1.本发明涉及食品技术领域，具体为一种防脱毛狗粮及其制备方法。
背景技术：
2.免疫球蛋白(是代表机体体液免疫功能的一项重要指标，在体内承担免疫调节作用，开发的产品己被用于治疗免疫相关疾病。具有由2条重链和2条轻链构成的“y”型结构，顶端的可变区是主要活性区域。真菌免疫调节蛋白(fip)是从真菌中分离的一类结构与重链可变区结构极其相似而且具有免疫调节功能的小分子蛋白质。目前已发现7种，其中来源于金针薛的免疫调节蛋白经研究具有免疫调节作用，具有激活淋巴细胞产生细胞因子、预防治疗哮喘、鼻炎、湿疹等过敏症和抑制癌细胞生长等生物活性。但目前从金针燕子实体中提取天然产率极低(最高产率尚不足88mg/kg)证明其在金针菇体中表达水平较低，因此通过品种改良或基因重组技术生产该蛋白具有重要意义。
3.狗狗脱毛一般有两点原因，患皮肤病或者自身免疫力低下。提升狗狗自身免疫力可以避免狗狗非自然脱毛。另外，能给狗狗真正啃食的狗粮有限，成本也高。
4.因此，设计成本低和含免疫球蛋白的一种防脱毛狗粮及其制备方法是很有必要的。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种防脱毛狗粮及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种防脱毛狗粮，包括玉米芯、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫、猪肉糜、起酥油、白砂糖和水的植物乳杆菌与富硒酵母菌共同复合发酵的骨头型饼干。
7.根据上述技术方案，所述玉米芯是经过粗毛纤孔菌发酵降解7
‑
10天的玉米芯。
8.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫是含有金针菇真菌免疫调节蛋白的基因工程成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫。
9.一种防脱毛狗粮的制备方法，包括以下具体步骤：
10.步骤一：取低筋面粉，加适量水，富硒酵母搅拌制得面团，静置于28
‑
32℃、湿度60％的醒发箱内发酵3
‑
4h，获得一次发酵面团；富硒酵母可以为狗狗提高良好的蛋白硒，提升抗自由基能力；
11.步骤二：取猪肉糜，添加成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，利用植物乳杆菌30℃厌氧搅拌发酵2
‑
4h，获得乳酸发酵猪肉糜；粗毛纤孔菌粉富含真菌多糖，将促进植物乳杆菌生长，节省发酵时间，同时提升猪肉口感和品质，也利于狗狗消化；
12.步骤三：将步骤二获得的乳酸发酵猪肉糜、起酥油、白砂糖、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫加入到步骤一获得的一次发酵面团中，搅拌均匀，静置于温度35℃、湿度70％的醒发箱内发酵3
‑
6h，获得饼干成型面团；植物乳杆菌可显著提高面团中还原糖的含量，抑制丙烯
酰胺的产生；
13.步骤四：发酵完成的面团用压片机压至2mm厚，并包裹在玉米芯外部，制成骨头形状，在上火180℃、下火160℃下烘烤15min，冷却后得到狗粮饼干的成品。
14.根据上述技术方案，所述步骤三中材料质量配比：乳酸发酵猪肉糜3
‑
5份、起酥油0.5
‑
1.5份、白砂糖0.1
‑
0.5份、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫0.2
‑
0.8份、一次发酵面团10
‑
25份。
15.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫的制备：通过rt
‑
pcr方法从金针菇体内获得真菌免疫调节蛋白(fip)cdna序列，我们在fip的c端添加his标签，方便蛋白的纯化；利用限制性内切酶ecor i、bamhi酶双酶切，t4dna连接酶连接，构建了植物双元表达载体p139035s
‑
fip,并将重组质粒转入到根癌农杆菌eha05中。
