一种抗氧化修复灵芝提取物及其制备方法与流程

1.本发明属于食品及化妆品原料制备技术领域，具体涉及一种抗氧化修复灵芝提取物及其制备方法。


背景技术：

2.灵芝是一种世界著名的药食两用真菌，在我国已有2000多年的药用食补历史。灵芝因其功效，在中国有“瑞草”、“林芝草”、“万年荣”或“仙草”等传统称谓。它具有调节人体免疫功能、延年益寿、抗肿瘤和神经保护功能。目前《中国药典2015版》将灵芝列为法定生药，在临床上具有预防癌症、神经退行性疾病、心血管疾病的作用。
3.鉴于灵芝良好的药理药效，以灵芝子实体或孢子为原料提取的天然活性产物，已广泛用于食品、保健食品及化妆品的研究和开发。目前，灵芝提取物的制备方法已多有报道，但制备过程普遍使用有机溶剂提取，后期除杂困难；或采用水提及简单筛网过滤方式，去除菇渣，获得的提取物复溶后易产生沉淀，极不稳定，并不适合直接用于灵芝饮品或者对澄清度要求高的化妆品制备，限制其规模化应用。例如，(1)专利cn 1634537 a公开了一种灵芝提取物及其制备方法和用途，报道以灵芝破壁孢子粉为原料，采用石油醚脱脂，乙醇回流提取，随后用氯仿以及醋酸乙酯再提取，最后经减压回收、干燥，获得粉末状的灵芝提取物。该制备方法虽可获取溶解性极好的灵芝提取物，但步骤繁琐，大量引入有害溶剂，成本高昂，难以规模化生产。(2)专利cn 104825500a公开了一种白肉灵芝提取物、提取方法及其用途，使用水、甲醇、95％(v/v)乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮中一种或多种溶剂提取，再用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种萃取，制备灵芝提取物。该方法可制备溶解性好的提取物，但使用有机溶剂萃取，导致后期除杂困难。(3)专利cn 106924110 a公开了一种灵芝提取物的制备及其应用方法，利用水、乙醇或者丁二醇作为提取溶剂，再经粗过滤获得灵芝提取物。该方法较为简便，但提取物只经简单过滤，导致制取的提取物存在大量不可溶性物质。(4)专利cn 112048024 a公开了一种灵芝提取物及其制备方法和应用，将灵芝孢子粉经提取、离心分离、微滤后，回收了微滤后的截留液，导致后续制备的灵芝提取物含有较多不溶物。(5)专利cn 107050068 a公开了一种灵芝提取物的提取方法及其应用，使用乙醇作为提取溶剂，再经筛网粗过滤，最后制得灵芝提取物。该方法制备的灵芝提取物同样存在大量微小不可溶性物质。(6)专利cn 107652371 a公开了一种鹿角灵芝提取物的制备方法，提及制备方法使用到的装置包括高压泵、热交换器、反应器、烧结过滤器、冷却器、烧结过滤器、最小压力阀、试管，该制备方法繁琐，对设备要求极高。此外，专利cn 113116758a公开了一种灵芝提取液的制备方法，中先把灵芝提取液放置2
‑
8℃20
‑
40天加入澄清剂，再过滤。该方法虽可获得澄清度较高的灵芝提取液，但整体制备过程需耗费大量时间。
4.鉴于上述现有灵芝提取物制备方法存在诸多缺点。因而，急需开发出一种可快速、规模化制备广泛用于各类普通食品、保健食品以及化妆品研究和开发的灵芝提取物。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种抗氧化修复灵芝提取物的制备方法。该制备方法简单，无需有机溶剂萃取等操作，适用于大规模生产灵芝提取物。从而为快速发展的食品、保健食品以及化妆品等行业提供活性高、应用广、多糖含量高的灵芝提取物。
6.本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的抗氧化修复灵芝提取物。
7.本发明目的通过以下技术方案实现：
8.一种抗氧化修复灵芝提取物的制备方法，包括如下制备步骤：
9.(1)热水动态提取：取粉碎后的灵芝子实体与纯水混合后加热搅拌提取，得到粗提液；
10.(2)粗滤分离：将步骤(1)所得粗提液静置，自然沉降，取上清液用筛网过滤，收集粗滤液；
11.(3)离心：将步骤(2)所得粗滤液使用蝶式离心机进行二次除杂，获得滤液；
12.(4)微滤：将步骤(3)所得滤液采用孔径为400～1200nm的微滤膜过滤，收集透过液；
13.(5)将步骤(4)中的透过液经浓缩，干燥，得到抗氧化修复灵芝提取物。
14.进一步地，步骤(1)中所述灵芝子实体与纯水混合的质量比为1:20～1:40。
15.进一步地，步骤(1)中所述加热搅拌提取的温度为60～95℃，搅拌速度为90～180rpm，提取时间为0.5～3h。进一步优选地，所述提取时间为2h。
16.进一步地，步骤(2)中所述筛网过滤的孔径为80～200目。
17.进一步地，步骤(2)中所述过滤后的残渣进一步采用步骤(1)和(2)的方法多次提取，合并粗滤液。
18.进一步地，步骤(4)中所述微滤膜的孔径优选为400～800nm。
19.进一步地，步骤(4)中微滤膜过滤后的残余截留液进一步用纯水稀释后重复过滤，合并透过液。
20.进一步地，步骤(5)中所述浓缩采用真空浓缩或反渗透进行浓缩，使浓缩液中固体含量为80～200g/l。更优选浓缩液中固体含量为120～160g/l。
21.进一步地，步骤(5)中所述干燥采用真空干燥或喷雾干燥。
22.进一步地，步骤(5)中所得抗氧化修复灵芝提取物中多糖质量百分含量为12～15％。
