为6。
50.实施例3
51.s1甲壳素纳米纤维的制备：
52.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
53.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
54.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:1.5，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡55min，最后调节溶液的ph为6。
55.实施例4
56.s1甲壳素纳米纤维的制备：
57.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
58.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
59.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:2.0，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡60min，最后调节溶液的ph为6。
60.实施例5
61.s1甲壳素纳米纤维的制备：
62.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
63.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
64.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:0.8，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡55min，最后调节溶液的ph为4。
65.实施例6
66.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
67.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
68.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:0.8，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡55min，最后调节溶液的ph为6。
69.实施例7
70.将甲壳素粉末分散在含有33％(w/v)的氢氧化钠和0.3％的硼氢化钠 (w/v)，在90℃的水浴中，磁力搅拌4h。溶液经抽吸、过滤、去离子水洗涤，直至滤液清澈无色。收集残渣在45℃烘箱中干燥1h，用1％(v/v)醋酸溶液溶解，超声处理1h，静置30min，取出上清液冷冻干燥24h，得到甲壳素纳米纤维。
71.s2转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维/nisin复合保鲜剂的制备：
72.将制备的甲壳素纳米纤维置于1％的冰醋酸溶液(v/v)，利用超声处理1h，制备浓度为2.4mg/ml的甲壳素纳米纤维溶液。再将加nisin与0.4％的转谷氨酰胺酶(m/m，基于nisin的干物质量)加入到上述溶液中，以500rpm/min 条件下搅拌30min，所述的nisin与甲壳素纳米纤维的质量比达到1:0.8，在最终获得nisin浓度为3.0mg/ml的溶液，再将混合溶液至于40℃的水浴摇床中振荡55min，最后调节溶液的ph为8。
73.通过以下方法对实施例所制备的保鲜剂进行测试：
74.(1)以bca工作试剂法测定复合保鲜剂nisin吸附率
75.将上述以不同条件配制的转谷氨酰胺酶诱导交联的甲壳素纳米纤维 /nisin复合保鲜剂准确称取5ml，再对其进行高速离心，转速为12000rpm，时间10min。然后吸取适当体积的上清液加入到试管中，并用pbs补足到 100μl；向试管中加入2ml bca工作液，混匀，37℃放置30分钟；测定 562nm处的吸光值，并记录读数；以不含bsa的样品的光吸收值作为空白对照。以a562为纵坐标，bsa含量为横坐标，绘制标准曲线，计算样品中的nisin浓度。
76.nisin吸附率计算公式如下：
[0077][0078]
其中c总为制备复合液是加入的nisin的浓度，v总为制备的复合液的体积， c上为离心后上清液中的nisin的浓度。
[0079]
(2)抗菌率
[0080]
取一定量的保鲜剂置于50ml的锥形瓶中，在121℃下灭菌5min，加入10ml放104cfu/ml的大肠杆菌或金色葡萄球菌的营养汤液，在37℃下震荡5min。取0.1ml在试管中稀释2000倍，取1.0ml铺于琼脂培养基平板上，在37℃的恒温培养箱中培养24小时，进行活菌计数。
[0081]
(3)细胞毒性
[0082]
小鼠巨噬细胞j774培养在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，经消化后，以5
×
104/孔铺板至96孔细胞培养板中，在3℃、5％的co2条件下过夜培养。第二天加入保鲜剂，继续培养。5h后，离心，取上清液，按照1:1 比例加入ldh试剂，避光孵育20min，490nm处检测吸光度值，dmem处理组为阴性对照，0.2％的triton处理组为阳性对照，dmso处理组为溶剂对照。
[0083][0084]
式中：od
‑
药物处理组490nm的吸光度值；
[0085]
t
‑
阳性对照。
[0086]
(3)生物降解性
[0087]
将本发明的gnps负载nisin海产品保鲜剂和市面上销售的海产品保鲜剂在水中，观察其降解所需时间。
[0088]
(4)保鲜效果实验
[0089]
选取新鲜的大黄鱼，采用上述制备完成的抗菌保鲜剂进行储藏期的保鲜实验。
[0090]
部分实验结果如下：
[0091]
表1以bca法测定各实施实例的nisin吸附率
[0092][0093]
表2本发明最优条件配制的复合保鲜剂与其他海产品保鲜剂相关性能测试结果对比
[0094][0095]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。