16.根据上述技术方案，所述根癌农杆菌eha05通过凝胶电泳检测，发现条带与目标基因大小一致，说明重组质粒已经转移到根癌农杆菌eha05体内；以粗毛纤孔菌菌丝球为受体材料，根癌农杆菌eha05的菌液浓度od600为0.5，侵染时间20
‑
40min，在乙酞丁香酮为200μmol/l的共培养基上共培养72h。
17.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌通过pcr与southern杂交结果表明免疫球蛋白基因已整合到粗毛纤孔菌的基因组中，在无选择压力的pda固体培养基上继代培养五次后仍检测到基因的存在,表明基因在转基因粗毛纤孔菌中可稳定遗传，获得高真菌免疫调节蛋白表达的粗毛纤孔菌菌丝体。
18.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌扩大培养：培养基质量比木屑3
‑
5份，稻壳2
‑
3份，玉米粉10
‑
15份，木糖0.5
‑
1份，酵母浸粉0.8
‑
2份，石灰0.5
‑
0.8份，石膏0.5
‑
1.2份，与40
‑
70份水混合搅拌均匀，包裹在玉米芯外部，培养9
‑
12天，转移到60份木屑上继续培养15
‑
20天，培育出子实体。
19.根据上述技术方案，所述玉米芯发酵后切割制成长10
‑
15cm，巴氏消毒备用；成熟基因工程粗毛纤孔菌子实体清洗后，低温干燥并研磨成粉沫备用。
20.粗毛纤孔菌在玉米芯粉上培养，1天后检测到木质素过氧化物酶和赖锰过氧化物酶活性，木质素过氧化物酶在第5天达到最高值，赖锰过氧化物酶在第6天活达到最大值。漆酶酶活相对较低,第7天达到最大值。由此可知,前7天，木质素过氧化物酶和赖锰过氧化物酶表现出较高的活性,是粗毛纤孔菌产生的与木质素生物降解重要的胞外酶。随着粗毛纤孔菌的生长，木聚糖酶活力逐渐增加,在第10天达到最大值。而纤维素酶在培养初期酶活力极低，培养至第16天时酶活力达到最大值。所以选取粗毛纤孔菌生长了9
‑
12天的玉米芯。
21.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明，
22.(1)通过rt
‑
pcr方法从金针菇体内获得真菌免疫调节蛋白(fip)cdna序列，利用限制性内切酶ecor i、bamhi酶双酶切，t4dna连接酶连接，构建了植物双元表达载体p139035s
‑
fip,并将重组质粒转入到根癌农杆菌eha05中。以粗毛纤孔菌菌丝球为受体材料，通过根癌农杆菌介导法转入真菌免疫调节蛋白基因，获得高真菌免疫调节蛋白表达的粗毛纤孔菌菌丝体，培养测试，发现菌盖中表达量最高。金针菇免疫调节蛋白作为真菌免疫调节蛋白的一种，具有促进淋巴细胞的活性和诱导白介素
‑
2和γ
‑
干扰素产生的作用，可提升狗狗自身免疫力，避免因自身免疫力不足而引起脱毛；
23.(2)将含有真菌免疫调节蛋白基因的粗毛纤孔菌菌丝体接种到玉米芯上培养，粗
毛纤孔菌生长过程中会分泌木质素过氧化物酶、赖锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶及木聚糖酶，会降解玉米芯中的木质素，同时也会降解部分纤维素和半纤维素。根据不同酶优势作用时间差，选取木质素过氧化物酶、漆酶、木聚糖酶活性高而纤维素酶低时停止玉米芯发酵，以保持玉米芯纤维素含量，硬度利于狗狗啃食，木质素、半纤维素含量极低的玉米芯狗狗可食用，纤维素可促进狗狗消化；玉米芯富含纤维素、淀粉及多种氨基酸，可提升粗毛纤孔菌蛋白质含量；
24.(3)将成熟粗毛纤孔菌子实体洗净冻干，研磨成粉。利用植物乳杆菌发酵猪肉，添加粗毛纤孔菌粉，粗毛纤孔菌粉含有的真菌多糖将促进植物乳杆菌生长，节省发酵时间，同时提升猪肉口感和品质，利于狗狗消化。利用富硒酵母发酵面团，在二次发酵时添加粗毛纤孔菌粉、植物乳杆菌发酵猪肉的猪肉，与富硒酵母共同发酵。植物乳杆菌可显著提高面团中还原糖的含量，抑制丙烯酰胺的产生。将发酵后的玉米芯灭菌，将复合发酵面团包裹在玉米芯外部，制成骨头形状，高温烘烤，制得狗狗可啃食、高免疫力狗粮。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明提供技术方案：一种防脱毛狗粮，包括玉米芯、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫、猪肉糜、起酥油、白砂糖和水的植物乳杆菌与富硒酵母菌共同复合发酵的骨头型饼干。
