1.本发明涉及饮料制备领域，具体涉及一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用，属于功能饮料制备和应用领域。
背景技术：
[0002][0003]
我国银杏资源占世界的70%以上，是银杏叶的主产地。银杏叶提取物被广泛应用于保健食品、化妆品和药品等领域。银杏叶分离出最具代表性的功效组分银杏黄酮类与银杏内酯类，银杏黄酮类是一种天然自由基清除剂和血管扩张剂，银杏内酯类是目前天然药物中最强血小板活化因子拮抗剂。同时，银杏提取物还具有抗肿瘤生理活性，抗肿瘤靶点和通路较丰富，且通过各组分协同起到抗肿瘤作用，包括抗氧化性、抑制增殖、诱导分化凋亡、干预信号转导和抑制心血管生长等途径。由于银杏叶中银杏酸具有一定的毒性，即使炮制后银杏酸的含量仍较高，微生物发酵可能是有效解决的方法，因为微生物发酵不仅对银杏酸进行分解与转化，达到增效减毒的目的，还能增加黄酮和内酯等活性成分的含量。
[0004]
目前，国内使用银杏叶作为抗肿瘤材料的专利较多，如cn201810492749.0一种防癌中药药剂及其制备方法和应用、cn201910267160.5一种治疗肿瘤的中药组合物、cn201810522595.5一种蛹虫草银杏叶保健饮料及其制备方法、cn201610183374.0一种治疗肿瘤的中药及其制备方法、cn201611057537.7一种银杏叶虫草饮料及其制备方法等，上述专利均采用直接添加的方式，制备方法简单，未精细化提取出人体可吸收的有效成分，所以效果和安全性不一定具有保障。
技术实现要素：
[0005]
银杏叶中含有黄酮、类酯等活性成分，在心血管疾病、炎症、免疫力低下等疾病上有广泛使用，研究发现银杏叶提取物还具有抗肿瘤活性，通过益生菌发酵法提取的活性成分，不仅降低毒性成分银杏酸含量，还提升其抗肿瘤活性。
[0006]
本发明提供了一种益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法，使用模拟人体消化的方式，对银杏叶组合物先进行6-12个月的固态发酵，再进行3-5个月的液态发酵，利用益生菌去除银杏酸，分解银杏叶，最大化提取活性成分。
[0007]
本发明所述益生菌为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵的混合物。
[0008]
本发明所述银杏叶组合物配比如下：银杏叶占比70-90%，麦麸、海带和米糠的等比混合物占比10%-30%。
[0009]
本发明公开的益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法如下：（1）银杏叶组合物处理a．银杏叶经清洗后沥干水，45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分，再经120-150℃
炒制至微黄。经粉碎机粉碎，过80-100目。
[0010]
b．麦麸、海带和米糠清洗后沥干水， 45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1
×
10^4 cfu/g。
[0011]
（2）银杏叶组合物固态发酵a．按银杏叶占比70-90%，麦麸、海带和米糠的等比混合物占比10%-30%的比例，充分混合（1）中处理后的物料。
[0012]
b．取长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌的菌粉或菌液，每种菌粉按照1g/kg或每种菌液按照10ml/kg的比例加入（2）a混合物料中，再加入物料等质量的水，混合均匀后，转移到无菌不锈钢罐中，在30-37℃恒温房间内，密封发酵6-12个月。
[0013]
c. 固态发酵从第6个月开始，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测ph，待ph值达到5以下时，结束固态发酵。
[0014]
（3）银杏叶组合物液态发酵a.发酵结束后的（2）a转移到发酵罐内，按照每公斤物料添加50-100倍无菌水，30-40℃、50-100r/min搅拌24h-48h，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24-48h后从底部排出沉淀，保留上清部分。
[0015]
b. 对（3）a所得物进行间歇通气发酵。先持续5天向罐内通入无菌空气，再沉淀2天，从底部排出沉淀残渣，保留上清。
[0016]
c. 连续重复进行（3）b操作，直至发酵液透明度≥15cm，则结束（3）b的操作。
[0017]
d. 完成（3）c操作，经超高温瞬时杀菌设备，130℃-150℃处理2-8s，迅速冷却至常温，再经0.45-1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，得到一款澄清饮料。
[0018]
所述（1）a中银杏叶采摘自银杏树主干。
[0019]