23.一种抗氧化修复灵芝提取物，通过上述方法制备得到。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.(1)本发明的制备方法采用热水动态浸提工艺，提高了活性物质提取率；提取过程无需引入有机溶剂，有效减少了有机溶剂污染以及后续除杂操作。
26.(2)本发明制备方法采用大孔径微滤膜对灵芝水提液进行精滤，即保证溶液澄清度，又能去除大粒径无活性物质，同时极大减少了微滤过程对多糖与蛋白等大分子活性物质的截留。
27.(3)本发明制备方法操作简单，成本低廉，适合大规模工业化生产。
附图说明
28.图1是实施例1中所得葡萄糖标准曲线图；
29.图2是实施例3所得赤芝提取物和实施例4所得白肉灵芝提取物的多糖含量测定结果图；
30.图3是实施例5中测试所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物对dpph自由基清除能力对比图；
31.图4是实施例6中测试所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物对abts自由基清除能力对比图；
32.图5是实施例7中测试所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物对酪氨酸酶活性抑制能力对比图。
具体实施方式
33.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
34.实施例1
35.本实施例为葡萄糖标准曲线的制作：
36.(1)准确称取分析纯葡萄糖50mg(105℃干燥至恒重)，用蒸馏水溶解定容至500ml，得到100μg/ml的葡萄糖标准溶液。
37.(2)分别吸取上述葡萄糖标准溶液0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml于6支比色管内，依次加入1.00ml、0.80ml、0.60ml、0.40ml、0.20ml、0.00ml纯水。
38.(3)往上述试管中均加入1.5ml 5％苯酚溶液和7.0ml浓硫酸，摇匀，反应半小时。待冷却后，于488nm下，使用分光光度计检测od
488
值。
39.(4)按浓度与吸光值的比绘制葡萄糖标准曲线，结果如图1所示。
40.实施例2
41.本实施例为灵芝提取物多糖含量测定方法：
42.(1)准确称取1g灵芝提取物溶于100ml蒸馏水中，制成1％(m/v)的灵芝提取物溶液。
43.(2)多糖醇沉：取10ml上述1％溶液，加入50ml无水乙醇，振荡均匀后沉淀过夜。
44.(3)将步骤(2)中的多糖醇沉液4000rpm离心15min，弃上清，取沉淀物，再加无水乙醇30ml，反复操作二次，沉淀物用蒸馏水溶解定容于200ml，制得多糖溶液。
45.(4)吸取1ml上述多糖溶液于20ml比色管，加苯酚1.5ml和浓硫酸7.0ml摇匀，反应半小时。待冷却后，于488nm下，使用分光光度计检测od
488
值。
46.(5)利用实施例1所得葡萄糖标准曲线计算灵芝提取物中总多糖含量。
47.实施例3
48.本实施例为一种抗氧化修复赤芝提取物的制备：
49.(1)取30公斤经粉碎后的赤芝子实体，按料液比等于1:30加入纯水，制成赤芝子实体悬液。将上述悬液加热至95℃，120rpm搅拌提取2小时，得到粗提液。
50.(2)将步骤(1)提取完成后的粗提液静置，自然沉降，待提取液冷却至50℃以下，抽取上清液；将上清液用200目筛网过滤，使之固液分离，收集赤芝粗滤液。
51.(3)将步骤(2)中的赤芝粗滤液使用蝶式离心机进行二次除杂，获得滤液。
52.(4)将步骤(3)所得滤液用800nm微滤膜过滤，收集透过液；再用25l纯水稀释截留液，重新过滤，合并透过液。
53.(5)随后将步骤(4)所得透过液用反渗透浓缩至固体物质含量约为120g/l的赤芝水提浓缩液，然后进行喷雾干燥，制得抗氧化修复赤芝提取物。
54.按实施例2的方法测定并计算本实施例所得赤芝提取物中多糖含量为15.01％。相应测定结果如图2所示。
55.实施例4
56.本实施例为一种抗氧化修复白肉灵芝提取物的制备：
57.(1)取30公斤经粉碎后的白肉灵芝子实体，按料液比等于1:25加入纯水，制成白肉灵芝子实体悬液。将上述悬液加热至95℃，90rpm搅拌提取2小时，得到粗提液。
58.(2)将步骤(1)提取完成后的粗提液静置，自然沉降，待提取液冷却至50℃以下，抽取上清液；将上清液用200目筛网过滤，使之固液分离，收集白肉灵芝粗滤液。
59.(3)将步骤(2)中的白肉灵芝粗滤液使用蝶式离心机进行二次除杂，获得滤液。
60.(4)将步骤(3)所得滤液用800nm微滤膜过滤，收集透过液；再用25l纯水稀释截留液，重新过滤，合并透过液。
61.(5)随后将步骤(4)所得透过液用真空浓缩至固体物质含量约为140g/l的白肉灵芝水提浓缩液，然后进行喷雾干燥，制得抗氧化修复白肉灵芝提取物。
62.按实施例2的方法测定并计算本实施例所得白肉灵芝提取物中多糖含量为14.12％。相应测定结果如图2所示。
63.实施例5
64.本实施例对所得灵芝提取物的dpph自由基清除活性进行检测：
65.(1)准确称取0.0197g dpph，用无水乙醇溶解并定容至250ml，即得0.2mmol/l dpph工作液。