27.根据上述技术方案，所述玉米芯，是经过粗毛纤孔菌发酵降解7
‑
10天的玉米芯。
28.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，是含有金针菇真菌免疫调节蛋白的基因工程成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫。
29.一种防脱毛狗粮的制备方法，包括以下具体步骤：
30.步骤一：取低筋面粉，加适量水，富硒酵母搅拌制得面团，静置于28
‑
32℃、湿度60％的醒发箱内发酵3
‑
4h，获得一次发酵面团；
31.步骤二：取猪肉糜，添加成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，利用植物乳杆菌30℃厌氧搅拌发酵2
‑
4h，获得乳酸发酵猪肉糜；
32.步骤三：将步骤二获得的乳酸发酵猪肉糜、起酥油、白砂糖、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫加入到步骤一获得的一次发酵面团中，搅拌均匀，静置于温度35℃、湿度70％的醒发箱内发酵3
‑
6h，获得饼干成型面团；
33.步骤四：发酵完成的面团用压片机压至2mm厚，并包裹在玉米芯外部，制成骨头形状，在上火180℃、下火160℃下烘烤15min，冷却后得到狗粮饼干的成品。
34.根据上述技术方案，所述步骤三中材料质量配比，乳酸发酵猪肉糜3
‑
5份、起酥油0.5
‑
1.5份、白砂糖0.1
‑
0.5份、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫0.2
‑
0.8份、一次发酵面团10
‑
25份。
35.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫的制备，通过rt
‑
pcr方法从金针菇体内获得真菌免疫调节蛋白(fip)cdna序列，我们在fip的c端添加his标签，方便蛋白的纯化；利用限制性内切酶ecor i、bamhi酶双酶切，t4dna连接酶连接，构建了植物双元
表达载体p139035s
‑
fip,并将重组质粒转入到根癌农杆菌eha05中。
36.根据上述技术方案，所述根癌农杆菌eha05，通过凝胶电泳检测，发现条带与目标基因大小一致，说明重组质粒已经转移到根癌农杆菌eha05体内；以粗毛纤孔菌菌丝球为受体材料，根癌农杆菌eha05的菌液浓度od600为0.5，侵染时间20
‑
40min，在乙酞丁香酮为200μmol/l的共培养基上共培养72h。
37.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌，pcr与southern杂交结果表明免疫球蛋白基因已整合到粗毛纤孔菌的基因组中，在无选择压力的pda固体培养基上继代培养五次后仍检测到基因的存在,表明基因在转基因粗毛纤孔菌中可稳定遗传，获得高真菌免疫调节蛋白表达的粗毛纤孔菌菌丝体。
38.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌扩大培养，培养基质量比木屑3
‑
5份，稻壳2
‑
3份，玉米粉10
‑
15份，木糖0.5
‑
1份，酵母浸粉0.8
‑
2份，石灰0.5
‑
0.8份，石膏0.5
‑
1.2份，与40
‑
70份水混合搅拌均匀，包裹在玉米芯外部，培养9
‑
12天，转移到60份木屑上继续培养15
‑
20天，培育出子实体。
39.根据上述技术方案，所述玉米芯，发酵后制成长10
‑
15cm，巴氏消毒备用；成熟基因工程粗毛纤孔菌子实体清洗后，低温干燥并研磨成粉沫备用。
40.实施例1
41.一种防脱毛狗粮，包括玉米芯、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫、猪肉糜、起酥油、白砂糖和水的植物乳杆菌与富硒酵母菌共同复合发酵的骨头型饼干。
42.根据上述技术方案，所述玉米芯，是经过粗毛纤孔菌发酵降解8天的玉米芯。