所述（1）a中银杏叶，较优的处理工艺如下：48℃热风干燥60min，去掉80-85%的水分，再经140℃炒制5min至微黄，收集、保藏在干燥阴凉处。
[0020]
所述（2）a中银杏叶、麦麸、海带和米糠的优选比例为7:1:1:1。
[0021]
所述（2）b的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌菌液，优选制备方法如下：乳酸菌使用mrs培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种；酵母菌使用ypd培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种。
[0022]
所述（2）b固态发酵，优选发酵温度为36℃，优选发酵时间为9个月。
[0023]
所述（2）c固态发酵终点，优选ph为4.5时。
[0024]
所述（3）a，初步液体萃取中优选每公斤物料添加100倍无菌水，优选保温37℃，优选搅拌50r/min，优选萃取时间为48h。
[0025]
所述（3）a中，初步液体萃取中优选的沉淀时间为24h。
[0026]
所述（3）c中，优选重复（3）b次数为5次，优选的发酵液透明度为20cm。
[0027]
所述（3）d中，优选的超高温瞬时杀菌条件如下：140℃处理4s，迅速冷却到30℃以下。
[0028]
所述（3）d中，优选陶瓷膜过滤系统孔径为1μm。
[0029]
本发明的益生菌发酵银杏叶组合物在癌症细胞模型中具有显著抑制癌症的效果。
[0030]
本发明具有以下优点：1、该益生菌发酵银杏叶组合物食用安全，无任何毒副作用。
[0031]
2、该益生菌发酵银杏叶组合物饮料具有口感清淡、能量低的优点。
[0032]
3、该益生菌发酵银杏叶组合物具有抑制癌症细胞的能力，具有一定抗癌效果。
具体实施方式
[0033]
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0034]
实施例1：一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备（1）银杏叶组合物处理a. 银杏叶采收后，去除不完整叶，清洗后沥干水， 45℃热风干燥，去掉85%的水分。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
[0035]
b. 米糠过筛去除杂物，清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
[0036]
c. 海带经清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
[0037]
d．麦麸过筛去除杂物，清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
[0038]
（2）菌种液活化长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌使用mrs培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种；马克思克鲁维酵母菌使用ypd培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种。所得菌种等比混合，作为发酵菌种液。
[0039]
（3）银杏叶组合物固态发酵a. 步骤（1）所得银杏叶粉、米糠粉、海带粉和麦麸粉，以7:1:1:1的比例进行混合，取样和混合过程在d级洁净区内进行。
[0040]
b.将菌种液按照1g/kg的比例加入（3）a所得的混合物料粉中，混合均匀，再加入等质量的水，混合均匀后，转移物料到无菌不锈钢罐中，在30℃恒温房间内，进行固态发酵。
[0041]
c. 固态发酵6个月内，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测ph，待ph值降到4.5，结束固态发酵。
[0042]
（4）银杏叶组合物液态发酵a. 经（3）c固态发酵结束的物料，转移到无菌液体发酵罐内进行初步液体萃取。每公斤物料添加100倍无菌水， 37℃、80r/min搅拌48h进行，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24后从底部排出，保留上清部分。
[0043]
b. 对（4）a所得上清通气发酵。先向罐内通入400 l/min无菌空气，持续5天，促进益生菌进一步消耗液体内大分子营养物，再沉淀2天，后从底部排出沉淀残渣，保留上清。
[0044]
c. 连续重复进行（4）b操作，直至发酵液透明度达到20cm，则结束（4）b的操作。
[0045]
d. 完成（4）c操作，产品经超高温瞬时杀菌，130℃处理4s，迅速冷却至常温，再经1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，单瓶包装规格为50ml。
[0046]