66.(2)取一定量实施例3的赤芝提取物或实施例4的白肉灵芝提取物用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％和0.5％的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液。
67.(3)分别吸取50μl上述不同浓度的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔板中，再加入150μl dpph工作液，每组三个平行。室温避光反应1小时，反应完成后，用酶标仪测517nm吸光度值(od值)。
68.(4)所测的dpph清除率按以下公式计算：
[0069][0070]
式中d
对照
为不加赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液的dpph溶液的od值，d
空白
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与dpph溶液反应后的od值。
[0071]
测试结果如图3所示。由图3结果可见，本发明所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的dpph自由基清除能力，具有良好的抗氧化功效。
[0072]
实施例6
[0073]
本实施例对所得灵芝提取物的abts自由基清除活性进行检测：
[0074]
(1)配制200ml 0.2mol/l磷酸盐缓冲液(pbs，酸碱值7.4)。
[0075]
(2)取17.57mg过硫酸钾溶于蒸馏水中，定容至25ml，制成2.6mm过硫酸钾溶液。
[0076]
(3)取101.5mg abts溶于蒸馏水中，定容至25ml，制成7.4mm abts溶液。
[0077]
(4)分别吸取10ml过硫酸钾溶液和abts溶液，等体积混匀，避光，室温反应12
‑
16小时。
[0078]
(5)取一定量实施例3的赤芝提取物或实施例4的白肉灵芝提取物用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％、0.5％、1％和2％的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液。
[0079]
(6)将步骤(4)中反应好的溶液，用0.2mol/l磷酸盐缓冲液稀释15倍，制成abts工作液，待用。
[0080]
(7)分别吸取50μl步骤(5)中不同浓度的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔板中，再加入150μl abts工作液，每组三个平行。室温避光反应5分钟，用酶标仪测734nm吸光度值。
[0081]
(8)所测的abts清除率按以下公式计算：
[0082][0083]
式中d
对照
为不加赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液的abts工作液的od值，d
空白
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与abts溶液反应后的od值。
[0084]
测试结果如图4所示。由图4结果可见，本发明所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的abts自由基清除能力，具有良好的抗氧化功效。
[0085]
实施例7
[0086]
本实施例对所得灵芝提取物的酪氨酸酶抑制活性进行检测：
[0087]
(1)称取4.76mg酪氨酸酶溶于水定容至10ml，制成476μg/ml酪氨酸酶溶液，然后取1ml 476μg/ml酪氨酸酶溶液稀释至5ml配制成95.2μg/ml酪氨酸酶工作液。
[0088]
(2)取一定量实施例3的赤芝提取物或实施例4的白肉灵芝提取物用蒸馏水分别配置成浓度为0、0.1％、0.2％、0.5％、1％和2％的赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液。
[0089]
(3)称取9.88mg lopa溶于蒸馏水中定容至50ml，制成1mm lopa溶液。
[0090]
(4)分别取80μl赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液置于96孔酶标板中，再加入1mm dopa溶液120μl，最后加入50μl酪氨酸酶工作液，每组三个平行。37℃避光反应30分钟，用酶标仪测475nm吸光值od
475
。
[0091]
(5)所测的酪氨酸酶活性抑制率按以下公式计算：
[0092][0093]
式中d
对照
为不加赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液，只加dopa溶液和酪氨酸酶溶液的od值；d
空白
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液自身od值，d
样品
为赤芝提取物或白肉灵芝提取物溶液与dopa溶液和酪氨酸酶溶液混合反应后的od值。
[0094]
测试结果如图5所示。由图5结果可见，本发明所得赤芝提取物和白肉灵芝提取物均具有显著的酪氨酸酶抑制活性。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。