43.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，是含有金针菇真菌免疫调节蛋白的基因工程成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫。
44.一种防脱毛狗粮的制备方法，包括以下具体步骤：
45.步骤一：取低筋面粉，加适量水，富硒酵母搅拌制得面团，静置于32℃、湿度60％的醒发箱内发酵3h，获得一次发酵面团；
46.步骤二：取猪肉糜，添加成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，利用植物乳杆菌30℃厌氧搅拌发酵3h，获得乳酸发酵猪肉糜；
47.步骤三：将步骤二获得的乳酸发酵猪肉糜、起酥油、白砂糖、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫加入到步骤一获得的一次发酵面团中，搅拌均匀，静置于温度35℃、湿度70％的醒发箱内发酵4h，获得饼干成型面团；
48.步骤四：发酵完成的面团用压片机压至2mm厚，并包裹在玉米芯外部，制成骨头形状，在上火180℃、下火160℃下烘烤15min，冷却后得到狗粮饼干的成品。
49.根据上述技术方案，所述步骤三中材料质量配比，乳酸发酵猪肉糜5份、起酥油1.2份、白砂糖0.2份、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫0.5份、一次发酵面团25份。
50.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫的制备，通过rt
‑
pcr方法从金针菇体内获得真菌免疫调节蛋白(fip)cdna序列，我们在fip的c端添加his标签，方便蛋白的纯化；利用限制性内切酶ecor i、bamhi酶双酶切，t4dna连接酶连接，构建了植物双元表达载体p139035s
‑
fip,并将重组质粒转入到根癌农杆菌eha05中。
51.根据上述技术方案，所述根癌农杆菌eha05，通过凝胶电泳检测，发现条带与目标基因大小一致，说明重组质粒已经转移到根癌农杆菌eha05体内；以粗毛纤孔菌菌丝球为受
体材料，根癌农杆菌eha05的菌液浓度od600为0.5，侵染时间40min，在乙酞丁香酮为200μmol/l的共培养基上共培养72h。
52.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌，pcr与southern杂交结果表明免疫球蛋白基因已整合到粗毛纤孔菌的基因组中，在无选择压力的pda固体培养基上继代培养五次后仍检测到基因的存在,表明基因在转基因粗毛纤孔菌中可稳定遗传，获得高真菌免疫调节蛋白表达的粗毛纤孔菌菌丝体。
53.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌扩大培养，培养基质量比木屑5份，稻壳3份，玉米粉15份，木糖1份，酵母浸粉1.2份，石灰0.6份，石膏0.8份，与60份水混合搅拌均匀，包裹在玉米芯外部，培养10天，转移到60份木屑上继续培养18天，培育出子实体。
54.根据上述技术方案，所述玉米芯，发酵后制成长15cm，巴氏消毒备用；成熟基因工程粗毛纤孔菌子实体清洗后，低温干燥并研磨成粉沫备用。
55.实施例2
56.一种防脱毛狗粮，包括玉米芯、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫、猪肉糜、起酥油、白砂糖和水的植物乳杆菌与富硒酵母菌共同复合发酵的骨头型饼干。
57.根据上述技术方案，所述玉米芯，是经过粗毛纤孔菌发酵降解9天的玉米芯。
58.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，是含有金针菇真菌免疫调节蛋白的基因工程成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫。
59.一种防脱毛狗粮的制备方法，包括以下具体步骤：