实验例1：本发明益生菌发酵银杏叶组合物的经口急毒试验1.1 样品益生菌发酵银杏叶组合物，液体，500 ml，批号20201108，由实施例1制备。
[0047]
1.2 实验动物健康成年spf级icr小鼠20只，雌雄各半，由南京医科大学医药实验动物中心提供，生产许可证号scxk（苏）2016-0002，合格证编号：nyd-l-2021040803。实验动物在温度为20～26℃、相对湿度为40%～70%的本中心屏障系统中饲养，实验动物使用许可证号：syxk（苏）2020-0006。实验鼠维持饲料（co60辐照）由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证（2019）01008。
[0048]
1.3急毒试验情况采用限量法，设定剂量为10000 mg/kg
•
bw，每组10只动物，雌雄各半。动物检疫3d，试验时雌性体重为18.8～20.9g，雄性体重为19.6～21.8g，试验前动物禁食4h，自由饮水。样品比重1.06，以原液按10 ml/kg
•
bw，1次灌胃给样，实际剂量为10600 mg/kg
•
bw。全部动物连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。
[0049]
灌胃给予icr小鼠10600 mg/kg
•
bw的菌菇饮料。雌、雄性动物14d试验观察期间，饮食和活动正常，生长良好，未见中毒表现及异常体征，无动物死亡（见表1）。所以，菌菇饮料的雌、雄性小鼠急性经口毒性试验ld50均为大于10600 mg/kg
•
bw，属实际无毒。
[0050]
表1 益生菌发酵银杏叶组合物的小鼠急性经口毒性试验结果实验例2：本发明益生菌发酵银杏叶组合物的对鼠源h22细胞移植瘤的抑制效果1.1 受试品样品：益生菌发酵银杏叶组合物（mfg），液体500 ml，批号为20201108，由实施例1制备。
[0051]
阳性对照药：华蟾素，陕西东泰制药有限公司，批号为 8d0100170。
[0052]
1.2 细胞株鼠源 h22 肝癌细胞株，购自上海博谷生物科技有限公司1.3 试剂盒mouse interleukin 18,il-18 elisa kit，96t，购自武汉华美。
[0053]
mouse interleukin 6,il-6 elisa kit，96t，购自武汉华美。
[0054]
mouse tumor necrosis factor-α,tnf-α elisa kit，96t，购自武汉华美。
[0055]
1.4 实验动物清洁级级 icr 小鼠，雄性，6
〜
8 周龄，24
±
2g，100 只，动物设施许可证编号：scxk-（苏）2020-0007。实验动物饲养于苏中生物制药有限公司动物实验室，小鼠置于屏障系统。随机分组，每笼5只。饲以专为小鼠配制的全价颗粒饲料；自由进食饮水。实验室内饲养温度保持在温度 22
±
4℃，相对湿度保持在45
±
5%，12h光照昼夜交替，动物实验符合扬州大学动物伦理委员会要求。
[0056]
1.5 小鼠分组和建模清洁级 icr 小鼠按体重随机分组，每组10只。对照组（n）不造模，灌胃纯净水；造瘤小鼠适应性饲养3天，按1
×
10^7 接种 h22 细胞，取体外扩增后生长良好的h22肝癌细胞接种于icr小鼠腹腔内，建立h22肝癌腹水瘤模型。建模成功后，鼠源 h22 细胞移植瘤小鼠随机分为模型组（m），实验组a，实验组b和阳性组，每组10只。n组和m组均灌胃258mg/kg生理盐水；实验组a给予30mg/kg mfg和228mg/kg生理盐水，编码a-mfg；实验组b给予30mg/kg mfg和228mg/kg华蟾素，编码b-mfg；阳性组给予30mg/kg 生理盐水和228mg/kg华蟾素，编码hcs。待m组小鼠肿瘤体积大于1000mm3 后，每周记录小鼠体重、进食量，干预六周后取血、处死小鼠，检测瘤组织指标。
[0057]
1.6 各组小鼠在干预后的体重变化在第六周，现对于n组，m组体重有显著上升（p《0.05），b-mfg组有显著下降（p《0.05），a-mfg组合hcs组则没有显著区别。在第六周，现对于m组，b-mfg组体重有显著下降。
[0058]
表2 各组小鼠在干预后的体重变化注：与对照组比较：#p《0.05；与模型组比较:*p《0.051.7 各组小鼠在干预后的摄食量变化实验期间平均每只小鼠的饲料摄入无明显差异，mfg 对移植瘤小鼠摄食量无不良影响。m组后期摄食量呈下降趋势与瘤组织压迫食道影响进食有关。
[0059]
表3 各组小鼠在干预后的摄食量变化(g/天)1.8 mfg对移植瘤的抑制率与m组比较， a-mfg组单独用mfg干预小鼠，肿瘤抑制率为22.3%；阳性对照hcs组的肿瘤抑制率为30.7%；联合使用mfg和hcs，b-mfg组的肿瘤抑制率为46.8%。所以，mfg单独具
有一定抑制肿瘤效果，并能辅助hcs抑制肿瘤效果。
[0060]
表4 mfg对移植瘤的抑制率注：与模型组比较：*p《0.05，**p《0.01。