60.步骤一：取低筋面粉，加适量水，富硒酵母搅拌制得面团，静置于30℃、湿度60％的醒发箱内发酵4h，获得一次发酵面团；
61.步骤二：取猪肉糜，添加成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫，利用植物乳杆菌30℃厌氧搅拌发酵3h，获得乳酸发酵猪肉糜；
62.步骤三：将步骤二获得的乳酸发酵猪肉糜、起酥油、白砂糖、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫加入到步骤一获得的一次发酵面团中，搅拌均匀，静置于温度35℃、湿度70％的醒发箱内发酵5h，获得饼干成型面团；
63.步骤四：发酵完成的面团用压片机压至2mm厚，并包裹在玉米芯外部，制成骨头形状，在上火180℃、下火160℃下烘烤15min，冷却后得到狗粮饼干的成品。
64.根据上述技术方案，所述步骤三中材料质量配比，乳酸发酵猪肉糜3份、起酥油0.55份、白砂糖0.1份、成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫0.5份、一次发酵面团20份。
65.根据上述技术方案，所述成熟粗毛纤孔菌子实体粉沫的制备，通过rt
‑
pcr方法从金针菇体内获得真菌免疫调节蛋白(fip)cdna序列，我们在fip的c端添加his标签，方便蛋白的纯化；利用限制性内切酶ecor i、bamhi酶双酶切，t4dna连接酶连接，构建了植物双元表达载体p139035s
‑
fip,并将重组质粒转入到根癌农杆菌eha05中。
66.根据上述技术方案，所述根癌农杆菌eha05，通过凝胶电泳检测，发现条带与目标基因大小一致，说明重组质粒已经转移到根癌农杆菌eha05体内；以粗毛纤孔菌菌丝球为受体材料，根癌农杆菌eha05的菌液浓度od600为0.5，侵染时间30min，在乙酞丁香酮为200μmol/l的共培养基上共培养72h。
67.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌，pcr与southern杂交结果表明免疫球蛋白基因已整合到粗毛纤孔菌的基因组中，在无选择压力的pda固体培养基上继代培养
五次后仍检测到基因的存在,表明基因在转基因粗毛纤孔菌中可稳定遗传，获得高真菌免疫调节蛋白表达的粗毛纤孔菌菌丝体。
68.根据上述技术方案，所述基因工程粗毛纤孔菌扩大培养，培养基质量比木屑3份，稻壳2份，玉米粉10份，木糖0.5份，酵母浸粉0.8份，石灰0.5份，石膏0.5份，与40份水混合搅拌均匀，包裹在玉米芯外部，培养11天，转移到60份木屑上继续培养16天，培育出子实体。
69.根据上述技术方案，所述玉米芯，发酵后制成长12cm，巴氏消毒备用；成熟基因工程粗毛纤孔菌子实体清洗后，低温干燥并研磨成粉沫备用。
70.为验证本产品的实际效果，特设计以下试验：
71.试验1免疫球蛋白含量测试
72.取1g粗毛纤孔菌粉进行超声波破碎，90％乙醇纯粗提取，离心收集上清液。
73.使用ni柱纯化：首先用binding buffer平衡柱子，将收集液缓缓流过ni柱，再次用binding buffer平衡柱子，最后用elution buffer洗脱免疫球蛋白收集，收集后的免疫球蛋白利用超滤管进行脱盐处理得到纯化后的目的蛋白。计算可知，粗毛纤孔菌免疫球蛋白含量为206mg/kg，明显高于金针菇中免疫球蛋白88mg/kg的含量。
74.试验2复合发酵狗粮对消化性影响评价
75.采用全粪法对狗粮的表观消化率进行测定,并对其进行duncan分析,所得结果见表1。
76.组别n消化率(100％)复合发酵狗粮1086.16
±
0.53对照普通发酵狗粮1078.35
±
0.62
77.表1不同组别狗粮表观消化率的duncan比较
78.由检测结果可知,复合发酵狗粮的表观消化率为86.16
±
0.53,显著高于对照组，表明其消化利用率较高，相比较普通发酵狗粮，消化性得到了提高。
79.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
80.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。